響應面法優化六妹羊肚菌原生質體的制備條件

李豐碩，冀寶營，韓冰，孫立梅，王洪奇，柴林山，池景良

(遼寧省微生物科學研究院，遼寧朝陽 122000)

羊肚菌[Morchella esculenta(L.)Pers]屬于真菌界子囊菌門(Ascomycota)盤菌綱(Pezizomycetes)盤菌目(Pezizales)羊肚菌科(Morchellaceae)羊肚菌屬(Morchella)，是羊肚菌屬的模式種[1]。羊肚菌菌絲易老化，可形成“假菌核”以適應不良的環境條件[2]。 其風味獨特，子實體富含維生素、蛋白質、類固醇、礦物質、多糖和多核苷酸等物質，是兼備藥用價值和經濟效益的食用菌[3]。 自2000 年四川省林業科學院首次研發外營養添加技術至2015 年技術逐步成熟，我國羊肚菌產業進入了快速發展時期，最近5 年羊肚菌的人工商業化栽培發展十分迅速，栽培區域從最初的四川、云南等地擴展到遼寧、河北等20 余省(市、自治區)[4-5]。

近年來，借力短視頻，“羊肚菌熱”在全國興起，羊肚菌栽培面積連年增加，產業發展勢頭強勁，但“不確定性”一直是羊肚菌栽培種植過程中的突出問題。 據統計，約70%種植戶的盈利能力較差，平均每公頃新鮮羊肚菌產量不足1 500 kg。對于有經驗、有可靠種源的農戶來說，栽培產量可能會高些，小規模種植時偶爾會超過6 000 kg/hm2，但好收成很難重復實現，不確定性的關鍵是缺乏可靠的育種技術[6]。 同時，羊肚菌作為子囊菌，與擔子菌相比，菌種容易老化和退化，因而保證羊肚菌的菌種質量穩定性和培育高品質的可栽培菌株是其生產成功的關鍵因素，這就對羊肚菌育種工作提出許多新的要求[7]。 原生質體技術具有試驗周期短、易于操作、可進行單核體的快速分離等特點，可以在種內、種間、屬間和異種間進行融合操作，不僅在高等植物領域應用廣泛，在野生菌種馴化、品種改良與選育等方面也取得長足發展。 原生質體技術的有效應用離不開高效的原生質體分離和再生，因此，優化其制備條件是獲得優質原生質體的基礎[8]。

原生質體的制備受多種因素的交互影響，如酶解時間、酶解溫度、酶質量分數以及穩滲劑種類和濃度等，響應面法可以對多個因素的組合效應進行研究，從而找到最優的試驗條件[9]。 孫佳星等[10]利用響應面法對香菇原生質體制備條件進行優化得出，在酶解液濃度1.7%、30.49 ℃條件下酶解3.25 h，原生質體產量為14.02×106CFU/mL；婁海偉等[11]發現在2.06%溶壁酶、26.1 ℃條件下酶解2.57 h，蛹蟲草單核芽生孢子原生質體得率可達(9.17±0.29)×106個/mL。 目前還未見到基于響應面法優化羊肚菌原生質體制備條件的相關報道，制備條件間的相互作用效應也不清晰。 因而本研究結合單因素試驗結果，應用響應面法進一步對羊肚菌原生質體制備條件進行優化，以期獲得高產、優質的原生質體，為后續羊肚菌交配型分析、同核體分離及融合等工作的開展提供優良的試驗材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株與試劑 六妹羊肚菌菌株(Morchella sextelataZP-01)，由遼寧省微生物科學研究院食用菌栽培研究室分離保存。 溶壁酶(廣東省微生物菌種保藏中心)和纖維素酶、蝸牛酶(上海源葉生物科技有限公司)，均為生物技術級。 甘露醇、蔗糖等化學制劑為國產分析純。

1.1.2 主要溶液及培養基 PDA 培養基:去皮馬鈴薯200 g(煮沸30 min，取汁，下同)，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1 000 mL；PDB 培養基:去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1 000 mL；再生培養基:去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，胰蛋白胨1 g，酵母浸粉1 g，甘露醇109.3 g(0.6 mol/L)，瓊脂10 g，蒸餾水定容至1 000 mL。 穩滲劑:稱取10.93 g 甘露醇、3.51 g NaCl、7.2 g MgSO4、20.54 g 蔗糖分別溶解于100 mL 無菌水中。 以上培養基以及穩滲劑均于1×105Pa 下滅菌20 min。

酶解液:質量分數2%的溶壁酶、蝸牛酶和纖維素酶液，經0.22 μm 無菌濾膜過濾，現配現用。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌絲體培養 將PDA 培養基上培養的菌絲連帶培養基切成2～3 mm 小塊，接種5 ～6 塊至PDB 培養基，置于20 ℃黑暗條件靜置培養1 d，再于20 ℃、150 r/min 下培養3 d，用于羊肚菌原生質體的制備。

1.2.2 原生質體的制備及再生 將PDB 液體培養基中培養的新鮮幼菌絲分別用無菌蒸餾水和0.6 mol/L 甘露醇洗滌3 次，然后用無菌濾紙吸干水分。 稱取菌絲200 ～300 mg 置于2 mL 離心管中，加入3 倍體積的酶解液約1.5 mL，振蕩混勻，置于恒溫金屬浴中酶解，每30 min 振蕩一次，保證酶解液與菌絲充分接觸，得到酶解后的原生質體粗提取液；將粗提液用頂端含1 cm 滅菌脫脂棉柱的注射器過濾純化，濾液經3 000 r/min 離心5 min，棄上清液，再經穩滲劑洗滌2 次，獲得純化后的原生質體，立即將沉淀重新懸浮于穩滲劑中，400 倍顯微鏡下用血球計數板計數，即為原生質體產量。

用穩滲劑將原生質體稀釋至105個/mL。 吸取100 μL 原生質體懸浮液均勻涂布至裝有再生培養基的90 mm 培養皿中，20 ℃黑暗培養，一般3 d 能夠看到原生質體再生的菌落。 再生率為再生的原生質體數量占涂布原生質體數量的比值。為排除可能存在菌絲碎片的影響，以PDA 培養基為對照計算原生質體再生率，公式為:原生質體再生率(%)＝(再生培養基萌發菌落數-對照PDA培養基萌發菌落數)/涂布原生質體數×100[12-13]。

1.2.3 單因素試驗設計 在預試驗的基礎上，以原生質體產量為評價指標，選取酶解時間(1、2、3、4、5 h)、酶解溫度(20、25、30、35、40 ℃)、酶質量分數(1%、2%、3%、4%)、穩滲劑種類(NaCl、MgSO4、甘露醇、蔗糖，均為0.6 mol/L)進行單因素試驗，重復3 次。

1.2.4 響應面試驗設計 在單因素試驗基礎上，選取酶解時間(A)、酶質量分數(B)、酶解溫度(C)為自變量，原生質體產量(Y)為響應值，根據單因素試驗結果確定自變量的變化區間，經Box-Behnken 設計17 次試驗。 試驗設計因素及水平見表1。

表1 響應面法因素和水平設計

1.3 數據統計與分析

采用Microsoft Office 2021 統計數據，SPSS 26.0 對數據進行相關性及顯著性差異分析，Design-Expert 13.0 設計響應面試驗方案并對結果進行分析，Origin 2021 制圖。

2 結果與分析

2.1 羊肚菌原生質體制備的單因素試驗結果

2.1.1 不同酶解時間條件下原生質體產量及再生率 在酶質量分數2%、甘露醇作穩滲劑、酶解溫度30 ℃條件下，分別進行1、2、3、4、5 h 酶解試驗。 由圖1 可知，羊肚菌原生質體產量和再生率先隨時間的延長而升高，均在酶解3 h 達到最高值，分別為3.96×105個/mL 和1.2%。 再生率對酶解時間的響應更為迅速，酶解3 h 與4 h 差異顯著，原生質體產量差異不顯著；超過4 h，產量與再生率均快速降低。 選擇2 ～4 h 為酶解時間較為適宜。

圖1 不同酶解時間條件下原生質體產量及再生率

2.1.2 不同酶質量分數條件下原生質體產量及再生率 由于羊肚菌菌絲壁不能被完全酶解，前人的相關研究多采用組合酶，故本研究采用以溶壁酶、蝸牛酶、纖維素酶的組合酶系作為水解酶。分別選取質量分數1%、2%、3%、4%的組合酶進行酶解試驗，結果如圖2 所示。 在酶解溫度30 ℃、甘露醇作穩滲劑、酶解時間3 h 的條件下，2%和3%質量分數的組合酶作用下的原生質體產量差異不顯著，但再生率在2%時達到最大值；當酶質量分數超過3%時，再生率和原生質體產量顯著降低。 選取1%～3%酶質量分數為適宜酶解液濃度。

圖2 不同酶質量分數條件下原生質體產量及再生率

2.1.3 不同酶解溫度條件下原生質體產量及再生率 如圖3 所示，在甘露醇作穩滲劑、2%組合酶液、酶解3 h 條件下，當酶解溫度30 ℃時，原生質體產量和再生率均達到最大值，分別為4.67×105個/mL 和1.44%，酶解溫度20 ℃與25 ℃再生率差異不顯著，30 ℃與35 ℃原生質體產量差異不顯著。 40 ℃時由于酶活性的變化，原生質體產量和再生率均顯著下降，因此選擇適宜酶解溫度范圍為25～35 ℃。

圖3 不同酶解溫度條件下原生質體產量及再生率

2.1.4 不同穩滲劑條件下原生質體產量及再生率 以30 ℃、2%組合酶液酶解3 h 為基本條件，不同種類穩滲劑中原生質體產量和再生率結果如圖4。 用甘露醇作為穩滲劑的原生質體產量最高，蔗糖作為穩滲劑再生率最高，但兩者再生率差異不顯著。 故選用甘露醇為羊肚菌原生質體制備的穩滲劑。

圖4 不同穩滲劑條件下原生質體產量及再生率

2.2 羊肚菌原生質體制備的響應面優化試驗結果

2.2.1 響應面優化設計試驗結果 在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken 設計17 組試驗，結果如表2。 采用Design-Expert 13.0 軟件對試驗結果進行分析，如表3 所示。 該模型的F 值為39.11，P＜0.0001，失擬項P值為0.685、不顯著，故該模型高度顯著；決定系數R2＝0.9805，校正決定系數Adjusted R2＝0.9554，說明擬合度較好，誤差小，模型有效可靠，可充分體現自變量與羊肚菌原生質體產量間的相互關系，可做預測應用。 A、B、C、BC、A2、B2、C2均達極顯著水平，AC 達顯著水平，即酶解時間、酶質量分數、酶解溫度及酶質量分數與酶解溫度間的交互作用對羊肚菌原生質體的制備有極顯著影響，酶解時間與酶解溫度的交互作用有顯著影響。

表2 響應面試驗設計與結果

表3 回歸方程的方差分析

為預測最優點，以酶解時間(A)、酶質量分數(B)、酶解溫度(C)為自變量，原生質體產量(Y)為因變量，剔除不顯著項，得到最終擬合方程:

Y ＝-59.86575＋9.69225A＋5.15275B＋2.8694C-0.0685AC-0.0935BC-1.2235A2-0.5985B2-0.04024C2。

對各因子的顯著性和F 值分析可知，制備條件對原生質體產量的影響程度:酶解時間＞酶質量分數＞酶解溫度。

2.2.2 響應面交互作用分析 為了更好地評價三因素之間的交互作用效果，建立了三維響應曲面和二維等高線圖，如圖5 至圖7 所示。 圖5A、B顯示，在固定酶解溫度30 ℃條件下，酶解時間從2 h延長至4 h，酶質量分數由1%增加到3%，原生質體產量均呈現先增大后減小的趨勢，等高線近似圓形，結合P值為0.3151＞0.05，說明兩者的交互作用不顯著；圖6A、B 顯示了固定酶質量分數2%條件下，酶解時間從2 h 延長至4 h，酶解溫度由25 ℃升至35 ℃，原生質體產量均呈現先增大后減小的趨勢，等高線橢圓但接近圓形，結合P值為0.021＜0.05，說明兩者存在較弱的交互作用；圖7A、B 顯示，固定酶解時間3 h 條件下，酶質量分數與酶解溫度交互作用的曲面最陡，從等高線圖可看出，兩者交互作用極顯著(P＜0.01)。 三組交互作用對原生質體產量的影響表現為BC＞AC＞AB，其中AB 之間的交互作用不顯著。

圖5 酶解時間與酶質量分數交互作用的響應面圖(A)與等高線圖(B)

圖6 酶解時間與酶解溫度的交互作用響應面圖(A)與等高線圖(B)

圖7 酶質量分數與酶解溫度交互作用的響應面圖(A)與等高線圖(B)

2.2.3 最適條件和回歸模型的驗證 基于上述回歸方程，預測六妹羊肚菌原生質體最適制備條件，如圖8 所示，在酶解時間3.23 h、酶質量分數2.28%、酶解溫度30.26 ℃條件下，產量可達5.07×105個/mL。 考慮試驗的可操作性，驗證試驗選取條件為酶解時間3.2 h、酶質量分數2.3%、酶解溫度30 ℃，穩滲劑選擇0.6 mol/L 的甘露醇，重復3次，原生質體產量達到(5.13±0.13)×105個/mL，與預測結果的差異不顯著，說明響應面法用于羊肚菌原生質體制備條件優化可行。

圖8 六妹羊肚菌原生質體最適制備條件

2.3 羊肚菌原生質體的顯微觀察

在上述最優條件下制備羊肚菌原生質體，將純化后的原生質體稀釋至105個/mL，在1 000 倍油鏡的明場顯微鏡下觀察，共觀察到67 個原生質體，直徑大小分布如圖9 所示，個體大小以2 ～7 μm 居多；10 μm 以下的原生質體形態如圖10，可供后期融合等操作參考。

圖9 原生質體直徑分布

圖10 1 000 倍油鏡下原生質體形態

3 討論

羊肚菌菌絲壁不能被完全酶解，部分細胞壁困住了原生質體，使其難以全部釋放出來，本研究也觀察到類似現象。 無論是真菌還是高等植物，在進行原生質體分離時，組合酶相比單一酶能更加有效地溶解細胞壁中的纖維素、角質等物質，因而在預試驗期間，選用單一溶壁酶、溶壁酶＋蝸牛酶、溶壁酶＋蝸牛酶＋纖維素酶三種形式的酶系進行原生質體制備試驗，結果發現溶壁酶＋蝸牛酶＋纖維素酶的組合酶效果最佳，同時要選用針對食用菌菌絲壁有強破壁效果的溶壁酶，否則效果會大打折扣[14-17]。

本研究綜合單因素試驗、響應面優化試驗，探究各影響因素對六妹羊肚菌原生質體制備的影響，結果表明，酶解時間對羊肚菌原生質體產量影響最大。 這可能與羊肚菌菌絲細胞壁中有大量S-葡聚糖有關，需要更長的酶解時間以破壞菌絲壁，釋放原生質體；隨著酶質量分數增加，原生質體產量和再生率呈現先增加后降低的趨勢，并且在超過3%后急劇下降，這可能是因為細胞膜的完整性和原生質體的生理活性受到酶的影響，濃度過高的酶液對原生質體膜產生了毒性作用[18-20]。 適當的酶解溫度同樣非常重要，可以提高酶活性，但過高的酶解溫度會導致酶失活，本研究也驗證了此現象，即在酶解溫度40 ℃時原生質體產量下降明顯，并且酶解溫度與酶質量分數交互作用顯著，因此，試驗過程要保證酶解溫度充分可控，偏差不超過±1 ℃。

由于不同物種的細胞壁組成不同，因此不同物種細胞對滲透壓的選擇是不同的[21]。 本研究選擇0.6 mol/L 甘露醇作為穩滲劑制備原生質體的效果最佳，這與王珂[22]制備羊肚菌原生質體穩滲劑的選擇結果相一致；但與陳芳草等[13]以0.3 mol/L KCl 和0.3 mol/L 環己六醇配合使用再生率高的結果不一致。 分析其原因，可能與所用菌株的特性相關，本研究使用的六妹羊肚菌子實體中等至稍大，菌蓋呈圓錐形，成熟期菌蓋為褐色至黑褐色，子實體長8 ～15 cm，為商品化栽培菌種。本研究原生質體再生率最高的穩滲劑為0.6 mol/L蔗糖溶液，這與崔宗強等[15]的研究結果一致，考慮兼顧原生質體產量，本研究最終選擇0.6 mol/L甘露醇為原生質體制備和再生過程中的穩滲劑。但本研究中羊肚菌原生質體產量和再生率均偏低，遠低于香菇、蛹蟲草、玉木耳等，還需進一步研究探索。

4 結論

本研究經響應面法優化獲得羊肚菌原生質體制備的最佳條件:酶解時間3.2 h、酶質量分數2.3%、酶解溫度30 ℃、穩滲劑0.6 mol/L 甘露醇，在此條件下原生質體產量可達(5.13±0.13)×105個/mL；酶解條件對原生質體得率的影響程度為:酶解時間＞酶質量分數＞酶解溫度。 本研究結果可為后續羊肚菌原生質體融合、單核自交、雜交等優良菌種的選育提供技術支撐。