17種精油對褶皺臂尾輪蟲的殺滅效果試驗

岳治光，趙聰，溫俊奇，孫小帥，許新春，劉喜恒

（1.河南安進生物工程有限公司，河南 駐馬店 463800；2．上蔡縣農業綜合行政執法大隊，河南 駐馬店 463800）

輪蟲（Rotifer），屬水生多細胞原生動物，富含幼苗必需的氨基酸和不飽和脂肪酸，是魚、蝦、蟹類苗期的天然餌料。但輪蟲大量繁殖并攝食藻類，會導致水體達不到“肥、活、嫩、爽”的養殖標準，其代謝產生大量有機物，引起水中氨氮、亞硝酸鹽氮升高；輪蟲大量死亡后分解，滋生的細菌和真菌會污染水體，其泛濫極易發生翻塘事件，在我國黃河流域的精養塘危害比較嚴重[1]，部分魚塘因此荒廢。目前水產養殖中主要使用化學藥品防治輪蟲，但藥品往往具有廣譜性，對微藻和其他水生生物亦會產生毒性，不適于浮游動物污染控制[2-4]。植物成分的殺蟲劑，具有低毒、低殘留、易降解、與環境兼容性好的特點，一般被認為是化學藥品的潛在替代品[5]。現以褶皺臂尾輪蟲（Brachionus plicatilis）（以下簡稱輪蟲）為研究對象，探究17種植物精油對其殺滅效果，篩選出安全高效、純天然的輪蟲防控藥物，為生產中防治輪蟲技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 時間與地點

2022 年8 月，試驗地位于鄭州某實驗室。

1.2 材料

1.2.1 輪蟲

試驗用輪蟲購自上海某微生物培養機構，由單個孤雌生殖雌體馴化培養2 個月后，大量培養并誘導其種群產生休眠卵孵化而來[6]。

1.2.2 試劑及儀器

丁香酚（98%，20220603）、檸檬醛（94.5%，20220522）、側柏酮（92%，20220603）、香葉醇（98%，20220603）、薄荷醇（20220211）購自江西新森化工有限公司；石竹烯（87%，D887045）、檸檬烯（98%，E809010）、桉葉素（96%，E879023）、百部堿（88%，B807765）、松油醇（98%，E595432）、香芹酚（99%，C234255）、肉桂醛（99%，B328976）、香茅醛（98%，B234432）、水楊酸甲酯（99%，D998355）、廣藿香醇（90%，Z228482）、姜辣素（84%，B223552）、大蒜素（Allicin）（82%，B225112）購自廣州安奈生物科技有限公司。除癩靈（含辛硫磷10%）購自河南安進生物技術股份有限公司；三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚（分析純）、正丁醇（分析純）均購自天津恒興化學試劑制造有限公司；體式顯微鏡（ZX500TR）購自深圳市眾尋光學儀器有限公司；分析天平（AuW120D）購自日本SHIMADZU 儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 17種植物精油對輪蟲的殺滅效果預試驗

精確稱取相應植物精油500 mg 置于100 mL容量瓶中，后加入4 mL 三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚（乳化劑）及1 mL 正丁醇（助劑），加去離子水定容至100 mL，即得到5 g/L 濃度的相應精油微乳液母液（設不添加精油成分的溶劑對照組）。取各相應精油微乳液母液加入去離子水，將其稀釋（溶劑對照組同比例稀釋），每個處理組分別稀釋到1，10，100 和1 000 mg/L 4 個梯度。吸取1 mL 相應梯度的精油測試液，于細胞培養板（12 孔板）中，每孔中放入30 只齡長在4 h 以內的輪蟲幼體，每組每個濃度均設3 個重復，設置相同濃度梯度的辛硫磷溶液為化藥對照，去離子水為空白對照。試驗在（25±1）℃無光的恒溫培養箱中進行，24 h 后于體視顯微鏡下觀察，并記錄每孔中輪蟲死亡數，以輪蟲頭冠纖毛和個體運動停止作為死亡標準。

1.3.2 精油急性毒性試驗

根據1.3.1 預試驗中殺滅效果較好的精油，取其母液分別稀釋至0.1，0.3，0.6，1.0，2.0，6.0 和10.0 mg/L 共7 個梯度，吸取1 mL 相應濃度梯度的精油測試液于細胞培養板（12 孔板）中，每孔中放入30 只齡長在4 h 以內的輪蟲幼體，每組每個濃度均設3 個重復，設置相同濃度梯度的辛硫磷溶液為化藥對照，去離子水為空白對照。試驗在（25±1）℃無光的恒溫培養箱中進行，24 h 后于體視顯微鏡下觀察，并記錄每孔中輪蟲死亡數，采用SPSS 17.0 軟件中Probit 法，計算各精油對輪蟲24 h 的半致死濃度（LC50）。

1.3.3 復篩精油應用后輪蟲在24 h 內死亡情況

根據1.3.2 的試驗結果，使用相應精油微乳液母液，將其稀釋至其絕對致死濃度（LC100），吸取1 mL 相應濃度梯度的精油測試液于細胞培養板（12 孔板）中，每孔中放入30 只齡長在4 h 以內的輪蟲幼體，每組每個濃度均設3 個重復，設置絕對致死濃度的辛硫磷溶液為化藥對照，去離子水為空白對照，在（25±1）℃無光的恒溫培養箱中培養，并分別于5 min、2 h、6 h、12 h、24 h 時，觀察輪蟲死亡情況，記錄死亡數。

1.3.4 復篩精油對輪蟲群體增長防控效果評價

取對數生長期小球藻，接種至滅菌后的培養基內，接種密度為3.0×106cells/mL。用孔徑為0.075 mm篩絹過濾擴大培養的輪蟲，過濾水沖洗3 遍后添加至3 L 藻液中，輪蟲接種密度為3～6 尾/mL。之后于光照培養箱內培養，培養溫度（25±1）℃，光照條件L∶D=12 h∶12 h，待輪蟲適應2 d 后，分別添加1.3.2經過初篩的各植物精油至有輪蟲的培養液中，使各精油在其培養液中達到LC50，設未添加精油的輪蟲培養液作為空白對照組，LC50的辛硫磷為化藥對照組，每個處理設3 個重復。精油添加后，分別在1、3、5、7 d 時，取供試水體1 mL，使用浮游動物計數板統計輪蟲密度。

1.4 數據處理

使用SPSS 軟件進行方差分析（one-way ANOVA），對于有統計學意義組與對照組相比較，進行Dunnett’s 分析。

2 結果與分析

2.1 17種植物精油對輪蟲的殺滅活性

17種植物精油4種濃度時對褶皺臂尾輪蟲的殺滅活性見表1。由表1 可見，隨著濃度的降低，植物精油對輪蟲的殺滅活性也出現了不同程度的下降。為1 000 和100 mg/L 時，除對照組外，所有處理組均表現出100%對輪蟲殺滅活性；為10 mg/L時，百部堿、香葉醇、石竹烯、松油醇對輪蟲的殺滅率分別為（51.1±1.1）%，（42.2±2.2）%，（36.7±3.8）%和（34.5±2.2）%，而其他13種精油對褶皺臂尾輪蟲的殺滅效果均達到100%；在1 mg/L 下，不同種類精油對褶皺臂尾輪蟲的殺滅效果存在差異。其中，丁香酚、薄荷醇、檸檬烯、辛硫磷、香芹酚、大蒜素、肉桂醛對褶皺臂尾輪蟲的殺滅活性較強，其殺滅率分別為（93.3±1.9）%，（87.8±2.2）%，（85.5±2.2）%，（78.9±2.9）%，（78.9±4.0）%，（75.6±2.9）%和（71.1±2.2）%，均達到70%以上，高于同濃度下其他處理組，存在統計學差異（P＜0.05）。其次為側柏酮（44.5±4.0）%、廣藿香醇（43.3±3.3）%、水楊酸甲酯（40.0±3.3）%，而檸檬醛、桉葉素、香茅醛及姜辣素對輪蟲殺滅率較弱，均不足40%，僅高于對照組，存在統計學意義（P＜0.05）。另外，香葉醇、石竹烯、百部堿、松油醇在該濃度下未表現出對輪蟲的殺滅活性。同時2 個對照組在試驗中，褶皺臂尾輪蟲均未出現死亡。因此，選取抗輪蟲效果較好的丁香酚、薄荷醇、檸檬烯、香芹酚、肉桂醛、大蒜素進入下一步試驗。

表1 17種植物精油4種濃度時對褶皺臂尾輪蟲的殺滅活性① %

2.2 6種精油對輪蟲的滅殺效果

在2.1 試驗結果中，丁香酚、薄荷醇、檸檬烯、香芹酚、肉桂醛、大蒜素具有較強的對輪蟲的殺滅活性，因此以該6種精油開展急性毒性試驗，結果見表2。由表2 可見，通過對6種植物精油微乳液在24 h 時的致死中濃度進行比較，發現丁香酚、薄荷醇精油微乳液對供試輪蟲具有較強的毒力，其LC50分別為0.462 和0.548 mg/L，其殺滅活性均超過辛硫磷，毒力分別為辛硫磷的1.294 和1.091 倍；檸檬烯、香芹酚、大蒜素、肉桂醛精油微乳液的LC50分別為0.600、0.680，0.720 和0.841 mg/L，均高于辛硫磷（0.598 mg/L），毒力分別為辛硫磷的0.997、0.879、0.831 和0.711 倍。

表2 復篩精油為0.1～10.0 g/L 時對褶皺臂尾輪蟲的殺滅效果

2.3 6種精油應用后輪蟲在24 h 內死亡情況

絕對致死濃度（LC100）下植物精油微乳液在24 h內對褶皺臂尾輪蟲的殺滅效果見表3。由表3 可見，不同處理組對輪蟲的殺滅率隨時間的增加而增加，在用藥后5 min 時，所有處理組供試輪蟲未發現死亡；到2 h 時，丁香酚、薄荷醇、檸檬烯、辛硫磷組輪蟲開始出現死亡，死亡率分別為（40.0±3.3）%，（37.8±1.1）%，（28.9±2.9）%和（17.8±2.9）%，其中丁香酚、薄荷醇對輪蟲的殺滅率高于檸檬烯和辛硫磷，存在統計學差異（P＜0.05）；在6 h 時，所有處理組輪蟲均不同程度死亡，其中丁香酚、薄荷醇精油微乳液供試輪蟲死亡率達100%，殺滅率顯著大于同時期其他處理組，差異有統計學意義（P＜0.05），其次為檸檬烯、辛硫磷、香芹酚處理組，輪蟲死亡率分別為（84.5±2.2）%，（65.5±2.2）%和（55.6±4.8）%，高于大蒜素（43.3±3.3）%和肉桂醛（42.2±2.2）%處理組，存在顯著差異（P＜0.05）；12 h 時，檸檬烯、辛硫磷處理組的輪蟲死亡率達到100%，而其他處理組的輪蟲死亡率也均高于70%，直至24 h 時，所有處理組供試輪蟲均全部死亡。

表3 絕對致死濃度（LC100）下植物精油微乳液在24 h 內對褶皺臂尾輪蟲的殺滅效果① %

2.4 6種精油對輪蟲的群體增長的防控效果

輪蟲在不同精油處理后不同時間下的種群密度變化見表4。由表4 可見，各精油在其LC50時，隨著培養時間的延長，其體系內的輪蟲密度均出現了不同程度的增加，其中以對照組增加幅度最大，從1 d 時的（6.67±1.20）ind/mL，增加至7 d時的（144.33±12.14）ind/mL。在用藥后1 d，所有精油處理組及化藥對照的輪蟲密度均小于空白對照組，存在統計學意義（P＜0.05）；除空白對照組外，其他處理組的輪蟲密度均為0.5～1.5 ind/mL，相互之間沒有顯著差異；在第3 d 時，丁香酚、薄荷醇處理組的輪蟲密度分別為（1.67±0.67）和（2.33±0.88）ind/mL，小于香芹酚、大蒜素、肉桂醛、辛硫磷處理組及空白對照組，存在統計學意義（P＜0.05）；在第5 d 時，丁香酚、薄荷醇、檸檬烯處理組的輪蟲密度分別為（6.33±0.67），（7.33±0.88）和（8.67±0.88）ind/mL，小于大蒜素、肉桂醛、辛硫磷處理組及空白對照組；在第7 d 時，丁香酚處理組的輪蟲密度最小，為（12.0±1.52）ind/mL，小于其他處理組且存在統計學意義（P＜0.05），其次為薄荷醇，輪蟲密度為（19.33±1.20）ind/mL，小于香芹酚、大蒜素、肉桂醛、辛硫磷處理組及空白對照組，存在統計學意義（P＜0.05）。

表4 輪蟲在不同精油處理后不同時間下的種群密度變化①

3 討論

輪蟲是單細胞藻類的重要敵害生物，由于藻細胞生長繁殖速度快，如果輪蟲的數量不多，吞食量不大，影響并不嚴重；但當輪蟲繁殖數量增多時，吞食量也增大，便會對藻類及魚蝦產生嚴重的危害。目前，化學防治被認為是消滅輪蟲的可行且有效的方法，一些試劑如甲苯、己烷和二甲苯，被證明對萼花臂尾輪蟲和褶皺臂尾輪蟲有高毒性[7]，但它們具有廣譜性，也可能傷害藻類和其他水生生物；一些抗生素對輪蟲也具有一定殺滅效果。孫帆等[8]采用鹽酸四環素對萼花臂尾輪蟲進行了急性毒性試驗，將其在質量濃度為2.5，5.0，10.0，20.0，40.0 和80.0 mg/L 的環境下培養，結果表明，鹽酸四環素的LC50為120.055 mg/L；朱韓等[9]研究發現，畜禽常用的抗生素諾氟沙星在不同藻密度下，對萼花臂尾輪蟲表現出不同的殺滅活性諾氟沙星在1.0×106、2.0×106和4.0×106cells/mL 藻密度下的LC50分別為452.873，525.146 和526.650 mg/L；翟盼等[10]研究了質量濃度為10.0，15.0，20.0，25.0，30.0 和35.0 mg/L 的利福平，對萼花臂尾輪蟲的急性毒性，當藻的密度為1.0×106cells/mL 時，其LC50為18.000 mg/L。大部分抗生素本身成本較高，不適合大規模使用。合成化學農藥如有機磷和擬除蟲菊酯，常被用來防治輪蟲，甲基對硫磷和二嗪農可以降低輪蟲物種的種群增長率[11-14]，其他合成化學農藥如噻吩甲甲基，甲胺磷和殺螟松對萼花臂尾輪蟲的種群生長和產卵則表現出抑制作用[15-17]。化學控制劑雖然方便、成本低，但也存在弊端，所使用的化學物質有可能被藻類吸收，同時化藥成分可持續存在于養殖水體中污染水體。由于化學殺蟲劑的種種局限性，從植物中尋找環境友好、安全性高、殘留量低、使用經濟的輪蟲防控藥物的研究與開發具有廣闊前景，但目前關于植物源輪蟲殺滅藥物的研究相對較少。黃園[18]研究了苦皮藤素、印楝素、苦參堿和川楝素對褶皺臂尾輪蟲的殺滅活性，結果顯示，苦皮藤素和苦參堿表現出了對褶皺臂尾輪蟲的高毒性，其LC50分別為0.175、0.061 mg/L，而印楝素（18.386 mg/L）和川楝素（2.132 mg/L）的毒力要明顯弱于前者。

4 結論

采用不同濃度的17種植物精油，對輪蟲的殺滅活性進行了試驗。結果表明，檸檬烯、丁香酚、大蒜素、香芹酚、肉桂醛、薄荷醇對輪蟲的殺滅效果優于其他精油，其中薄荷醇和丁香酚，對輪蟲具有急性毒性，當濃度為LC100時，可在12 h 內殺滅全部供試輪蟲，其毒力高于辛硫磷，在實驗室條件下，可以有效抑制輪蟲的種群增長。