當歸多糖促進5-氟尿嘧啶作用后小鼠應激性紅細胞發生

王碧瑤,肖含先之,牛依琳,孫念慈,汪子鈴,王亞平,王 璐

(重慶醫科大學基礎醫學院1.干細胞與組織工程研究室、2.組織學與胚胎學教研室,重慶 400016)

化療后貧血是臨床上常見的癥狀,尤其在癌癥患者中,貧血會導致幾乎每個器官的廣泛癥狀,其嚴重程度取決于貧血程度、發病速度和伴有的合并癥[1]。常用治療手段如輸血和注射重組促紅細胞生成素可導致鐵過載、高血壓、血液黏稠度升高、靜脈血栓等副作用[2-3]。因此,探尋化療后貧血的相關機制及科學有效的治療方案是亟待解決的問題。

當歸多糖(angelica sinensis polysaccharides,ASP)作為當歸的有效成分,可促進正常紅系發生,課題組既往研究表明ASP也可促進化療藥物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)致傷小鼠的骨髓造血[4]。文獻報道,小鼠應激性紅細胞發生與幼紅細胞島的形成以及島中央巨噬細胞的造血調控功能密切相關,應激性紅細胞發生的部位主要在髓外器官脾臟[5]。本研究采用5-FU建立小鼠化療后貧血模型,著重探討ASP對5-FU致損傷小鼠貧血的恢復作用,以及在應激性紅細胞發生過程中ASP調控幼紅細胞島中央巨噬細胞的機制,旨在為尋找治療化療后貧血的天然藥物提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級6-8周齡C57BL/6J小鼠,雌雄各半,體質量(20～22) g,由重慶市醫學實驗動物中心提供,合格證號為SCXK (渝) 2012-0001,實驗均符合動物實驗倫理標準。

1.2 主要藥品與試劑ASP購自陜西慈緣生物技術有限公司(批號為CYC81105,甘肅岷縣當歸提取,純度≥98%,溶于生理鹽水);5-FU購自美國Sigma公司(批號為F6627-1G,純度≥98%,溶于生理鹽水);胎牛血清購自中國依科賽生物公司;RPMI 1640培養基(11875-093)購自美國Gibco公司;含EPO的BFU-E無血清甲基纖維素半固體培養基(M3436)購自加拿大Stem Cell Technologies公司;SYBR green I(RR420L)和逆轉錄試劑盒(RR047A)均購自日本TaKaRa生物技術有限公司;合成引物來自于上海生工生物股份有限公司;流式F4/80抗體(123107)購自美國Biolegend公司。

1.3 儀器與設備超凈工作臺購自中國蘇凈公司,病理切片機購自德國Leica公司,光學顯微鏡購自日本OLYMPUS公司,全自動生化分析儀購自中國邁瑞公司,qRT-PCR儀購自美國Bio-Rad公司,流式分析儀購自美國BD公司。

1.4 方法

1.4.1小鼠模型建立與分組處理 SPF級6-8周齡C57BL/6J小鼠20只,隨機分為對照組、ASP組、5-FU組、ASP+5-FU組。參考文獻[6-7],按照課題組常規方式給藥[8]。對照組:小鼠連續腹腔注射生理鹽水(10 mL·kg-1) 10 d;ASP組:小鼠連續腹腔注射ASP(100 mg·kg-1) 10 d;5-FU組:小鼠腹腔注射5-FU (150 mg·kg-1),6 h后連續腹腔注射生理鹽水 (10 mL·kg-1) 10 d;ASP+5-FU組:小鼠腹腔注射5-FU(150 mg· kg-1),6 h后連續腹腔注射ASP (100 mg· kg-1) 10 d。每天記錄各組小鼠狀態和體質量變化。

1.4.2小鼠外周血常規檢測 取小鼠眼眶血500 μL于EDTA抗凝管中,上下顛倒混勻后使用全自動血細胞計數儀進行外周血血液學檢測。

1.4.3骨髓單個核細胞計數 以頸椎脫臼法處死各組小鼠,浸泡于75%酒精中,持續5 min。無菌條件下取出股骨和脛骨,剔除多余脂肪及肌肉組織;預冷RPMI 1640培養基沖出全骨髓,1 500 r·min-1離心5 min。棄上清,紅細胞裂解液4 ℃孵育5 min,裂解紅細胞。1 500 r·min-1離心5 min,棄上清液,RPMI 1640培養基重懸細胞,緩慢加入細胞懸液至裝有6 mL淋巴細胞分離液的離心管上層,2 000 r·min-1離心20 min,吸取中間白膜層細胞懸液,與同體積RPMI 1640培養基混勻后1 500 r·min-1離心5 min,棄上清液,得到骨髓單個核細胞,臺盼藍計數活細胞。

1.4.4脾指數計算和脾細胞計數 以“1.4.3”方法處理小鼠。無菌條件下取出脾臟,小心去除附著在表面的肌肉和結締組織。稱脾臟質量,脾指數以脾臟質量(g)/小鼠體質量(g)代表。相機拍照記錄脾臟大小及形態。加入RPMI 1640培養基,注射器活塞研磨脾臟組織,200目篩網過濾。過濾液1 500 r·min-1離心5 min,棄上清液,收集脾細胞,臺盼藍計數活細胞。

1.4.5脾臟組織切片病理學觀察 4%多聚甲醛固定脾臟48 h,清水沖洗6 h。全自動脫水儀過夜脫水,石蠟包埋機包埋,制備5 μm脾組織石蠟切片,65 ℃恒溫烤箱烘烤2 h后冷卻至室溫備用。將脾臟石蠟切片置于二甲苯中,60 ℃恒溫烤箱脫蠟2 h;將切片依次放入梯度乙醇溶液各2 min,PBS溶液水化2 min;蘇木精染色5 min,流水沖洗,1%鹽酸乙醇中分色1～3 s,蒸餾水洗凈;伊紅染液中染色5 min,蒸餾水清洗,依次放入梯度乙醇溶液,二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脫水透明2 min,中性樹膠封片。顯微鏡下觀察并拍照,ImageJ軟件計算脾紅髓面積百分比。

1.4.6爆氏紅系集落形成單位培養觀察及計數 分離獲取脾臟單個核細胞:5 mL紅細胞裂解液,4 ℃裂解“1.4.4”獲取的脾細胞,時間5 min,1 500 r·min-1離心5 min,棄上清;3 mL RPMI-1640培養基溶解細胞,緩慢置于6 mL淋巴細胞分離液上層,2 000 r·min-1離心20 min;轉動吸取中間的白膜層,在白膜層中加入相同體積的RPMI-1640培養基,充分混勻,1 500 r·min-1離心5 min,調整細胞濃度為(1.5～5)×106L-1;每組吸取0.1 mL細胞懸液與1 mL BFU-E培養基混勻,接種于35 mm培養皿中,培養10～14 d后于顯微鏡下觀察,BFU-E為50個細胞以上的集落,計數BFU-E數量。

1.4.7流式細胞術檢測F4/80+脾巨噬細胞數量 紅細胞裂解液裂解1.4.4獲取的脾細胞后,調整細胞濃度為106L-1。5% BSA 4 ℃封閉細胞30 min,1 500 r·min-1離心5 min,棄封閉液,按抗體說明書標注使用量加入抗體F4/80(FITC),4 ℃避光孵育30 min。PBS緩沖液洗滌3次后200 μL PBS重懸細胞,流式細胞儀檢測脾臟F4/80+細胞。

1.4.8qRT-PCR檢測巨噬細胞黏附、鐵轉運、核吞功能 用TRIzol試劑(1 mL·100 g-1)提取脾臟總RNA,按照逆轉錄試劑盒說明制備cDNA,SYBR II染料法進行熒光定量PCR反應。采用2-ΔΔCT方法定量計算巨噬細胞內巨噬細胞-紅系祖細胞間黏附分子基因Emp;鐵轉運基因Hmox-1、Trf、Fpn、TrfR;巨噬細胞核吞基因Tim4、MerTK相對表達量。β-actin作為標準化基因。合成引物來自于上海生工股份有限公司,引物序列見Tab 1。

2 結果

2.1 ASP改善5-FU致傷小鼠貧血建模小鼠d 10外周血紅細胞數量、血紅蛋白含量和紅細胞壓積結果顯示:與對照組相比,5-FU組和ASP+5-FU組紅細胞數量、血紅蛋白含量和紅細胞壓積均明顯性降低,但ASP+5-FU組紅細胞數量、血紅蛋白含量和紅細胞壓積的降幅低于5-FU組(Fig 1A-C)。結果提示:一次性大劑量注射5-FU可致小鼠貧血,ASP可明顯提升5-FU作用后外周血紅細胞數量及血紅蛋白含量,減輕貧血。

2.2 ASP促進5-FU致傷小鼠脾臟應激性紅細胞發生觀察各組小鼠全身情況,稱體質量,結果顯示:與對照組和ASP組相比,5-FU組和ASP+5-FU組小鼠體質量明顯下降,其中ASP 對5-FU導致的體質量下降有部分改善作用,8 d后兩組小鼠體質量逐漸回升,但10 d仍低于對照組(Fig 2A)。小鼠股骨骨髓單個核細胞(bone marrow mononuclear cells,BMMNCs)計數,結果表明,與對照組相比,5-FU組BMMNCs數量明顯下降;與5-FU組相比,ASP+5-FU組BMMNCs明顯回升,但仍低于對照組(Fig 2B)。小鼠脾臟稱質量及組織學形態結果顯示,對照組與ASP組脾臟為長橢圓形,呈紅褐色,外表光滑,紅髓和白髓分界清晰,結構完整;5-FU組脾臟體積較大,脾指數明顯性升高,紅髓區域面積增大;ASP+5-FU組脾臟體積較5-FU組更大,且外表顏色加深,表面有突起結節,脾指數進一步升高,紅髓面積進一步增大(Fig 2C-G)。綜合以上結果提示,5-FU抑制骨髓造血導致小鼠貧血,在5-FU作用后10 d,脾臟可代償性進行髓外應激性紅細胞發生,而ASP可明顯促進應激性紅細胞發生。爆氏紅系形成單位(burst forming unit-erythroid, BFU-E)是正常的早期紅系祖細胞,也是應激性紅系祖細胞,可反映貧血等應激條件下紅細胞代償能力。脾臟單個核細胞BFU-E集落計數結果表明,與對照組相比,5-FU組BFU-E數量明顯降低,與5-FU組相比,ASP+5-FU組的集落數量明顯回升(Fig 2H, I)。結果提示,5-FU可損傷早期紅系祖細胞,而ASP可保護早期紅系祖細胞,進而增強應激性紅系祖細胞的增殖分化能力。

Fig 1 Anemia in 5-FU-induced mice improved

2.3 ASP拮抗5-FU對F4/80+脾臟巨噬細胞的損傷F4/80是脾臟幼紅細胞島中央巨噬細胞表面標志物。流式細胞術結果表明:與對照組比較,5-FU組F4/80+脾巨噬細胞數量明顯減少;與5-FU組比較,ASP+5-FU組F4/80+脾巨噬細胞數量明顯回升(Fig 3A,B)。結果提示,ASP可通過保護F4/80+脾巨噬細胞,促進應激性紅細胞發生。

2.4 ASP拮抗5-FU促進脾巨噬細胞與幼紅細胞間黏附巨噬細胞和幼紅細胞之間的黏附分子有利于幼紅細胞島形成和紅細胞發育。qRT-PCR結果顯示,與對照組相比,5-FU組Emp基因表達下降;與5-FU組相比,ASP+5-FU組的Emp基因表達量明顯上升(Fig 4)。結果提示,ASP可明顯增強5-FU致貧血小鼠脾巨噬細胞與幼紅細胞之間的黏附,進而促進應激性紅細胞島形成,促進幼紅細胞發育成熟。

Fig 2 Extramedullary hematopoiesis in spleen of mice

Fig 3 F4/80+ macrophages in spleen detected by flow cytometry n=5)

Fig 4 Analysis of adhesion molecules Emp gene expressionin mouse spleen macrophages and n=9)

2.5 ASP拮抗5-FU促進巨噬細胞向紅細胞轉運鐵紅細胞發生過程中,幼紅細胞島中央巨噬細胞將分解衰老紅細胞血紅素產生的鐵,通過周圍幼紅細胞膜上轉鐵蛋白受體(transferrin receptor, TrfR)轉運至幼紅細胞,參與其胞內血紅蛋白的合成。TrfR也即CD71,是從紅細胞集落形成單位(colony forming unit-erythrocyte,CFU-E)到網織紅細胞的紅系表面標志物。qRT-PCR結果顯示:與對照組相比,5-FU組和ASP+5-FU組Hmox-1、Trf、Fpn基因表達均明顯性升高,其中5-FU組升高更明顯(Fig 5A-C),結果可能與5-FU急性損傷紅細胞,導致巨噬細胞吞噬紅細胞,降解血紅素產生鐵增多,胞內鐵轉運活動相對增強有關;但值得注意的是,ASP+5-FU組TrfR的表達量較對照組和5-FU組明顯大幅度升高(Fig 5D)。結果提示,ASP可有效促進巨噬細胞向紅細胞轉運鐵,促進應激性紅細胞發生。

2.6 ASP拮抗5-FU促進脾巨噬細胞內吞紅細胞核紅細胞發生過程中,幼紅細胞島中央巨噬細胞吞噬降解晚幼紅細胞排出的細胞核,去核紅細胞發育為網織紅細胞。qRT-PCR結果表明:與對照組相比,5-FU組Tim4和MerTK基因表達量升高;而ASP+5-FU組Tim4和MerTK基因表達量較5-FU組都明顯性增高,且高于對照組(Fig 6A,B)。結果提示,ASP在小鼠貧血后可明顯增強脾巨噬細胞吞噬并降解紅細胞核的功能,促進晚幼紅細胞去核向網織紅細胞成熟分化。

3 討論

貧血是化療的副反應之一,輸血和注射重組促紅細胞生成素是化療后貧血常見的治療手段[1],但長期輸血會引起機體鐵過載而影響臟器功能[2];長期注射促紅細胞生成素會造成高血壓、血液粘稠度升高,易引起靜脈血栓[3]。因此,尋找一種毒副作用小的天然藥物并探討其作用機制將為臨床化療后貧血的治療提供理論和實驗依據。

“氣血學說”是祖國傳統醫學的理論基礎。《本草綱目》中形容當歸味甘而重,故專能補血,其氣輕而辛,故又能行血,補中有動,行中有補,為血中之要藥。ASP作為當歸的有效成分,對機體的造血系統有明顯的促進作用[4]。文獻報道,ASP能增加小鼠骨髓爆氏紅系集落形成單位(burst forming unit-erythroctye, BFU-E)及紅細胞集落形成單位(colony forming unit-erythrocyte, CFU-E)數量,提升外周血紅細胞數量及血紅蛋白含量,促進骨髓移植小鼠功能重建[10];ASP可促進腎臟和肝臟產生 EPO[11],還可促進體外培養巨噬細胞分泌EPO樣活性物質[12]。5-FU作為化療藥物,廣泛應用于結腸癌、直腸癌、乳腺癌等腫瘤治療[13]。實驗證明,5-FU可以抑制骨髓造血,導致紅系、粒系、血小板全面下降。課題組既往研究表明,ASP可以拮抗5-FU,促進骨髓造血及外周血象的恢復。應激性紅細胞發生是指通過不同于正常紅細胞發生的應激紅系祖細胞的快速增殖分化,迅速恢復貧血的過程[14]。幼紅細胞島(eythroblastic island, EBI)對于這個過程的調控起著不可或缺的關鍵作用,小鼠應激性紅細胞發生的主要部位是脾臟[5]。而ASP能否通過調控巨噬細胞促進應激性紅細胞發生目前尚不清楚。本研究以5-FU建立小鼠化療后貧血模型,初步探討ASP對小鼠脾臟應激性紅細胞發生的影響,以及ASP對幼紅細胞島巨噬細胞的功能影響。

Fig 5 Iron transport gene of mouse spleen macrophages detected by n=9)

Fig 6 Nuclear endocytosis gene of mouse spleen macrophages detected by n=9)

小鼠一次性大劑量腹腔注射5-FU,成功建立化療后小鼠貧血模型。5-FU組小鼠外周血紅細胞數量、血紅蛋白含量、紅細胞壓積均明顯性降低,骨髓單個核細胞數減少,而連續注射ASP 10 d后,ASP+5-FU組紅細胞數量、血紅蛋白含量、紅細胞壓積和骨髓單個核細胞數均回升,提示ASP可以改善5-FU所致的化療后貧血。本實驗結果表明,與5-FU組相比,ASP+5-FU組的小鼠脾臟腫大,紅髓占比明顯增多,提示ASP可促進脾臟代償性髓外造血。應激性紅細胞發生(stress erythropoiesis)起始于應激性紅系祖細胞,經歷BFU-E、CFU-E階段,在EBI中央巨噬細胞作用下依次發育為前成紅細胞(proerythroblasts)、早幼紅細胞(basophilic normoblast)、中幼紅細胞(polychromatophilic normoblast)、晚幼紅細胞(orthochromatic normoblast)。晚幼紅細胞去核后形成網織紅細胞(reticulocytes),網織紅細胞除去核糖體后形成成熟紅細胞[15]。實驗結果進一步證明,ASP可以減輕5-FU對小鼠脾臟BFU-E的損傷,促進化療后BFU-E增殖分化。

在紅細胞發育過程中,EBI中央巨噬細胞通過黏附分子與幼紅細胞接觸,將血紅蛋白合成需要的鐵離子轉運至紅細胞,吞噬晚幼紅細胞排出的細胞核,促進晚幼紅細胞成熟分化為網織紅細胞,對紅細胞分化和成熟起著重要調控作用[5, 16]。本實驗首先證實,ASP可以拮抗5-FU對脾臟巨噬細胞的損傷,增加脾臟巨噬細胞的數量。既往研究表明,發育中的幼紅細胞和EBI中央巨噬細胞上均高表達黏附分子紅細胞巨噬細胞蛋白(EMP),EMP對于紅細胞分化起著重要調控作用,EMP的缺失會破壞幼紅細胞島結構,導致紅系細胞分化延滯[16-17]。本實驗證實,ASP可促進Emp基因表達。鐵代謝在應激性紅細胞發生中尤為重要,血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HMOX-1)分解損傷紅細胞血紅素產生的鐵,是鐵重復利用最重要的來源[18]。除此之外,巨噬細胞還可通過多種受體攝入不同來源的鐵。巨噬細胞通過轉鐵蛋白受體(transferrin receptor, TRFR)吸收轉鐵蛋白(transferrin, TRF)結合的Fe3+;非轉鐵蛋白鐵可直接通過二價金屬轉運蛋白1(DMT-1)獲得;CD91 (LRP1)受體清除血凝素結合血紅素(Hpx -Heme)的鐵;觸珠蛋白-血紅蛋白(Hp-Hgb)復合體通過CD163受體被吸收。鐵轉運蛋白(ferroportin, FPN)是巨噬細胞將Fe3+轉運出胞外的唯一蛋白,在跨膜轉運時氧化Fe2+成Fe3+。TRF是巨噬細胞胞外Fe3+的主要轉運蛋白,與幼紅細胞膜上高表達的TRFR結合,這是紅細胞血紅蛋白血紅素的主要鐵來源[16]。本實驗結果還表明,5-FU組Hmox-1、Trf、Fpn基因表達均明顯升高,這可能與5-FU急性損傷紅細胞導致血紅素降解產生鐵增多,鐵轉運活動增強有關;但值得注意的是,ASP+5-FU組TrfR基因表達明顯增強,提示ASP可以促進巨噬細胞向紅細胞轉運Fe3+,促進應激性紅細胞發生。有報道稱,幼紅細胞擠出的細胞核由巨噬細胞膜上的T細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域蛋白4(Tim4)和原癌基因酪氨酸激酶(MerTK)識別磷脂酰絲氨酸位點進入巨噬細胞內降解[16]。本實驗進一步驗證,ASP+5-FU組Tim4和MerTK基因表達較5-FU組明顯性增高,提示ASP可促進脾臟EBI中央巨噬細胞吞噬并降解紅細胞核,促進晚幼紅細胞去核向網織紅細胞分化。

綜上所述,本研究證實5-FU可減少EBI中央巨噬細胞數量并引起巨噬細胞功能受損;而ASP可以促進小鼠脾臟應激性紅細胞發生,更快恢復化療導致的貧血,其機制與增加EBI中央巨噬細胞數量,增強巨噬細胞與幼紅細胞間的黏附,改善巨噬細胞鐵轉運和核內吞功能有關。但ASP調控EBI中央巨噬細胞的靶點以及與應激性紅系祖細胞增殖分化調控機制的關聯尚不清楚,本課題組將在后續工作中進一步深入研究。