枯草芽孢桿菌KC1723 的鑒定及生物學特征研究

薛德星，李美，孫作文，李紀順，扈進冬，高興祥，李健

(1. 山東省農業科學院植物保護研究所，山東濟南 250100；2. 山東省農業技術推廣中心植物保護部，山東濟南 250100；3. 齊魯工業大學(山東省科學院)生態研究所，山東濟南 250103)

鏈格孢屬(Alternaria)和炭疽菌屬(Colletotrichum)病原真菌種類繁多，地理分布廣泛，可侵害各種農作物，對全球農業生產造成嚴重威脅[1]。鏈格孢屬病原菌感染南瓜、甜瓜、西葫蘆、黃瓜等瓜類植物引起葉斑病[1-2]。 蕓薹鏈格孢(Alternar-ia brassicae)是全球性植物病原菌，具有很強的環境適應性，能夠快速引起十字花科蔬菜黑斑病，給農業生產造成巨大的經濟損失[3-4]。 近年來，草莓炭疽病危害日趨嚴重，其致死率一般在10%～20%，嚴重可達80%以上，對我國草莓產業造成巨大危害[5]。 化學藥劑可以很好地防治病菌感染，但長期大量使用化學藥劑會導致病原菌產生抗藥性，造成環境污染，且農藥殘留影響人類身體健康[6]。 生物防治是利用微生物之間的拮抗、競爭等方式阻礙病原微生物繁殖，改善土壤理化性質，促進植物生長，提高植物抗病性[7-8]，具有安全、有效和持久的特點，可以更好地防治植物病蟲害[9]。

應用于植物病害的生防細菌、真菌、放線菌等多種菌劑相繼被開發，并取得了良好的生防效果[10]。 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種常見的產芽孢桿狀細菌，廣泛存在于土壤和植物表面，對人畜無毒無害，不污染環境，具有很強的抗逆能力[11-12]，能產生多種抗菌素和抗菌酶，對植物病原菌具有廣譜抗性，已成為重要的生防菌之一[13-14]。 目前，枯草芽孢桿菌已經應用在小麥、玉米、大豆、花生、番茄、辣椒、蘋果等多種作物上，并取得理想的生防效果[14-15]。 本研究從土壤中分離篩選到一株芽孢桿菌KC1723，經形態學、生理生化特征分析和16S rDNA 基因鑒定，確定為枯草芽孢桿菌，并通過抑菌試驗研究其對炭疽菌、鏈格孢菌的抑菌效果，以期為其生防制劑的開發應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料來源

菌株KC1723:分離自濟南地區土壤樣本。

供試病原菌:暹羅炭疽菌(Colletotrichum siamense)、平頭炭疽菌(C. truncatum)、鏈格孢菌(Alternaria burnsii)，均為山東省農作物病蟲害生物防治工程技術研究中心分離保存。

1.2 主要儀器和試劑

紫外透射反射分析儀，上海驥輝科學分析儀器有限公司；PCR 儀，北京宏達恒業科技有限公司；電熱恒溫水槽，浙江恒岳儀器有限公司；紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；高速離心機，山東德瑞克儀器股份有限公司。 細菌基因組DNA 快速抽提試劑盒，上海生工生物工程技術服務有限公司；其他常用試劑為國產分析純試劑。

1.3 培養基

細菌基礎培養基(LB 培養基)，每升去離子水中加入酵母提取物5 g、胰化蛋白胨10 g、氯化鈉10 g，用NaOH 調pH 至7.0，121 ℃下高壓滅菌20 min。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌株的分離篩選 稱取5 g 土壤樣品，加入裝有45 mL 無菌水的三角瓶中，充分振蕩混勻，85 ℃水浴20 min，制成土壤懸液。 吸取1 mL 上層液，加入裝有9 mL 無菌水的試管中，10 倍梯度稀釋至10-2、10-3和10-4；分別吸取0.5 mL，均勻涂布在LB 培養基平板上，倒置于30 ℃恒溫培養箱培養1～2 d。

1.4.2 菌株鑒定 形態特征觀察:挑取生長優勢菌落接種到LB 培養基平板上，30 ℃倒置培養1～2 d，觀察菌落生長情況，同時進行革蘭氏染色，利用光學顯微鏡觀察菌株的形態特征。

生理生化特性分析:挑取單菌落培養5 d 后進行鑒定試驗，包括葡萄糖發酵試驗、蔗糖發酵試驗、乳糖發酵試驗、淀粉水解試驗、明膠水解試驗、VP 試驗、檸檬酸鹽試驗、過氧化物酶試驗、硝酸鹽還原試驗、耐鹽性試驗[15]。

分子生物學鑒定[16]:采用細菌DNA 提取試劑盒提取菌株基因組DNA。 基于16S rDNA 基因設計上、下游引物，分別為27F (5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)。 PCR 反應體系(50 μL):模板DNA 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，2×LA Taq MasterMix 25 μL，ddH2O 19 μL。PCR 反應條件:95 ℃10 min；95 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃2 min，35 個循環；72 ℃10 min 。 PCR 產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4.3 芽孢桿菌生理生物學特征研究 pH 值對菌株生長的影響:將LB 培養基的pH 值分別調為4、5、6、7、8、9 和10，121℃滅菌20 min 后，按照1∶20體積比接種活化的菌液，30 ℃恒溫培養，每小時測菌株生長變化情況。

熱處理對菌株活性的影響:挑取芽孢桿菌單菌落接入LB 液體培養基中，180 r/min、30 ℃恒溫振蕩培養18 h。 芽孢桿菌樣品分別在25、40、55、70、85、100 ℃水浴中處理20 min，采用10 倍梯度稀釋法依次稀釋，進行平板菌落計數。

菌株的抑菌作用:采用平板對峙培養法，以暹羅炭疽菌、平頭炭疽菌和鏈格孢菌為靶標菌，測定菌株的抑菌能力。 每組設3 個重復，記錄病原菌菌落直徑，計算抑菌率[17]。 抑菌率(%) ＝ (對照平均直徑-處理平均直徑)/對照平均直徑×100。

1.5 數據處理與統計分析

試驗所得數據均使用SPSS 17.0 軟件進行方差分析，多重比較采用Duncan’s 法(P＜0.05)。 將16S rDNA 基因測序結果與NCBI 數據庫中的已知序列進行比對，利用MEGA 7.0 軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌KC1723 形態特征

經分離篩選，從濟南地區土壤中得到一株芽孢桿菌，定名為KC1723。 在LB 培養基上30 ℃恒溫培養36 h，菌落邊緣呈不規則齒形，表面突起有皺紋，菌落顏色為白色(圖1A)。 在顯微鏡下，菌株KC1723 呈桿狀，產生橢圓形芽孢，芽孢位于細胞中部附近。 革蘭氏染色為陽性(圖1B)

圖1 菌株KC1723 菌落形態(A)及染色情況(B)

2.2 芽孢桿菌KC1723 的生理生化特征

對菌株KC1723 進行葡萄糖發酵試驗、蔗糖發酵試驗、乳糖發酵試驗、淀粉水解試驗、明膠水解試驗、VP 試驗、硝酸鹽還原試驗、過氧化物酶試驗、檸檬酸鹽試驗、耐鹽試驗共10 項常規生化試驗，結果表明，菌株KC1723 生理生化反應與枯草芽孢桿菌相同(表1)。

表1 菌株KC1723 的生理生化特征

2.3 芽孢桿菌KC1723 16S rDNA 基因序列分析

擴增的菌株KC1723 16S rDNA 片段長度為1 466 bp，系統進化樹顯示菌株KC1723 與枯草芽孢桿菌聚為一支，同源性為99.39%(圖2)。

圖2 菌株KC1723 的系統發育樹

通過上述形態特征、生理生化特征及16S rDNA 基因序列分析，將菌株KC1723 鑒定為枯草芽孢桿菌。 保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(編號CGMCC No. 24397)。

2.4 不同pH 值和培養基對菌株KC1723 生長的影響

菌株KC1723 生長的適宜pH 值在6.0 ～8.0之間，最適pH 為7.0。 隨培養基pH 值升高或降低，菌落生長速度明顯減慢(圖3)。

圖3 不同pH 值對菌株KC1723 生長的影響

2.5 溫度對菌株KC1723 的影響

由圖4 可知，40 ℃處理20 min 后，細胞數量為1.07×109cfu/mL，隨著溫度提高，細胞數量逐漸降低。 100 ℃時仍有398 cfu/mL 細胞存活，表明菌株可以很好地耐高溫。

圖4 不同溫度對菌株KC1723 的影響

2.6 菌株KC1723 的抑菌作用

平板對峙試驗表明，KC1723 對供試3 種病原菌都有較好的抑菌作用，抑菌率分別為68.3%、66.7%、48.9%，其中對暹羅炭疽菌抑菌效果最好(表2)。

表2 菌株KC1723 對3 種病原菌的拮抗效果

3 討論與結論

通過細菌形態特征、革蘭氏染色鏡檢結果以及生理生化鑒定，菌株KC1723 與枯草芽孢桿菌的形態及生化特征極為相似；測序及系統進化樹結果進一步確定菌株KC1723 為枯草芽孢桿菌。KC1723 生長適宜pH 值為6.0～8.0，最適pH 值為7.0；在10% NaCl 培養液中可以生長；100 ℃處理20 min 仍有 KC1723 菌株存活。 表明菌株KC1723 具有很強的環境適應能力，能夠在惡劣的生態環境下存活并繁殖，有利于生防菌開發。

利用微生物防治植物病害具有重要的研究價值和應用前景。 篩選和鑒定有生防潛力的微生物極為關鍵[9]。 前人研究表明，利用枯草芽孢桿菌防治植物病害具有巨大研究價值和應用潛力[18]。經枯草芽孢桿菌處理后，尖孢鐮刀菌古巴專化型、灰葡萄孢、茄病鐮刀菌、大麗輪枝菌、麥根腐平臍蠕孢、尖孢鐮刀菌的菌絲生長受到顯著抑制，PDA培養基上均形成明顯的抑菌圈[7]。 本試驗通過平板對峙培養法發現菌株KC1723 對暹羅炭疽菌、平頭炭疽菌和鏈格孢菌有較好的抑菌效果，特別對暹羅炭疽菌抑菌率達到68.3%，表明菌株KC1723 對由暹羅炭疽菌、平頭炭疽菌和鏈格孢菌引起的花生炭疽病、大白菜炭疽病和辣椒灰葉斑病具有很好的生防潛力。

本試驗分離、篩選并鑒定了一株枯草芽孢桿菌KC1723，并對其培養條件和抑菌效果進行了研究。 為了更好地應用生防菌KC1723，下一步將提取其抗菌活性產物，解析抑菌機理以及開展田間防效研究和評估。