蛋白磷酸酶1調節亞基14B對神經母細胞瘤細胞有絲分裂進程的調控作用

簡肖肖，張萬鵬，常 艷，張學敏，李慧艷，胡懷斌

（1.國家生物醫學分析中心，北京 100850；2.國家兒童醫學中心，首都醫科大學附屬北京兒童醫院，兒科重大疾病研究教育部重點實驗室，兒童耳鼻咽喉頭頸外科疾病北京市重點實驗室，北京市兒科研究所耳鼻咽喉頭頸外科研究室，北京 100045）

神經母細胞瘤（neuroblastoma，NB）是兒童最常見的顱外實體瘤，惡性程度高，預后差，占兒童惡性腫瘤的8%～10%，死亡數約為所有兒童因癌癥死亡人數的15%［1-2］。NB 最常見的發生部位是腎上腺，也可發生在頸、胸和腹部及盆腔神經組織［3-4］。國際神經母細胞瘤分期系統（International Neuroblastoma Staging System）將NB 分為1，2A/2B，3，4 和4S 期［5］，其中1 期惡性程度較低，4 期惡性程度最高，4S期特指1歲以內的患兒。目前臨床上常用的治療方法包括放療、化療、手術切除和免疫治療等，然而治療效果并不理想，患者總生存率仍＜40%［6］。因此，深入研究NB 發生發展機制并尋找其治療新靶點具有重要意義。

細胞周期分為G1，S，G2和M 4 個分期，其中M期（有絲分裂期）又可分為前期、前中期、中期、后期和末期。細胞周期整個過程受到一系列分子的精確調控，其調控異常可能引起細胞無限增殖，最終導致腫瘤等疾病發生［7-8］。據報道，多種細胞周期激酶如周期蛋白依賴性激酶、aurora 激酶和polo 樣激酶等，在惡性腫瘤中表達異常或發生突變［9-10］。目前靶向這些激酶的小分子抑制劑已在不同腫瘤的非臨床試驗或臨床治療中取得了良好效果［11-12］，但與其他很多小分子靶向藥物相似，目前這些激酶的小分子抑制劑僅對部分腫瘤患者有效。因此，繼續深入研究腫瘤細胞周期調控機制，不僅可揭示腫瘤發生發展規律，還將為腫瘤診斷治療提供新的潛在靶標。

蛋白磷酸酶1 調節亞基14B（protein phosphatase 1 regulatory subunit 14B，PPP1R14B）是蛋白磷酸酶1的抑制蛋白。最近研究報道，PPP1R14B在多種成人腫瘤組織中高表達，其高表達患者生存率較低［13］。且已有報道，PPP1R14B 在細胞有絲分裂期發生磷酸化［14］，但具體功能尚不清楚。本研究觀察其在NB 細胞有絲分裂期發揮的作用，并初步探討其在NB中的表達水平及其與預后的相關性。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

人NB 細胞SK-N-BE（2）-M17和SK-N-BE（2）-M17 GFP-H2B 細胞，中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心；人胚腎細胞HEK293T，美國ATCC 細胞庫；均培養于DMEM 完全培養基（含有10%胎牛血清，1%青-鏈霉素），于37 ℃，5%CO2細胞培養箱中培養，待貼壁生長至70%～80%融合度時傳代。大腸桿菌DH5α 感受態細胞（S101-02），北京康潤誠業生物科技有限公司。

脂質體轉染試劑Lipofectamine RNAiMAX，美國Invitrogen公司；Opti-MEM 培養基，美國Gibco公司；DMEM 培養基、青-鏈霉素雙抗和胰酶，中科邁晨（北京）科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），依科賽生物科技有限公司；Prime-Script RT Master Mix，日本TaKaRa 公司；PowerUp SYBR Green Master Mix，美國Thermo Fisher 公司；質粒抽提試劑盒，美國Promega 公司；兔抗人PPP1R14B 多克隆抗體（一抗），美國Proteintech公司；小鼠抗α 微管蛋白單克隆抗體（一抗），美國Sigma 公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG 抗體（二抗），美國Jackson ImmunoResearch 公司。Mini-PROTEAN 型Western Blot 電泳儀，美國BIO-RAD公司；FORMA311 型細胞培養箱，美國Thermo Fisher 公司；5424R 型低溫超速離心機和542R 型常溫超速離心機，德國Eppendorf 公司；UltraVIEW Vox型轉盤式共聚焦顯微鏡，英國PerkinElmer公司；QuantStudio 5 實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）儀，美國ABI公司。

1.2 小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）序列設計及脂質體介導的siRNA轉染

據PPP1R14B基因的cDNA序列（NM_138689.3）及siRNA 設計原則，設計針對PPP1R14B基因編碼區的2 條siRNA 序列，命名為PPP1R14BsiRNA#1和#2，同時設計對照siRNA，序列見表1。序列經BLAST 同源性比對后由廣州銳博生物技術有限公司合成。

Tab.1 Sequences of small interfering RNA (siRNA)

取狀態良好的對數生長期SK-N-BE（2）-M17細胞接種于6 孔板。次日，細胞生長至融合度約40%時，按Lipofectamine RNAiMAX 轉染試劑說明書操作，分別轉染對照siRNA，PPP1R14BsiRNA#1和#2。轉染前1 h將培養液換成原體積的1/2，所用siRNA終濃度為80 nmol·L-1，RNAiMAX稀釋250倍使用；按比例配制Opti-MEM和RNAiMAX，靜置5 min；再按比例配置Opti-MEM 和siRNA，混合均勻后靜置15 min；然后逐滴加入到6 孔板中，6 h后換為新的DMEM完全培養基，繼續培養48 h。

1.3 RT-qPCR 檢測SK-N-BE（2）-M17 細胞敲低PPP1R14B后PPP1R14B mRNA表達水平

SK-N-BE（2）-M17 細胞轉染siRNA 后繼續培養48 h，用Trizol 法提取總RNA，再利用Prime-Script RT Master Mix 試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA，體系為RNA 500 ng，5×PrimeScript RT Mix 2 μL，DEPC 水補充至10 μL。然后按PowerUp SYBR Green Master Mix試劑盒說明書對PPP1R14BmRNA 進 行RT-qPCR 檢 測。PPP1R14B引 物 在PrimerBank 網站（https：//pga.mgh.harvard.edu/primerbank/）設計，序列為：GACGATGAGGGCCCAGTG（正向），TCCTCTTCCTGGCAGTCGTA（反向），由北京六合華大基因科技有限公司合成，PCR 產物為134 bp。GAPDH引物序列為CGAGATCCCTCCAAAATCAA（正向），TTCACACCCATGACGAACAT（反向）。PCR 體系為cDNA 0.5 μL，SYBR Green Master Mix 5 μL，正向和反向引物各0.5 μL，雙蒸水3.5 μL，總體積為10 μL。實驗條件為95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，共40 個循環。以GAPDH為內參對照，用2-ΔΔCt表示PPP1R14BmRNA相對表達水平。

1.4 Western 印跡法檢測SK-N-BE（2）-M17 細胞PPP1R14B敲低后PPP1R14B蛋白表達水平

SK-N-BE（2）-M17 細胞轉染siRNA 后繼續培養48 h，棄培養基，用PBS 洗2 遍，加入M2 裂解液（蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑臨用前加入），4 ℃混懸裂解30 min；15 000×g，4 ℃離心15 min；收集裂解液上清，加入等體積2×SDS蛋白電泳上樣緩沖液，沸水煮樣。將樣品用13% SDS-PAGE 進行電泳，轉膜2 h，將蛋白轉至PVDF 膜上。用含5%脫脂奶粉1×TBST 將PVDF 膜室溫封閉1 h，棄封閉液，依次加入兔抗人PPP1R14B 多克隆抗體（1∶1000）和小鼠抗α 微管蛋白單克隆抗體（1∶5000），4 ℃孵育過夜。次日，用1×TBST 洗膜3 次，每次5 min；加入相應二抗（1∶5000），室溫孵育1 h；再用1×TBST 洗膜3 次，每次5 min；取等量ECL 化學發光檢測試劑盒中的A 和B 液混合均勻，涂抹在PVDF 膜上，用醫用X 射線膠片在暗室中進行顯影，條帶深度表示待測蛋白表達水平。

1.5 Time-lapse 活細胞成像技術動態監測SK-NBE（2）-M17 GFP-H2B細胞有絲分裂進程

將SK-N-BE（2）-M17 GFP-H2B 細胞接種于8 孔腔室中，按1.2 siRNA 轉染方法分別轉染對照siRNA，PPP1R14BsiRNA #1 和#2；轉染6 h 后換為新鮮的DMEM完全培養基，繼續培養24 h；加入細胞周期同步化藥物胸苷（終濃度為2.5 mmol·L-1），同步化24 h 后棄含胸苷的培養基，用預熱的生理鹽水洗細胞5 次。將細胞釋放到正常的DMEM 培養基中，6 h 后用轉盤式共聚焦顯微鏡掃描各組細胞有絲分裂進程并采集圖像，共掃描16 h。掃描完成后用Volocity 軟件對各組細胞從有絲分裂期開始到染色體分離所經歷的時間及前中期和中期時間進行統計分析。

1.6 慢病毒體系構建PPP1R14B穩定敲低細胞系

根據PPP1R14B基因cDNA序列（NM_138689.3）和短發夾RNA（short-hairpin RNA，shRNA）設計原則，由北京擎科生物科技有限公司合成對照shRNA和2 條不同的靶向PPP1R14B基因的shRNA 序列，命名為shPPP1R14B#1 和#2。用酶切克隆方法構建含對照shRNA，shPPP1R14B#1 和#2 的慢病毒質粒，shRNA序列與siRNA相同（表1）。

慢病毒包裝：取狀態良好的HEK293T 細胞接種于10 cm 培養皿中（每皿2.5×106細胞），當細胞密度約60%時進行質粒轉染。分別將6 μg 目的質粒（分別含對照shRNA，shPPP1R14B#1或#2的目的質粒），4.5 μg psPAX2和1.5 μg pCMV-VSVG 包裝質粒，加到1 mL HBS 中混勻，然后加入67 μL CaCl2，混合均勻，靜置15 min；將混合液逐滴加入到HEK293T 細胞培養皿中，轉染6 h 后換成新的DMEM 完全培養基，繼續培養。轉染48 h 后第1次收集病毒上清，換液后于72 h 再次收集病毒上清。將2 次收集的病毒上清混合，2000×g離心10 min，取上清用0.45 μm 微孔濾器過濾；濾液中加入病毒濃縮液4 ℃過夜，4000×g低溫離心30 min 后棄上清，將病毒沉淀用1 mL 冰PBS 重懸、分裝，獲得分別含對照shRNA，shPPP1R14B#1和#2的慢病毒，置-80 ℃冰箱保存備用。

慢病毒感染SK-N-BE（2）-M17 細胞：將SK-NBE（2）-M17 細胞接種于10 cm 培養皿中，當細胞密度約50%時，每皿加入300 μL PBS 病毒重懸液，置培養箱中培養。培養48 h 后加入嘌呤霉素（終濃度2 mg·L-1）進行篩選，篩選5～7 d 后獲得穩定敲低PPP1R14B 的SK-N-BE（2）-M17 細胞。Western印跡法檢測PPP1R14B蛋白表達水平。

1.7 克隆形成實驗檢測穩定敲低PPP1R14B 的SK-N-BE（2）-M17細胞克隆形成數

將穩定敲低PPP1R14B 的SK-N-BE（2）-M17細胞及對照敲低細胞，以每孔800 細胞接種于6 孔板中，每3 d 換培養基1 次，連續培養14 d；最后棄培養基，PBS 洗1 次；4%多聚甲醛固定10 min，PBS 洗1次；結晶紫染色15 min，用水洗去多余的染色液，室溫晾干，拍照，計算每組細胞克隆形成數。

1.8 GEO 數據庫分析神經母細胞瘤中PPP1R14B表達水平及其與預后的關系

從GEO（Gene Expression Omnibus）數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）（2021 年1 月）下載NB數據集GSE49711，分析在不同分期（1期、2期、3期、4期和4S期）NB中PPP1R14B表達水平及其與患者預后的相關性。

1.9 統計學分析

實驗結果數據用±s表示，用GraphPad Prism 8.0 統計學軟件對數據進行分析。兩組間比較采用t檢驗（符合正態分布）或秩和檢驗（不符合正態分布）方法分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染siRNA對SK-N-BE（2）-M17細胞PPP1R14B敲低效果

RT-qPCR（圖1A）和Western 印跡法（圖1B）結果顯示，與轉染對照siRNA 的SK-N-BE（2）-M17細胞相比，轉染PPP1R14BsiRNA#1 和#2 的SK-N-BE（2）-M17 細 胞PPP1R14B mRNA（P＜0.01）和蛋白表達水平均明顯降低，表明該2條siRNA序列均可有效敲低SK-N-BE（2）-M17 細胞中PPP1R14B表達。

Fig.1 Knockdown effect of PPP1R14B in SK-N-BE（2）-M17 cells transfected with PPP1R14B siRNA #1 and #2，respectively. A：PPP1R14B mRNA expression detected by RT-qPCR；B：PPP1R14B protein expression detected by Western blotting.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with control siRNA group.

2.2 轉染siRNA敲低PPP1R14B導致SK-N-BE（2）-M17 GFP-H2B細胞有絲分裂期阻滯

在SK-N-BE（2）-M17 GFP-H2B 細胞中轉染PPP1R14BsiRNA #1 或#2 敲低PPP1R14B，轉染30 h 后加入胸苷，24 h 將細胞阻滯在G1/S 期，隨后將細胞釋放6 h 到G2期，最后采用Time-lapse 活細胞成像技術動態檢測各組細胞有絲分裂進程（圖2A）。結果如圖2B 所示，轉染對照siRNA 組SK-NBE（2）-M17 GFP-H2B細胞從核膜破裂到后期姐妹染色單體分離共持續45 min，而轉染siPPP1R14B#1組延長到60 min，siPPP1R14B#2組延長到65 min。統計分析結果（圖2C）顯示，與轉染對照siRNA 組相比，轉染PPP1R14BsiRNA#1 和#2 組細胞平均分離持續時間明顯延長（P＜0.05，P＜0.01）。以上結果表明，敲低PPP1R14B 導致SK-N-BE（2）-M17 GFP-H2B細胞有絲分裂期阻滯。

Fig.2 Effect of PPP1R14B knockdown by siRNA transfection on mitosis in SK-N-BE（2）-M17 GFP-H2B cells by time-lapse living cell imaging technique. A：the synchronization process of time-lapse；B：time-lapse images of SK-N-BE（2）-M17 GFP-H2B cells transfected with control siRNA，PPP1R14B siRNA #1 or PPP1R14B siRNA#2，and the numbers meant the time after nuclear envelope breakdown；C：the separation duration time.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control siRNA group.

2.3 轉染siRNA敲低PPP1R14B導致SK-N-BE（2）-M17 GFP-H2B細胞有絲分裂前中期時間延長

對SK-N-BE（2）-M17 GFP-H2B 細胞有絲分裂前中期和中期時間進行統計分析結果（圖3）顯示，與轉染對照siRNA組相比，轉染PPP1R14BsiRNA#1和#2 組細胞前中期時間明顯延長（P＜0.01），而中期時間縮短（P＜0.05），表明敲低PPP1R14B 使SK-N-BE（2）-M17 GFP-H2B 細胞有絲分裂前中期時間延長，從而導致細胞有絲分裂期阻滯。

Fig.3 Effect of PPP1R14B knockdown by siRNA transfection on mitotic time in SK-N-BE（2）-M17 GFP-H2B cells detected by time-lapse living cell imaging technique.See Fig.2A for the cell treatment.±s，n=60 cells.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control siRNA group.

2.4 shRNA穩定敲低PPP1R14B抑制SK-N-BE（2）-M17細胞克隆形成

Western 印跡法結果（圖4A）顯示，與轉染對照shRNA 組相比，轉染shPPP1R14B#1 或#2 組SK-N-BE（2）-M17 細胞PPP1R14B 蛋白表達水平明顯降低，表明靶向PPP1R14B 的該2 條shRNA均可有效敲低PPP1R14B 表達。克隆形成實驗結果（圖4B1 和B2）顯示，轉染shPPP1R14B#1 或#2組SK-N-BE（2）-M17細胞克隆形成數亦明顯少于轉染對照shRNA 組（P＜0.01），表明敲低PPP1R14B可抑制SK-N-BE（2）-M17細胞生長。

Fig.4 Effect of PPP1R14B knockdown by short-hairpin RNA（shRNA）transfection on cell growth in SK-NBE（2）-M17 cells. Lentiviruses containing control shRNA，shPPP1R14B#1 or #2 were transfected into SK-N-BE（2）-M17 cells，respectively. A：the knockdown efficiency of PPP1R14B detected by Western blotting；B1：number of cell colonies detected by colony formation test；B2 was the quantitative result of B1.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with control shRNA group.

2.5 PPP1R14B 表達水平與NB 惡性程度呈正相關，與預后呈負相關

通過分析NB 數據集GSE49711 發現，在1，2，3 和4 期NB 中PPP1R14B表達逐漸升高（圖5A），表明NB 惡性程度越高，PPP1R14B表達水平越高。生存期分析表明，PPP1R14B表達低的患者生存率明顯高于其表達高的患者（圖5B），表明PPP1R14B表達水平越高，NB 患者預后越差。由此表明，PPP1R14B表達水平與NB 惡性程度呈正相關，與患者預后呈負相關。

Fig.5 Expression of PPP1R14B in neuroblastoma（NB）and its relationship with prognosis by NB database GSE49711 analysis. A：differential expressions of PPP1R14B in different International Neuroblastoma Staging System（INSS）stages of NB. The stage 4S especially refers to patients under 1 year old.±s，n=121（stage 1），78（stage 2），63（stage 3），183（stage 4），53（stage 4S）. B：the relationship between PPP1R14B expression and survival probability of NB patients.n=125.

3 討論

本研究利用siRNA 技術在NB 細胞SK-N-BE（2）-M17 中敲低PPP1R14B，加入胸苷將細胞阻滯在G1/S 期，接著將細胞釋放到G2期，最后采用Time-lapse 活細胞成像技術動態監測敲低PPP1R14B 對細胞有絲分裂進程的影響。結果表明，敲低PPP1R14B可導致SK-N-BE（2）-M17細胞有絲分裂期時間延長。為探究PPP1R14B 調控的有絲分裂期具體階段，本研究進一步研究發現，敲低PPP1R14B 導致SK-N-BE（2）-M17 細胞有絲分裂前中期時間明顯延長，中期時間略有縮短。同時還發現，PPP1R14B 敲低組細胞的染色體不能整齊排列到中期赤道板上，從而導致姐妹染色單體錯誤分離。由此推測，很可能是敲低PPP1R14B 導致染色體在一定時間內不能整齊排列到赤道板上（中期開始），而細胞又不能很長時間阻滯在前中期，因此姐妹染色單體被迫快速分離即中期時間縮短，最終導致染色體錯誤分離。

有絲分裂期各時相必須按一定規則進行，各時相時間或長或短均有可能引起有絲分裂期進程紊亂。已知有絲分裂期紊亂往往導致細胞增殖異常。本研究分別將靶向PPP1R14B 的shPPP1R14B#1或#2轉染SK-N-BE（2）-M17 細胞穩定敲低PPP1R14B。克隆形成實驗結果表明，穩定敲低PPP1R14B 明顯抑制SK-N-BE（2）-M17 細胞克隆形成，提示PPP1R14B 在NB 細胞增殖過程發揮重要作用。

據報道，PPP1R14B 在細胞有絲分裂期發生磷酸化［14］。本研究通過NB數據集GSE49711分析發現，PPP1R14B表達水平與NB 惡性程度呈正相關，與患者預后呈負相關。因此推測，PPP1R14B 可能通過調控細胞周期參與NB發生發展。

綜上所述，敲低PPP1R14B導致SK-N-BE（2）-M17 細胞有絲分裂期阻滯和生長減慢，PPP1R14B在NB 發生發展中發揮重要作用。PPP1R14B 是NB 細胞有絲分裂的新調控子，有可能是NB 治療的潛在新靶標。PPP1R14B 是否通過發生磷酸化來調控NB 有絲分裂期、哪種激酶使其發生磷酸化及PPP1R14B 調控NB 細胞有絲分裂期進程的具體分子機制尚待進一步探索。