內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/GSK3β通路在柚皮苷抑制高糖引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用

浮鳳洲 （廣東省東莞市松山湖中心醫(yī)院,廣東 東莞 523320）

柚皮苷（Naringin）作為一種雙青黃酮類化合物，可在柑橘、葡萄柚果皮、酸橙果皮中進(jìn)行提取[1]。隨著社會(huì)的高速發(fā)展，人們的生活方式有了很大的變化，我國(guó)糖尿病的患病人數(shù)有了大幅增加。糖尿病患者在進(jìn)行代謝的過(guò)程中可能會(huì)引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[2]，對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞線粒體ROS的生成具有重要的作用。有相關(guān)研究[3]證實(shí)，Naringin在糖尿病的心血管并發(fā)癥中具有一定的保護(hù)作用，主要表現(xiàn)在調(diào)控GSK3β通路、線粒體保護(hù)以及抗ERS作用，在產(chǎn)生保護(hù)作用后，會(huì)引起多種傷害的刺激，從而引發(fā)細(xì)胞損傷[4]。由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/GSK3β是糖尿病患者血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要發(fā)病機(jī)制，可以將其當(dāng)作內(nèi)皮細(xì)胞損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也將其當(dāng)作是Naringin防治的重要靶標(biāo)。近年來(lái)，糖尿病已經(jīng)成為了危害心血管疾病的獨(dú)立因素之一，成為了世界衛(wèi)生發(fā)展重要難題[5]。糖尿病產(chǎn)生的主要危害來(lái)自于并發(fā)癥，可引起視網(wǎng)膜病變、腎臟病變等[6]。本文基于此，探討了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/GSK3β通路在柚皮苷抑制高糖引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用，具體內(nèi)容如下。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 本次試驗(yàn)的試劑、儀器等包括：血管內(nèi)皮細(xì)胞（上海雅吉生物科技有限公司），柚皮苷（美國(guó)Sigma公司），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑四本基乙酸（4-Pheny1 Butyrie Acid，4-PBA）、TDZD-8（非ATP競(jìng)爭(zhēng)性GSK-3β抑制劑）（賽百慷生物科技股份有限公司），胎牛血清（PAN公司），培養(yǎng)基（Hycolone公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Roche公司），GSH試劑盒（武漢吉立德生物有限公司），ROS試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所），NO試劑盒（南京建成生物科技有限公司），DNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo公司），細(xì)胞凋亡試劑盒（Beyotime公司），IL-6（Interleukin-6）、NF-kB（Nuclear Factor-Kappa B）、GRP78（Glucose Related Protein）、Caspase3、CHOP都購(gòu)買自Abcam公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱（力申科學(xué)儀器有限公司），Nano Drop 2000（Thermo公司），離心機(jī)（Sigma公司），40mmol/L葡萄糖（Hyclone公司）[7]。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定方法 首先在孔板中將細(xì)胞懸液進(jìn)行配置，并放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，在培養(yǎng)基中加入不同濃度的多肽，因?yàn)镃CK-8的量比較少，所以在孔壁上可能會(huì)帶來(lái)一定的誤差，因此在培養(yǎng)板中要進(jìn)行敲擊，從而充分的混勻。在培養(yǎng)了1-4h后，就可以對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞存活率的檢測(cè)，檢測(cè)的波長(zhǎng)一般為450-490nm左右[8]。

1.2.2 DCFH-DA染色法檢測(cè)活性氧及GSH試劑盒檢測(cè) 用無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行陽(yáng)性稀釋，讓濃度達(dá)到100uM，如果刺激時(shí)間較短，還需要先裝載探針。若刺激時(shí)間較長(zhǎng)，就后裝探針[9]。本次試驗(yàn)的刺激時(shí)間較長(zhǎng)，所以選擇后裝探針。在細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中，對(duì)細(xì)胞的狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其進(jìn)行清洗和誘導(dǎo)，于37℃環(huán)境下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行避光培養(yǎng)，離心后去除上清液，對(duì)細(xì)胞收集后即可使用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。

谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸以及甘氨酸所組成的，將0.05g的細(xì)胞種子放入5%的三氯乙酸中進(jìn)行研磨，離心10min后取上清液，標(biāo)準(zhǔn)溶液使用5%的三氯乙酸并選用pH為7.8的PBS，充分的混勻后，在30℃的條件之下保溫5min后即可進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 ELISA試劑盒檢測(cè)及免疫印跡法檢測(cè) 將所需的板條數(shù)放入到框架之中，建立空白孔，加入TMB顯色液及終止液，通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)畫出相應(yīng)的曲線。將濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)品加入到孔中，使用封板膠紙封住在室溫下培養(yǎng)2h。隨后清洗板條，并在每個(gè)空白孔中加入100ul的工作液，于室溫下培養(yǎng)1h。隨后加入酶結(jié)合物[10]，培養(yǎng)20min。加入顯色劑后繼續(xù)培養(yǎng)20min，最后加入終止液充分?jǐn)嚢韬蠹纯蓹z測(cè)IL-1β、IL-6、IL-8。

免疫印跡法需要進(jìn)行細(xì)菌誘導(dǎo)和表達(dá)，借助電泳的方式將細(xì)胞裂解，在真核細(xì)胞中加入勻漿緩沖液，在室溫下加勻漿，在13000r下離心15min，取上清液進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。在免疫反應(yīng)中，選擇0.01PBS洗膜，持續(xù)時(shí)間5min[11]，加入包被液后均勻搖動(dòng)，在室溫下培養(yǎng)2h。加入一抗液體，需要將膜全部覆蓋，在4℃的條件下放置12h，通過(guò)陰性對(duì)照的方式進(jìn)行培養(yǎng)。最后加入顯色液，終止反應(yīng)后即可進(jìn)行檢測(cè)[12]。

1.2.4 JC-1染色法測(cè)定 首先誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并同時(shí)設(shè)立陰性組和陽(yáng)性組，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間之內(nèi)對(duì)其進(jìn)行Caspase檢測(cè)，將細(xì)胞進(jìn)行收集。使用PBS洗滌液對(duì)細(xì)胞離心5min，去細(xì)胞上清液后加入水稀釋，將其加熱到37℃。吸入500g/L的incubation Buffer，加入JC-1混勻成為JC-1工作液。將工作液放入細(xì)胞中，讓細(xì)胞懸浮，并于37℃下在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20min。隨后在2000rpm下離心5min。最后使用流式細(xì)胞儀對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢測(cè)[13]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本次研究所涉及統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)資料均利用SPSS21.00軟件進(jìn)行處理計(jì)算，其中計(jì)量資料選擇t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，當(dāng)計(jì)算結(jié)果得出P＜0.05則表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)果 研究結(jié)果表明，正常對(duì)照組細(xì)胞的存活率為100%，高糖組的細(xì)胞存活率為（70.36±6.31）%，柚皮苷+高糖組的細(xì)胞存活率為（86.44±5.80）%，可以看出，在不進(jìn)行任何干預(yù)的情況下，細(xì)胞存活率不會(huì)受到任何影響。而柚皮苷+高糖組的細(xì)胞存活率明顯高于高糖組（P＜0.05），說(shuō)明柚皮苷在高糖引起的血管內(nèi)皮損傷中具有保護(hù)作用。

2.2 氧化應(yīng)激檢測(cè)結(jié)果 氧化應(yīng)激主要測(cè)試細(xì)胞的活性氧（ROS）以及GSH水平，由于使用的DCFH-DA探針沒(méi)有熒光，所以在酯酶水解后會(huì)形成DCFH，難以透過(guò)細(xì)胞膜。研究結(jié)果表明，高糖組的ROS含量明顯高于正常對(duì)照組，且相較于高糖組，柚皮苷+高糖組的柚皮苷濃度有所增加，ROS含量降低。

2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 在細(xì)胞凋亡中，正常對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率最低，為（20.77±3.08）%，高糖組的細(xì)胞凋亡率為（42.71±8.12）%，明顯高于柚皮苷+高糖組的（24.01±4.22）%。這說(shuō)明柚皮苷對(duì)于細(xì)胞凋亡有著保護(hù)的作用。

2.4 炎癥因子檢測(cè)結(jié)果 在炎癥因子的表達(dá)中，相較于正常對(duì)照組，高糖組的NF-kB、IL-6表達(dá)有所升高（P＜0.05）。相較于高糖組，柚皮苷+高糖組的IL-6、NF-kB有所下降。如表1所示。

表1 三組炎癥因子檢測(cè)結(jié)果比較

2.5 線粒體損傷檢測(cè)結(jié)果 為了驗(yàn)證線粒體損傷的檢測(cè)結(jié)果，分別加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑四苯基乙酸（4-phenyl butyric acid，4-PBA）、TDZD-8（非ATP競(jìng)爭(zhēng)性GSK-3β抑制劑），觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞毒性的作用。研究結(jié)果表明，正常對(duì)照組MMP和細(xì)胞色素C表達(dá)明顯高于高糖組（P＜0.05），而4-PBA組、TDZD-8組、4-PBA+高糖組及TDZD-8+高糖組明顯高于高糖組。這說(shuō)明4-PBA、TDZD-8對(duì)血管內(nèi)皮損傷有保護(hù)作用。見(jiàn)表2。

表2 各組線粒體損傷檢測(cè)結(jié)果

2.6 eNOS表達(dá)及NO檢測(cè)結(jié)果 研究結(jié)果表明，相較于高糖組，柚皮苷+高糖組的柚皮苷濃度增加，NO含量也在增加。可是相較于對(duì)照組，高糖組的NO含量明顯降低。

3 討論

糖尿病（Diabetes）是臨床常見(jiàn)的慢性疾病，受到許多外部因素的影響，導(dǎo)致患者自身的代謝處于紊亂狀態(tài)[14]。臨床上主要以高血糖為主要表現(xiàn)，還可出現(xiàn)多尿、多飲、多食、消瘦的情況。糖尿病會(huì)引發(fā)許多其他的并發(fā)癥，嚴(yán)重的還有可能引發(fā)器官衰竭，是一種無(wú)法治愈的疾病[15]。在本次實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，探討了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/GSK3β通路在柚皮苷抑制高糖引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用。研究結(jié)果表明，在不受到任何干擾的情況下，細(xì)胞的存活率較高、凋亡率較低，建立了葡萄糖高糖模型后發(fā)現(xiàn)，高糖組的細(xì)胞存活率較低，凋亡率較高，但是發(fā)現(xiàn)柚皮苷能夠有效地對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，有效提高細(xì)胞存活率，降低凋亡率，且降低了ROS含量。在炎癥因子檢測(cè)結(jié)果中，柚皮苷+高糖組的IL-6、NF-kB相較于高糖組有所下降。4-PBA、TDZD-8對(duì)線粒體損傷有保護(hù)作用。

綜上所述，柚皮苷在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/GSK3β通路下對(duì)高糖引起的血管內(nèi)皮損傷具有保護(hù)作用，且4-PBA、TDZD-8可以起到抑制作用，其中的作用機(jī)制可能與炎癥因子、細(xì)胞凋亡有一定的關(guān)系，因此，臨床治療中如果有效地抑制炎癥因子釋放，可能會(huì)產(chǎn)生較好的臨床效果。