不同養(yǎng)殖環(huán)境下中華圓田螺腸道菌群多樣性試驗

黃明磊，黃凱*，宿志健，王超男，楊旭紅

（1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.南寧海寶路水產(chǎn)飼料有限公司，廣西 南寧 530031）

中華圓田螺（Cipangopaludina cathayensis），俗名田螺、香螺，屬軟體動物門、腹足綱、田螺科、圓田螺屬。分布于我國北方各省區(qū)；在國外主要分布于朝鮮和北美等國家。生活于湖泊、河流、水庫、池塘及稻田內(nèi)[1]，尤其喜棲息在水草茂盛的水域。其適應(yīng)性強，對干燥及寒冷有較大的抗御力。足發(fā)達，適于水底爬行，常以水生植物和低等藻類為食，是淡水螺的主要養(yǎng)殖品種[2]。其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，高蛋白、低脂肪，具有食用、藥用價值[3-5]；同時還具有凈化水體的功能[6]，螺肉、螺殼可作為其他經(jīng)濟動物的飼料原料。

水生動物腸道微生物菌群的結(jié)構(gòu)、功能與水生動物的營養(yǎng)代謝、腸道發(fā)育以及免疫系統(tǒng)有密切的關(guān)系，維持其機體腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。在不同養(yǎng)殖環(huán)境下，水產(chǎn)動物的腸道菌群也有各自特點，當(dāng)養(yǎng)殖水環(huán)境發(fā)生變化或水體中受到某些因素影響時，其腸道菌群結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，已適應(yīng)新環(huán)境的細菌會大量繁殖，影響原有菌落平衡。李存玉等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在池塘養(yǎng)殖與工廠化養(yǎng)殖條件下，牙鲆（Paralichthys olivaceus）腸道菌群豐度與多樣性及菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異；楊鶯鶯等[8]研究認為，對蝦腸道菌群的定殖性受到外界環(huán)境影響時，如水質(zhì)突變，極易引起對蝦腸道菌群平衡失調(diào)，被病原菌侵入，暴發(fā)疾病。現(xiàn)開展不同養(yǎng)殖環(huán)境對中國圓田螺腸道菌群的影響試驗。

1 材料與方法

1.1 時間與地點

2022 年11 月。試驗地位于廣西大學(xué)。

1.2 材料

設(shè)置A、B 2組。A 組：中華圓田螺來自廣西玉林陸川縣養(yǎng)殖基地，采用微流水稻田養(yǎng)殖方式，養(yǎng)殖水溫26.5 ℃，ρ（溶解氧）為（5.0±0.5）mg/L，pH 值為（7.0±0.4），ρ（氨氮）＜0.2 mg/L；B 組中華圓田螺來自邕江江邊水池養(yǎng)殖，養(yǎng)殖水溫為26.4 ℃，ρ（溶解氧）為（4.5±0.5）mg/L，ρ（氨氮）＜0.7 mg/L，pH 值為（6.8±0.3）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

隨機從A、B 2組選取30 只外殼完好、健康、無機械損傷的中華圓田螺，置于無菌操作臺滅菌的冰盤內(nèi)，破殼取螺腸道置于50 mL 滅菌離心管中，迅速放入液氮中冷凍20 min 后，于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.3.2 樣品中總DNA 的提取與純化

分別取A 組和B 組田螺的腸道內(nèi)容物（每個平行組隨機取5 只田螺的腸道內(nèi)容物并混合），根據(jù)QIAampFast DNA Stool Mini Kit 進行總菌群DNA提取純化。將提取純化的DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓為120 V，時間30 min，觀察DNA 片段完整性及大小，要求目的條帶明顯，無明顯降解。

1.3.3 PCR 擴增及純化

取純化后的DNA 30 ng 置于無酶管中，加水稀釋為1 mg/L 作為模板。使含有Barcode 的特異引物與高保真酶，對V3—V4 區(qū)域進行PCR 擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 純度。

PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠，在電壓170 V條件下進行30 min 凝膠電泳，以檢測目的條帶的寬度，并用AAMP（Agencourt AMPure XP）核酸純化試劑盒純化。PCR 擴增引物序列、拼接結(jié)果見表1、表2。

表1 PCR 引物擴增序列

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

腸道菌群通過Silva 與Unite 數(shù)據(jù)庫比對測序結(jié)果，并依靠《伯杰氏鑒定細菌學(xué)手冊》及相關(guān)文獻進行菌屬功能的分類處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序

測序結(jié)果見表3。由表3 可見，過濾嵌合體后，最終用于后續(xù)分析的Tags 序列平均長度為422 bp。2 個樣本共得到131 240 條序列，A 組樣本原始序列共87 923 條，B 組樣本原始序列共43 317 條。其中質(zhì)控后可用于后續(xù)分析的有效序列共105 319 條，A 組樣本剩余序列共71 669 條，B 組樣本原始序列共33 650 條。

表3 樣品QC 之后序列統(tǒng)計

2.2 物種多樣性曲線

將所得有效數(shù)據(jù)構(gòu)建稀釋曲線和等級聚類曲線，見圖1、2。由圖1 可見，2 個樣本的稀釋曲線逐漸趨于平穩(wěn)，這可表明測序數(shù)據(jù)量漸進合理，更多的數(shù)據(jù)量基本上不會再產(chǎn)生較多的OTUs。由圖2可見，曲線在水平方向的橫軸上跨度較大，說明物種豐富度高；在垂直方向上曲線坡度較大，說明物種分布不均勻。

圖1 樣本稀釋曲線

圖2 等級聚類曲線

2.3 中華圓田螺樣本菌群alpha 多樣性

Alpha 多樣性指數(shù)統(tǒng)計見表4。由表4 可見，2組之間的物種豐富度和均勻度差異較小，其中OTU覆蓋率分別為99.6%和99.9%。說明樣品中有未被測出的序列的概率較低，測序數(shù)量已飽和，能夠真正反映中華圓田螺的腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)及組成多樣性。A 組的chao1 指數(shù)最高為471.662，表明A 組的物種豐富度最大，B 組的Shannon 指數(shù)比A 組高。由此可見，A、B 2組的腸道群落物種多樣性存在差異。

表4 Alpha 多樣性指數(shù)統(tǒng)計

2.4 中華圓田螺樣本菌群OTU 分析

在門和屬的分類水平上分別對2種養(yǎng)殖模式下中華圓田螺腸道菌群組成進行鑒定，結(jié)果表明不同養(yǎng)殖模式下中華圓田螺腸道中的優(yōu)勢菌種類相同，但同種優(yōu)勢菌的數(shù)量分布存在較大差異。基于A 組和B 組樣品中全部OTU 做Venn 圖（圖3），比較2組間的差異。A、B2組共有OTU 數(shù)目為289，A組特有的OTU 數(shù)量155，B 組特有的OTU 數(shù)量為65，A、B2組OTU 數(shù)目差異顯著（P<0.05）。

圖3 各試驗組OTU 數(shù)目韋恩圖

2.5 中華圓田螺樣本菌群物種豐度

選取A、B 2組門（Phylum）水平排名前10 物種，生成物種豐度柱狀圖（圖4）。在A、B2組不同養(yǎng)殖環(huán)境下，中華圓田螺中共檢測到22 類門水平菌群，選取物種豐度排名前10 的菌門，共菌門有9 門，衣原體菌門（Chlamydiae）為B 組特有門類。擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）在A、B 2組菌群中相對豐度最高，分別占53.32%、32.48%和43.12%、25.12%。但腸道內(nèi)容物與腸壁樣品中厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度則有較大的差異。其中厚壁菌門（Firmicutes）在A 組中的占比（3.01%）遠小于B 組（18.57%）。將2組樣本腸道共有菌群屬在（Genus）水平進行物種相對豐度排名，前30 的菌屬設(shè)為“主要共有菌屬”（圖5）。其中A 組中擬桿菌類（Bacteroides）（52.63%）、氣單胞菌（Aeromonas）（22.97%）的菌屬相對豐度值顯著高于B 組，為優(yōu)勢菌種。變形菌屬（Proteocatella）（10.8%）顯著低于B 組。其他所占比例較少。

圖4 門（Phylum）水平上物種相對豐度堆積柱狀圖

圖5 2 個試驗組腸道主要共有菌屬相對豐度

3 討論

采用了高通量測序技術(shù)，選取了不同環(huán)境下的2組各10 只中華圓田螺作為樣本，提取其腸道內(nèi)容物中微生物DNA，并進行腸道微生物的多樣性分析。通過對稀釋曲線的測定可見，稀釋曲線已達到飽和，說明樣品測序量足夠且合理，能夠反映其腸道微生物多樣性及結(jié)構(gòu)組成。2組樣本共得到131 240 條序列，共涉及25 門215 屬，其中共有菌屬169種，特有菌屬各23種。基于97%的樣本相似度，樣本優(yōu)化聚類為609 個OTU。本試驗的A 組和B 組Chao1、ACE 指數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差較大，表明2組物種豐富度在不同環(huán)境下會造成差異；Shannon 和Simpson多樣性指數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差較小，表明2組樣品的微生物菌落的均勻度基本一致。微生物菌落多樣性，對于維持生態(tài)具有重要作用，環(huán)境多樣性的高低，可表示微生物菌落性能的高低，即多樣性低菌落穩(wěn)定性差，患病風(fēng)險增大。孫笑非等[9]研究表明，動物腸道菌群的多樣性與腸道菌群穩(wěn)定性成正比；黃雪敏等[10]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)養(yǎng)殖水體中有更高的Alpha多樣性時，水體環(huán)境的穩(wěn)定性更高，水產(chǎn)動物健康生長，反之則發(fā)病；杜世聰?shù)萚11]研究發(fā)現(xiàn)，Shannon指數(shù)下降，可作為對蝦健康出現(xiàn)分化的標(biāo)志。

本試驗在不同養(yǎng)殖環(huán)境下，中華圓田螺腸道主要菌群（3%以上）為：擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、軟壁菌門（Tenericutes）4 類，其中Bacteroidetes 菌門含量最高，A 組含量為53%，B 組含量為43%：其次為Proteobacteria，A 組含量為32%，B 組含量為25%。研究其他水生動物的腸道優(yōu)勢菌群后，發(fā)現(xiàn)在不同養(yǎng)殖環(huán)境下，中華絨蟹（Eriocheir sinensis）腸道細菌，大多數(shù)種系型屬于變形菌門或擬桿菌門[12]；分析凡納濱對蝦的養(yǎng)殖環(huán)境及腸道微生物群落特征后，發(fā)現(xiàn)其所有樣本中優(yōu)勢門類為變形菌門、擬桿菌門和放線菌門，其中變形菌門占絕對優(yōu)勢[13]；而在研究健康與患病的凡納濱對蝦腸道主要菌群差異后，發(fā)現(xiàn)其腸道主要菌群為變形菌門（51.2%）和放線菌門（27.2%），并無顯著差異[14]；羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）[15]與日本沼蝦[16]腸道中，變形菌門和厚壁菌門為主要優(yōu)勢菌群。本試驗中華圓田螺腸道優(yōu)勢菌群為擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門，與其他水生動物的腸道優(yōu)勢菌群基本一致。

文獻[17-19]研究表明，在動物的腸道中，α-變形桿菌（Alpha proteobacteria）或者γ-變形菌（Gamma proteobacteria）占優(yōu)勢地位，而變形菌門、綱細菌不占主要地位。本試驗中，擬桿菌門在中華圓田螺腸道中含量最高，擬桿菌門同時也是人體腸道細菌的主要組成部分，擬桿菌門能與DNA、脂肪及蛋白質(zhì)等有機物質(zhì)進行密切的轉(zhuǎn)換，有機物的吸收和利用，是水環(huán)境中碳循環(huán)的重要組成部分。厚壁菌門和擬桿菌門在水產(chǎn)動物腸道的相對比例與宿主的食性和代謝成正比[20-21]，本試驗中，A 組中相關(guān)菌群豐富度遠大于B 組，推測稻田環(huán)境下的中華圓田螺腸道菌群，比池塘環(huán)境中的更有優(yōu)勢。

本試驗共檢測出215 個菌屬，這其中A、B2組中華圓田螺腸道共有菌屬169種，特有菌屬各23種，特有菌屬其含量均低于0.01%。豐富度前10 中共檢測出，擬桿菌屬（Bacteroides）、氣單胞桿菌屬（Aeromonas）、蛋白乳桿菌屬（Proteocatella）、乳酸菌屬（Cetobacterium）、支原體屬（Mycoplasma）、未鑒定的梭狀芽孢桿菌屬（unidentified_Clostridiales）、葡萄皮桿菌屬（Epulopiscium）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、乙酰擬桿菌屬（Acetobacteroides）、不動桿菌屬（Acinetobacter）。其中共檢測到3種益生菌屬：芽孢桿菌屬（Bacillus Cohn）、蛭弧菌屬（Bdellovibrio）、擬桿菌屬（Bacteroides）；檢測出4種致病菌屬：氣單胞菌屬（Aeromonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、弧菌屬（Vibrio）、黃桿菌屬（Xanthomonas），與孫振麗等[22]對南美白對蝦養(yǎng)殖環(huán)境及其腸道細菌多樣性研究中分離的益生菌一致。文獻[23]研究表明，稻田相較于池塘，其多項水質(zhì)指標(biāo)得到改善，種類組成更為健全。在本試驗中，A 組中益生菌擬屬桿菌屬（Bacteroides）豐富度顯著高于B 組，分別為59.63%與39.97%，致病菌屬氣單胞菌屬（Aeromonas）占比相近，由此推測在稻田環(huán)境下的中華圓田螺腸道健康狀況優(yōu)于池塘環(huán)境。

研究發(fā)現(xiàn)[24]，微生物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中扮演著重要的角色，其可以通過分解有機物、維持水體穩(wěn)定性、防止病害發(fā)生、促進營養(yǎng)循環(huán)、改善水質(zhì)等多種方式調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水體環(huán)境，對水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)的健康至關(guān)重要。水生動物腸道微生物菌群的結(jié)構(gòu)、功能，對水產(chǎn)動物的營養(yǎng)代謝、腸道發(fā)育以及免疫系統(tǒng)有密切的關(guān)系，是維持機體腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素[25]。食物的消化，是通過水生動物消化系統(tǒng)和菌群生物產(chǎn)生的酶共同完成[26]。但是，在不同養(yǎng)殖環(huán)境下，水產(chǎn)動物的腸道菌群也有各自特點。本試驗通過對不同養(yǎng)殖環(huán)境下中華圓田螺腸道菌群的研究，有助于了解中華圓田螺消化生理特性、營養(yǎng)需求，對于維持中華圓田螺的健康養(yǎng)殖、飼料開發(fā)、飼料添加劑的研發(fā)具有重要意義。同時，一些經(jīng)腸道疾病，往往與腸道細菌密不可分，研究腸道菌群，有助于了解疾病的發(fā)生和病變過程，能將腸道內(nèi)益生菌與其他有益菌，制成復(fù)合菌劑投喂水生動物，可以增強抗病力、免疫力，對生產(chǎn)動物生長繁殖有利[27]。

中華圓田螺腸道微生物菌群特征，與其養(yǎng)殖環(huán)境、餌料、自身發(fā)育息息相關(guān)，密不可分，體現(xiàn)在養(yǎng)殖水域中微生物含量、溫度、鹽度、餌料發(fā)育階段，這些因素對于中華圓田螺腸道菌群結(jié)構(gòu)均有影響。本試驗發(fā)現(xiàn)，相對于池塘養(yǎng)殖的中華圓田螺，稻田養(yǎng)殖的中華圓田螺，具有天然餌料豐富、食物豐富的優(yōu)點，這種養(yǎng)殖模式，造就了稻田養(yǎng)殖型中華圓田螺腸道中更高的細菌多樣性、更健康的菌群組成、更高的細菌總數(shù)以及更高的物種豐度。

4 結(jié)論

根據(jù)中華圓田螺腸道16s rRNA 測序結(jié)果顯示，稻田養(yǎng)殖中華圓田螺腸道菌群比池塘養(yǎng)殖中華圓田螺腸道菌群具有更高的個體差異性、更豐富的物種多樣性、更高的菌群豐度。中華圓田螺腸道中的優(yōu)勢細菌為測序文庫中高比例Proteobacteria 和Bacteroidetes。