硅沉著病患者和實驗模型動物不同生物樣本中氧化應激生物標志物及其應用研究進展

唐 蒙，劉 靜，曾 明

（1.中南大學湘雅公共衛生學院衛生毒理學系，湖南 長沙 410078；2.嘉興市桐鄉市疾病預防控制中心，浙江 嘉興 314599；3.重慶市九龍坡區疾病預防控制中心，重慶 400050）

地殼中含有約12%游離二氧化硅（SiO2），采石場、隧道和陶器行業等工人由于長期暴露于含量較高的粉塵（矽塵）中而容易發生硅沉著?。ㄎ危?］。硅沉著病是我國最常見職業病之一，每年新增硅沉著病病例＞2萬例［2］。然而在世界范圍內，硅沉著病預防并不理想，缺乏有效治療方法，嚴重威脅從業者的健康［3］。

硅沉著病是一種以慢性肺部炎癥和肺間質纖維化為特征的致命性疾病，其發生被認為與SiO2粉塵引起的氧化應激有關。SiO2粉塵誘發肺損傷的機制包括直接細胞毒性、氧化應激相關酶失衡以及炎癥和纖維化細胞因子釋放等［4-5］?？寡趸瘎┖涂寡趸甘欠慰寡趸烙到y的主要成分，主要包括小分子抗氧化劑如谷胱甘肽（glutathione，GSH）和維生素C（vitamin C，VC）等及抗氧化酶如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）等。與其他器官相比，肺極易受氧化應激影響［6］。SiO2粉塵可促使肺細胞內產生活性氧（reactive oxygen species，ROS），使肺組織抗氧化防御系統受損，導致細胞損傷［7-8］。當SiO2顆粒到達肺泡時，一方面可致膜脂過氧化，破壞細胞膜；另一方面可沉積在肺泡內，被巨噬細胞攝取，通過產生ROS啟動氧化應激［9-10］。

鑒于氧化應激在硅沉著病中的重要作用，本文對SiO2粉塵接觸者和實驗模型動物的不同生物樣本，如血液、尿液、肺組織、呼出氣體及支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中氧化應激生物標志物的類型、各自優點和局限性及對硅沉著病發生發展的治療和診斷價值等進行綜述。

1 血液和尿液中的氧化應激標志物

正常情況下，機體內氧化/抗氧化系統處于動態平衡狀態，但SiO2粉塵暴露可直接導致機體氧化失衡。一種解釋硅沉著病發病機制的自由基理論認為，肺泡巨噬細胞吞噬SiO2粉塵后，釋放大量自由基和ROS［11］。當釋放的自由基未完全被清除時，將增強機體內部脂質過氧化，損害肺結構［12］。ROS在硅沉著病發展中起至關重要作用［7］。除直接引起組織毒性，還可引起DNA氧化損傷導致8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG）生成增加。8-OHdG 是一種氧化性加合物，由DNA 分子中鳥嘌呤堿基第8位碳原子被羥自由基或單線態氧等攻擊時產生。Sato等［13］發現，在硅沉著病模型小鼠中，血漿8-OHdG 水平在SiO2暴露后1～12 周內升高。Pilger 等［14］采集了接觸過石英（主要成分是SiO2）工人的血樣和尿樣，發現高粉塵暴露的工人外周血白細胞DNA中存在更高的8-OHdG 水平，反映SiO2粉塵暴露后機體氧化/抗氧化系統失衡。

SiO2粉塵的暴露可通過肺部脂質過氧化誘導氧化應激［15］。硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substance，TBAR）是衡量脂質過氧化的一個重要指標。Scalia 等［16］測量了目前或以前暴露于SiO2粉塵的工人和一組非暴露受試者血漿中TBAR，發現矽塵接觸者血漿中TBAR 增加且顯著高于未接觸組，表明較高水平的TBAR 與SiO2粉塵接觸史有關。而另一種脂質過氧化物丙二醛（malondialdehyde，MDA）常與體內一些抗氧化酶一起被用來評價體內的氧化應激水平。Zhang等［17］檢測發現，硅沉著病患者血清中SOD、MDA 和GSH 水平明顯高于非硅沉著病對照者。SOD 活性和GSH水平升高可能反映一種代償機制的激活，以應對硅沉著病患者ROS 生成水平增加，而MDA 水平升高則表明硅沉著病患者脂質過氧化水平增加。接觸高濃度SiO2粉塵的硅沉著病患者SOD 活性也比非接觸者高［18］。與非接觸者相比，中國接觸SiO2粉塵工人中硅沉著病患者血清MDA水平和SOD活性均升高［19］。但涉及SiO2粉塵暴露和氧化生物標志物的研究也有矛盾的結果。有研究顯示，與對照組相比，在土耳其陶瓷業接觸SiO2粉塵工人血清中MDA 水平升高，SOD 活性降低［15］。與之不同的結果顯示，正暴露于SiO2粉塵的個體血漿SOD 活性降低，且與病情嚴重程度密切相關。造成以上不一致結果的原因可能與暴露因素有關，如粉塵顆粒分布、暴露強度和暴露時間以及疾病的持續時間和嚴重程度等。

硫醇/二硫化物穩態與機體內氧化狀態有關，可作為氧化應激的一個重要指標。通過評估血清中硫醇/二硫化物的動態平衡反映接觸SiO2粉塵工人體內的氧化還原狀態，發現接觸SiO2粉塵工人患者血清二硫化物水平明顯高于對照組；此外，接觸SiO2粉塵工人血清中二硫化物與天然硫醇的比值和二硫化物與總硫醇的比值也高于對照組［19］，表明在接觸SiO2粉塵工人體內的氧化失衡是SiO2粉塵誘導的氧化應激的結果。

血紅素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）是評估氧化應激的生物標志物［20］。Sato等［13］發現，硅沉著病患者血清HO-1 水平明顯高于慢性阻塞性肺病患者和對照組，其中呼吸功能輕度受損的硅沉著病患者血清HO-1水平最高，與8-OHdG水平呈顯著負相關。有研究表明，HO-1有助于保護宿主免受某些炎癥疾病的影響，在硅沉著病模型小鼠中HO-1的誘導劑氯化血紅素可抑制炎癥反應，而HO-1的抑制劑鋅原卟啉可增強炎癥反應［13］。HO-1作為ROS的重要清除劑之一，上調HO-1可能是治療硅沉著病的一種新策略。

Nardi等［21］測定未接觸過SiO2粉塵的工人和接觸SiO2粉塵但未被診斷為硅沉著病的工人血清中VC水平。結果顯示，有接觸史者血清VC水平顯著降低，表明SiO2粉塵誘導氧化應激的發生，這可能是因為VC可與SiO2粉塵暴露期間產生的活性物質，如超氧陰離子、過氧化氫、羥基自由基和單線態氧發生反應。此外，對MDA 和VC進行相關性分析發現，MDA 水平與VC水平呈負相關，同時VC水平與C 反應蛋白水平也呈負相關，表明氧化應激可能參與SiO2粉塵刺激的炎癥反應［22］。

綜上所述，對SiO2粉塵接觸者和實驗模型動物的血液和尿液標志物研究提示，升高的8-OHdG、TBAR、MDA、SOD、GSH、二硫化物和HO-1水平及降低的VC水平均可表明機體內發生氧化應激，這些指標被廣泛用于評估SiO2粉塵暴露后機體內氧化/抗氧化水平，盡管結果可能存在差異，但具有重要的臨床意義。與呼氣冷凝物、痰液或呼吸氣體不同，血液和尿液中氧化應激生物標志物的測定在重復性和靈敏度方面具有顯著優勢，但與局部組織中的生物標志物濃度相比，也具有與臨床相關性不高的問題。

2 肺組織中的氧化應激標志物

對硅沉著病組織的研究有助于理解氧化應激相關蛋白網絡和分子間相互作用參與硅沉著病發生發展的具體機制。Sato 等［13］在硅沉著病患者、肺癌患者、硅沉著病尸檢對象和對照組的手術標本中發現，肺內吸入的SiO2粉塵與病變肺部中HO-1表達相關，硅沉著病組HO-1陽性細胞數明顯高于對照組。硅沉著病模型小鼠整個病程中，隨疾病的進展，HO-1在肺組織中的表達逐漸增加。HO-1在硅沉著病患者肺部病變中持續表達，可能是因為SiO2粉塵的暴露誘導ROS增加，從而導致血清HO-1水平升高。

核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）是內源性抗氧化防御的關鍵調節因子，調控抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）介導的抗氧化基因的轉錄，并保護細胞免受由ROS 累積造成的氧化應激［23］。Zhao 等［24］用抗氧化小鼠LiasH/H小鼠（通過高表達內源性抗氧化劑α-硫辛酸提高自身抗氧化能力）和野生型小鼠研究硅沉著病的發病機制，發現暴露于SiO2粉塵后，LiasH/H小鼠肺組織Nrf2 蛋白水平高于野生型小鼠；而肺組織Nrf2 免疫組織化學分析顯示，野生型小鼠間質纖維化區和硅沉著病結節中Nrf2蛋白表達明顯低于LiasH/H小鼠；與野生型小鼠相比，SiO2粉塵混懸液滴注后的LiasH/H小鼠肺組織中Nrf2、CAT和線粒體內SOD2mRNA 表達均增加。上述結果表明，LiasH/H小鼠可能通過Nrf2信號通路降低SiO2誘導的氧化應激，使肺組織中Nrf2相關抗氧化酶表達增加，減輕SiO2粉塵誘導的肺纖維化。

Deng 等［25］和Suh 等［26］認為，α-硫辛酸可通過上調蛋白激酶B（protein kinase，Akt）磷酸化誘導Nrf2 向細胞核轉移并增加HO-1 表達。比較硅沉著病模型組和對照組大鼠Nrf2/ARE 信號通路分子的變化，發現與對照組大鼠相比，模型組大鼠肺組織中Nrf2和ARE 表達明顯增加［27］。在機體保持氧化/抗氧化動態平衡時，Nrf2 并不會被活化。當受到大量自由基和ROS刺激時，氧化和抗氧化系統之間的平衡被打破，Nrf2 可進入細胞核并與ARE 結合，進而激活下游多種抗氧化基因，從而發揮抗氧化作用［28-29］?？寡趸瘎┨}卜硫素可使硅沉著病模型大鼠肺組織中Nrf2 和ARE 表達升高［27］，進一步表明Nrf2 信號通路調節在抑制SiO2粉塵誘導的氧化應激中起重要作用。

肺組織中MDA、總氮氧化物（total oxides of nitrogen，NOχ）、還原型GSH和CAT的活性等常被用來評價氧化應激狀態。通過大鼠鼻腔滴注SiO2粉塵懸濁液建立硅沉著病大鼠模型，發現SiO2粉塵暴露使大鼠肺組織中MDA 和NOχ含量分別增加約3.3 和2.6 倍，同時肺組織GSH 含量和CAT 活性分別下降51%和60%［30］。硅沉著病的進展伴隨著明顯的組織病理改變，氧化應激反應明顯增強，從而使肺組織乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性、MDA 和NOχ 含量、GSH 濃度和CAT活性均出現異常。

肺組織中HO-1 和Nrf2 表達水平增加、MDA 和NOχ含量上升以及GSH含量和CAT活性下降均可提示肺內氧化/抗氧化失衡，可作為評價硅沉著病嚴重程度和機體氧化應激水平的潛在生物標志物。肺組織活檢的主要優點是直接對肺實質進行取樣，可保持肺組織結構成分的空間關系并清楚地識別發生氧化應激的組織區域，進一步確定肺損傷部位，有助于研究硅沉著病發展進程中的確切機制，但其侵襲性和創傷性限制了患者的接受程度，在未明確診斷時，可采用侵入性較小的方式對患者進行肺組織活檢。

3 呼出氣體中的氧化應激標志物

在呼出氣體及呼氣冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）中已檢測到幾種可用于評價硅沉著病患者氧化應激狀態的介質，但可能會有多種因素影響其測量，其中一個重要限制是呼出氣體中測量的介質濃度很低，可能會顯著增加測量誤差。Mahdi 等［31］對接觸過SiO2粉塵工人的呼出氣體中揮發性有機化合物（volatile organic compounds，VOC）進行分析，發現這些化合物濃度增加與體內氧化應激發展有關［32］；SiO2接觸組工人呼出氣體中VOC 的平均峰面積明顯高于健康志愿者組，提示接觸SiO2粉塵工人和硅沉著病患者的呼氣特征與對照組不同，VOC有可能作為接觸SiO2粉塵的氧化應激生物標志物。

EBC 被認為是反映肺內生物過程的物質，可用于肺部疾病的診斷和預后評估［33-34］。EBC 中8-異前列腺素F2α（8-iso-prostaglandin F2α，8-iso-PGF2α）、4-羥基-2-壬烯（4-hydroxy-2-nonenal，HNE）和MDA 等是反映氧化應激狀態的重要指標。Daniela 等［35］采用液相色譜-電噴霧電離-串聯質譜法測定患者（石棉肺和硅沉著?。┡c健康志愿者EBC、血漿和尿液中8-iso-PGF2α，HNE 和MDA 含量。結果表明，兩組患者EBC 中8-iso-PGF2α 水平均較高，與尿中8-iso-PGF2α 的變化趨勢一致；在所有受試者中，8-iso-PGF2α 在EBC 中的水平與尿液和血漿水平相關，表明它們可能具有潛在的替代作用。另有研究顯示，硅沉著病患者EBC 中8-iso-PGF2α平均水平明顯高于對照組，矽塵暴露濃度與8-iso-PGF2α 水平呈正相 關［36］。EBC 中8-iso-PGF2α對應于肺中的氧化應激過程，不受系統性疾病、藥物和飲食因素的影響，是氧化應激最重要的生物標志物之一［36］。對這種在自由基催化反應中產生的花生四烯酸衍生物進行分析，是評估由SiO2粉塵引起的疾病的一種有前途的非侵入性手段。

EBC 中氧化應激標志物的定量也可通過測量HNE 來評估。研究顯示，排除受試者全身性疾病的顯著影響，石棉肺和硅沉著病患者EBC和尿中HNE均較高，其中硅沉著病患者EBC中HNE水平的升高具有顯著性［35］。目前暫未發現任何疾病過程或治療作用顯示與EBC中HNE水平具相關性，因此可認為HNE是一個可用于檢測肺部疾病的氧化應激標志物。

呼出氣體及EBC中氧化應激標志物的測量有助于更好地了解硅沉著病的發病機制，監測暫時無法治愈的肺部疾病的活動性。呼出氣體中VOC 以及EBC 中8-iso-PGF2α 和HNE 均有可能作為接觸矽塵的氧化應激生物標志物。然而對EBC成分的分析尚未成為臨床上診斷和治療硅沉著病的金標準，仍需克服呼出的水蒸氣中呼吸液滴被稀釋及與EBC中存在的呼吸液滴產生位置的不確定性。但由于呼吸液滴在EBC中所占比例＜0.01%，傳統的酶聯免疫吸附實驗無法準確測量，需采用更靈敏的方法。

4 BALF中的氧化應激生物標志物

BALF 是一種用于診斷、治療和研究的重要介質，可評估肺泡和支氣管腔內液體的細胞和非細胞成分。BALF 雖是一種侵入性方法，但耐受性良好且較安全［37］。8-iso-PGF2α 和羥十八碳二烯醇（hydroxyectadecadienol，HODE）已被認為是體內脂質過氧化的生物標志物，并有相關文獻報道了這些生物標志物與各種疾病的關系。Fukui 等［38］采用液相色譜-串聯四極桿質譜聯用法測定SiO2粉塵暴露后BALF 中8-iso-PGF2α 和HODE 含量，發現BALF中HODE濃度在暴露SiO2粉塵24 h后顯著增加，約72 h 后降至對照水平。在檢測到脂質過氧化作用增強的同時，BALF中HO-1濃度在暴露SiO2粉塵后24 h升高，72 h恢復到基線水平。與之不同的是，有學者發現SiO2粉塵的暴露顯著降低大鼠BALF 中HO-1 和Nrf2 水平［39］。造成這種差異的原因可能是由矽塵暴露時間不同，后者矽塵暴露時間更長，而前者只研究了暴露早期的變化。Nrf2 介導的對抗氧化應激的防御機制已被闡明。當暴露于氧化應激時，Nrf2 會被釋放并移位到細胞核中，刺激細胞保護蛋白如HO-1表達［40］。

采用SiO2粉塵氣管滴注染毒大鼠7 d，與對照組比較，暴露于SiO2粉塵導致BALF 中相對穩定的代謝物亞硝酸鹽水平和總抗氧化力顯著升高，并隨SiO2濃度增加而顯著增加［41］。而在脫蛋白的BALF中未發現抗氧化能力的差異，表明所有提供抗氧化能力的物質均為BALF 的蛋白質成分，而這可能是造成測量結果具有可變性的重要因素之一。

綜上所述，矽塵刺激能誘導BALF 中8-iso-PGF2α、HODE、H2O2和亞硝酸鹽含量增加，Nrf2 表達水平下降及總抗氧化能力增強，但矽塵暴露時間不同可能會導致BALF 中HO-1 水平存在差異。BALF 中生物標志物的定量，特別是當樣本量有限時，具有一定挑戰。但BALF中生物標志物的檢測技術正不斷發展，同時現有的檢測方法也得到了適當標準化，這為硅沉著病評估和監測提供了替代選擇。

5 結語

硅沉著病是一種公認的與氧化應激相關的疾病，發病機制依賴于反復慢性細胞損傷及其觸發的肺內纖維化和氧化失衡。氧化應激對細胞外基質的重要性及其如何改變肺間質纖維化的細胞反應，仍有待闡明。不同來源生物樣本中多種氧化應激生物標志物水平與硅沉著病發生發展相關，這些標志物能在病變早期更快出現明顯改變，可能是區分矽塵暴露狀態、硅沉著病發生和疾病嚴重性的重要候選指標，為識別潛在生物標志物并應用于臨床實踐提供新途徑。在硅沉著病發生發展過程中，這些標志物可預測抗氧化治療的療效，對評估和監測患者病情有重要用途，有助于在SiO2粉塵暴露和硅沉著病之間建立更精確的劑量反應關系，為設定職業暴露限值提供參考。