利拉魯肽對高糖環境下牙周膜成纖維細胞凋亡的影響

崔麗娟，劉海霞，劉潔瑩，李桂平

（廣州醫科大學附屬惠州醫院內分泌科，廣東 惠州 516002）

牙周病是一種常見的口腔疾病，主要因牙菌斑內細菌及代謝產物破壞牙周支持組織，導致牙齦炎癥或出血、牙齒松動的病癥，嚴重者可引起牙齒移位或脫落。牙周膜成纖維細胞（PDLF）是牙周組織中一種重要的多能細胞，通過不斷生長分化形成新的纖維和牙骨質，參與牙周組織的修復過程，對維持牙周膜完整性具有至關重要的作用[1]。有多項研究顯示，高血糖會刺激PDLF 產生炎癥因子，促進細胞凋亡，加劇牙周組織的破壞，進而誘發牙周疾病[2-3]。糖尿病合并牙周疾病患者，當血糖狀況得到有效控制后，配合牙周局部基礎治療，牙周病變會明顯好轉，但在實際臨床上，部分患者血糖控制不佳，牙周基礎治療無法順利開展，因此，研究高糖環境下牙周損傷的修復具有重要意義。利拉魯肽屬于胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）類似物，主要用于二甲雙胍或磺脲類藥物控制不佳的糖尿病患者的治療。有報道稱，利拉魯肽能夠降低血糖、減輕炎癥反應、改善心血管功能[4]，但其對糖尿病合并牙周疾病的影響報道較少。基于此，本研究通過體外培養人牙周膜成纖維細胞，觀察利拉魯肽對高糖環境下細胞凋亡及炎癥因子的影響，探討利拉魯肽對糖尿病合并牙周疾病的保護機制，為糖尿病合并牙周疾病的治療提供依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料利拉魯肽注射液（丹麥諾和諾德公司，國藥準字J20160037，規格：3 mL∶18 mg）， DMEM培養基（美國Gibco 公司），胎牛血清（美國Gibco 公司），胰酶（美國Sigma 公司），碘化丙啶（PI）染液（美國BD 公司），Matrigel 膠（美國BD 公司），磷酸鹽（PBS）溶液（武漢賽維爾生物科技有限公司），流式細胞儀（美國BD 公司，型號：FACSCanto），二氧化碳（CO2）培養箱（深圳市瑞沃德公司，型號：CIB-191C），臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器有限公司，型號：L 500），倒置熒光顯微鏡（廣州微域光學儀器有限公司，型號：WSF-1600）。

1.2 原代細胞培養牙周膜組織標本來源于口腔科，選取2019 年12 月廣州醫科大學附屬惠州醫院接受正畸治療需拔出的前磨牙的5 名志愿者。納入標準：①年齡≥ 18歲；②牙周健康，無齲齒、牙體缺損或牙髓疾病；③無基礎病史，近3 個月內未服用過激素或影響血糖的藥物；④對研究知情并簽署知情同意書。患牙拔出后用含有雙抗的PBS 緩沖液反復沖洗，在無菌條件下銳性刮取牙根中部1/3 處牙周膜組織。將獲取的牙周膜組織標本用含慶大霉素PBS 液反復沖洗，然后剪成1 mm3大小的組織塊鋪于細胞培養皿中，加入含有10%胎牛血清、200 U/mL 慶大霉素、100 U/mL 青霉素的DMEM 培養液3 mL，置于CO2孵箱中37 ℃下培養，每3 d 換液1 次，待細胞生長至80%時，加入胰蛋白酶消化并傳代培養。取第4 代細胞做細胞爬片，通過二氨基聯苯胺（DAB）染色觀察細胞形態學結構，鑒定細胞。

1.3 細胞分組取第5 代牙周膜成纖維細胞進行實驗觀察，以2×103個/孔的細胞密度進行接種。根據培養液成分分組：低糖對照組（含5.5 mmol/L 葡萄糖的DMEM培養基）、高糖組（含25 mmol/L 葡萄糖的DMEM 培養基）、低糖給藥組（1×10-7mmol/L 的利拉魯肽+ 含5.5 mmol/L 葡萄糖的DMEM 培養基）和高糖給藥組（1×10-7mmol/L 的利拉魯肽+ 含25 mmol/L 葡萄糖的DMEM 培養基）。

1.4 流式細胞儀檢測取1.3 中各組培養72 h 的牙周膜成纖維細胞，采用胰蛋白酶消化，PBS 漂洗2 遍，離心棄上清。加入100 μL 標記溶液重懸細胞，避光孵育15 min，離心收集細胞，PBS 洗滌1 次。加入AnnexinV 和PI 在37 ℃下避光染色15 min，然后上機檢測細胞凋亡率。

1.5 Westerrn-blot 檢測取1.3 中各組培養72 h 的牙周膜成纖維細胞，提取全蛋白，按照BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。上樣50 mg 蛋白進行電泳分離，然后轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，再加入B 細胞淋巴瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bax）抗體，4 ℃孵育過夜，TBST 漂洗3 次，加入羊抗兔二抗，常溫孵育2 h，TBST 漂洗3 次，然后在Tanon 600 圖像分析系統中顯色分析。

1.6 酶聯免疫吸附法檢測細胞炎癥因子收集1.3 中各組培養24、48、72 h 時的細胞上清液，取500 μL 置于潔凈EP管中。采用酶聯免疫吸附法測定細胞上清液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、C-反應蛋白（CRP）水平。

1.7 統計學方法采用SPSS 21.0 統計學軟件分析數據，計量資料經S-W 法檢驗證實符合正態分布，以(±s)表示，多組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人牙周膜成纖維細胞形態與鑒定培養8～10 d 后，人牙周膜成纖維細胞脫離組織塊向外延伸，細胞呈星形或長梭形，交織成為網狀；隨著培養時間延長，細胞以組織塊為中心放射狀生長，約3 周后，細胞長滿培養皿內壁，密度明顯增加，長梭形細胞比例升高，少數呈不規則星形。免疫組化檢測可見波形蛋白染色陽性，細胞角蛋白染色陰性，說明該細胞來源于中胚層間充質細胞，與實驗要求一致，見圖1。

圖1 相差顯微鏡下人牙周膜成纖維細胞形態學觀察（×200）

2.2 細胞凋亡率低糖對照組、低糖給藥組、高糖對照組和高糖給藥組細胞凋亡率分別為（4.97±0.15） %、（3.07±0.12） %、（11.33±1.10） %、（5.87±0.49） %。與低糖對照組比，高糖對照組細胞凋亡率顯著升高；且低、高糖給藥組凋亡率顯著低于低、高糖對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖2。

圖2 各組PDLF 凋亡率

2.3 各組PDLF 中Bax、Bcl-2 蛋白表達情況低糖對照組的Bax 蛋白相對表達量低于高糖對照組，Bcl-2 蛋白相對表達量高于高糖對照組；低、高糖給藥組PDLF 中Bax 蛋白相對表達量分別低于低、高糖對照組，且低糖給藥組均低于高糖給藥組；Bcl-2 蛋白相對表達量分別高于低、高糖對照組，且低糖給藥組均高于高糖給藥組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖3、表1。

表1 各組PDLF 中Bax、Bcl-2 蛋白表達情況(±s)

表1 各組PDLF 中Bax、Bcl-2 蛋白表達情況(±s)

注：與低糖對照組比，*P＜0.05；與低糖給藥組比，#P＜0.05；與高糖對照組比，△P＜0.05。Bax：B 細胞淋巴瘤-2 基因相關X 蛋白；Bcl-2：B 細胞淋巴瘤-2 基因。

組別 Bax 蛋白相對表達量 Bcl-2 蛋白相對表達量低糖對照組 0.560±0.015 0.452±0.025低糖給藥組 0.451±0.019* 0.857±0.013*高糖對照組 1.050±0.021* 0.312±0.018*高糖給藥組 0.834±0.029*#△ 0.594±0.023*#△

圖3 各組PDLF 中Bax、Bcl-2 蛋白相對表達量表達情況比較

2.4 各組細胞培養液中炎癥因子表達低糖對照組細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP 水平低于高糖對照組；低、高糖給藥組細胞中炎癥因子水平分別低于低、高糖對照組，且低糖給藥組低于高糖給藥組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 各組細胞培養液中TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP 水平比較(pg/mL，±s)

表2 各組細胞培養液中TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP 水平比較(pg/mL，±s)

注：與低糖對照組比，*P＜0.05；與低糖給藥組比，#P＜0.05；與高糖對照組比，△P＜0.05。TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-1β：白細胞介素-1β；IL-6：白細胞介素-6；CRP：C-反應蛋白。

組別 TNF-α IL-1β IL-6 CRP低糖對照組 179.88±14.62 63.86±12.83 97.10±21.98 53.97±5.64低糖給藥組 114.33±17.01* 50.26±11.09* 83.09±8.53* 51.39±3.13*高糖對照組 387.74±66.73* 162.53±13.31* 237.73±23.46* 110.37±13.71*高糖給藥組 235.96±28.14*#△ 80.58±8.25*#△ 116.74±12.49*#△ 59.39±5.75*#△

3 討論

PDLF 是一種牙周組織中最具代表性的細胞，能夠促進膠原纖維、胞外基質的合成，參與牙周組織的病變、修復及再生過程。糖尿病性牙周病變的發病機制復雜，本研究從PDLF 凋亡角度出發，分析不同環境下PDLF 的生理學活性，為糖尿病合并牙周病變的預防和治療提供理論依據。本研究結果顯示，與低糖對照組比，高糖對照組PDLF凋亡率顯著升高，提示高糖環境促進細胞的凋亡，從而促進牙周疾病的發生及發展。究其原因，在高糖環境下，細胞會產生過多的細胞內活性氧，能夠誘導脂質過氧化，引發細胞膜完整性喪失，線粒體膜去極化，凋亡信號通路激活，最終導致細胞凋亡。

Bcl-2 基因是目前已知的與細胞凋亡存在密切關系的重要基因，Bax 與Bcl-2 蛋白共同參與細胞凋亡的調節過程。Bcl-2 是一種原癌基因，能在不影響細胞增殖的前提下延長細胞凋亡時間，發揮抗細胞凋亡的作用。Bax 則屬于促凋亡因子，通過抑制Bcl-2 活性，促進細胞的凋亡。Bcl-2/Bax 比值與細胞凋亡速率有關，其比值升高說明細胞凋亡減弱，而Bcl-2/Bax 比值下降則表示細胞凋亡增強[5]。本研究中，高糖對照組細胞培養48 h 后Bax 蛋白相對表達量高于低糖對照組，Bcl-2 蛋白相對表達量低于低糖對照組，說明高糖環境下PDLF 凋亡速度更快；而高糖給藥組細胞Bax 蛋白相對表達量低于低糖對照組，Bcl-2 蛋白相對表達量高于高糖對照組，提示利拉魯肽能調節Bcl-2/Bax的表達，抑制PDLF 凋亡，促進牙周疾病的恢復。究其原因，利拉魯肽屬于胰高血糖素樣肽類似物，通過與組織/細胞上胰高血糖素樣肽受體結合，刺激胰島素的分泌，降低血糖水平；另外，高糖環境下細胞活力、活性氧活性均降低，而利拉魯肽能夠降低高糖誘導的腎小管上皮細胞的凋亡，促進細胞活力，濃度越高，作用效果越明顯[6]。

糖尿病與牙周疾病屬于雙相促進關系，且均以炎癥反應為橋梁[7]。糖尿病患者機體處于亞臨床炎癥狀態，TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP 等炎癥因子表達升高，導致牙周組織出現炎癥反應，加快牙槽骨及周圍軟組織病變，限制牙周組織的修復，逐漸發展成為牙周疾病[8]；另外，牙周疾病也會介導局部炎癥反應，炎癥因子可通過血液循環到達遠隔部位，激發全身性炎癥反應，影響胰島細胞功能，造成代謝紊亂，從而加重糖尿病病情[9]。有研究表明，糖尿病合并牙周疾病患者牙周組織中IL-1β、IL-6 等炎癥介質釋放顯著增加[10]，因此抑制炎癥反應對糖尿病及牙周疾病的治療至關重要。本研究中，高糖對照組細胞培養液中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP水平均顯著高于低糖對照組，證實高糖環境能誘導牙周細胞發生炎癥反應，從而促進牙周疾患的發生及發展。另外，本研究發現，高糖給藥組細胞培養液中TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP 水平均低于高糖對照組，說明利拉魯肽能降低糖尿病牙周微環境的炎癥反應，抑制炎癥因子的釋放，減輕局部炎癥對牙周組織的破壞。分析原因可能為，利拉魯肽的干預能夠明顯抑制高糖所誘導的炎癥單核細胞亞群分化，且可減少炎癥單核細胞內活性氧的生成，從而抑制炎癥反應[11]。

綜上，利拉魯肽能通過降低炎癥反應和調節Bcl-2/Bax的表達，抑制高糖環境下PDLF 凋亡，促進牙周健康，為糖尿病合并牙周疾病的治療提供理論依據，這可能是一種潛在的延緩糖尿病患者并發牙周疾病的防治策略。