丙戊酸和2-己基-4-戊炔酸對乳腺癌易感基因2失活的成纖維細胞放射增敏作用及其機制

韓永濤，蔡祖超，鳳志慧

（山東大學齊魯醫學院 1.齊魯醫院藥劑科，2.公共衛生學院職業衛生與職業醫學系，山東 濟南 250000；3.浙江大學醫學院附屬口腔醫院，浙江 杭州 310000）

放射治療作為目前常用的腫瘤臨床治療手段，常出現放射抗性和全身性不良反應，極大地降低放射治療功效。放射增敏劑既能增加放射治療的敏感性，還可有效避免放射治療過程中產生的全身性不良反應。因此，尋找安全有效的放射增敏劑已成為目前腫瘤放射治療領域的一項重大課題。

丙戊酸（valproate，VPA）是臨床上常用的抗癲癇病藥物，2-己基-4-戊炔酸（2-hexyl-4-pentynoic acid，HPTA）為其衍生物之一。VPA 和HPTA 均為組蛋白去乙酰化酶抑制劑，HPTA 的IC50比VPA（348～448 μmol·L-1）低，僅為11～15 μmol·L-1［1-2］，提示HPTA 可能是更加高效的VPA 替代物。本課題組在動物和細胞水平研究表明，VPA 和HPTA 對腫瘤組織或細胞具有放射增敏作用［2-10］，兩者作為DNA 損傷修復抑制劑，可靶向泛素連接酶RFWD3促進重組酶Rad51泛素化，降低Rad51蛋白表達，抑制DNA雙鏈斷裂（DNA double strand breaks，DSB）損傷修復的同源重組（homologous recombination，HR）。HR是一種準確無誤的DNA損傷修復形式，乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene1，BRCA1）和重組酶Rad51 是HR 修復的關鍵酶，其功能狀態直接影響DNA損傷修復及基因組的穩定性。BRCA2 也可通過與Rad51 特異性結合募集Rad51 到DNA DSB 區 域，調控Rad51 參與HR 修復［11-12］。BRCA1 和BRCA2 可共存于一個蛋白復合物，提示BRCA1 可能調控BRCA2 和Rad51參與HR 的修復［13-14］。雖然BRCA2 在HR 調控中具有重要的作用，但在BRCA2失活的EUFA423 成纖維細胞中也檢測到IR所誘導的Rad51焦點形成，表明Rad51 亦參與HR 修復［15］。由此推測，VPA 和HPTA 作為DNA 損傷修復抑制劑，也可能影響BRCA2失活的EUFA423 細胞對放射的敏感性。為此，本研究應用BRCA2雙等位基因失活的EUFA423細胞，探討VPA和HPTA對其放射敏感性的影響，為其應用于臨床腫瘤放射治療提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

EUFA423 細胞（Dana-Fabar Cancer Institute Alan D D′Andrea 博士饋贈）。彗星實驗試劑盒（美國Invitrogen 公司）；DAPI 染液（美國Genecopoeia 公司）；VPA、HPTA、結晶紫和小鼠抗兔磷酸化組蛋白（phosphorylated histone，γH2AX）抗體（一抗）（美國Sigma公司）；小鼠抗兔BRCA1抗體和兔抗小鼠Rad51 抗體（一抗）（美國Santa Cruz 公司）；兔抗小鼠53BP1抗體（一抗）（美國GeneTex公司）；GAPDH 抗體（一抗）（中國中杉金橋公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒和辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（H+L）抗體（二抗）（美國Thermo Fisher公司）；Alex-arFlour488熒光標記雞抗兔IgG抗體和ALex-arFlour594 熒光標記山羊抗小鼠IgG 抗體（二抗）（美國Molecular Probe 公司）。X-RAD225 OptiMAX 型X 射線輻照儀（美國PXi 公司）；IX71型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 細胞克隆形成實驗檢測細胞增殖能力

取生長狀態良好的EUFA423 細胞，按每皿細胞總數2×103接種于p60培養皿中。實驗分為電離輻射（ionizing radiation，IR）0（細胞對照），2，4 和6 Gy組，VPA+IR 0，2，4 和6 Gy 組（VPA 預處理24 h 后進行IR）和HPTA+IR 0，2，4 和6 Gy 組（HPTA 預處理24 h 后進行IR），每組3 平行樣。VPA 和HPTA濃度分別為500和15 μmol·L-1，選擇依據為本課題組前期研究結果［1-4，8-9］。X射線劑量率為2.25 Gy·min-1，2，4和6 Gy照射時間分別為0.89，1.78和2.67 min。IR 處理結束后30 min 各組進行細胞克隆形成實驗［8］，14 d后觀察到明顯的細胞克隆形成，計數各組細胞克隆形成數目，并計算細胞克隆形成率。細胞克隆形成率（%）=克隆形成數/接種細胞數×100%。

1.3 中性和堿性彗星實驗檢測DNA雙鏈斷裂損傷

取生長狀態良好的EUFA423 細胞，按每皿細胞總數3×104接種于p35 培養皿中，實驗分為細胞對照、VPA、HPTA、IR 對照、VPA+IR 和HPTA+IR組，每組3 平行樣。IR 劑量為8 Gy，照射時間為3.56 min。VPA 和HPTA 濃度及處理同1.2。照射后0，30 和60 min，各組進行中性和堿性彗星實驗［8］。Cometscore 軟件分析細胞核拖尾長度和DNA DSB 百分率。DNA DSB 百分率（%）=實驗組彗星拖尾長度/細胞對照組彗星拖尾長度×100%。

1.4 免疫熒光實驗檢測EUFA423 細胞中γH2AX，53BP1，BRCA1和Rad51蛋白焦點形成

取生長狀態良好EUFA423 細胞，按每孔細胞總數2×104接種于8 孔載玻片小室內，分組和處理同1.3。IR 處理結束后恢復6 和24 h，免疫熒光法檢測EUFA423 細胞中γH2AX，53BP1，BRCA1 和Rad51 蛋 白 焦 點 形 成［2，8］，小 鼠 抗 兔γH2AX 和BRCA1 抗體稀釋倍數分別為1∶500 和1∶100，兔抗小鼠Rad51 和53BP1 抗體稀釋倍數為1∶100 和1∶1000。免疫熒光顯微鏡下觀察并計數500 個細胞中γH2AX，53BP1，BRCA1 和Rad51 蛋白焦點陽性細胞數。每細胞內焦點數＞20的細胞為目的蛋白陽性細胞。

1.5 Western印跡法檢測EUFA423 細胞中γH2AX，53BP1，BRCA1和Rad51蛋白表達水平

取生長狀態良好的EUFA423 細胞，按1.3 分組處理。IR 處理結束后6 h，RIPA 裂解各組細胞，離心取上清液；BCA 法檢測蛋白質濃度。每組上樣量為60 μg，進行SDS-PAGE 電泳；轉印至PVDF膜，BSA 封閉后加入對應的一抗（稀釋倍數為γH2AX：1∶500，53BP1：1∶1000，BRCA1：1∶200，Rad51：1∶500，GAPDH：1∶2000），4 ℃孵育過夜；TBST 洗3 次后加入相應二抗（1∶2000），室溫孵育1 h；TBST再次洗3次后進行ECL顯影。用Image J軟件分析蛋白條帶積分吸光度，以目標蛋白與內參蛋白積分吸光度比值表示目標蛋白相對表達水平。

1.6 統計學分析

實驗結果數據以±s表示，采用SPSS23.0 軟件進行多樣本比較，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）或多因素方差分析（two-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 VPA和HPTA增加EUFA423細胞放射敏感性

細胞克隆形成實驗結果（圖1）顯示，與細胞對照組比較，VPA 和HPTA 對未照射EUFA423 細胞生長均無明顯影響；給予EUFA423 細胞IR 4 和6 Gy 處理后，與同劑量IR 對照組比較，VPA+IR 和HPTA+IR 組細胞克隆形成率均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），但VPA+IR 和HPTA+IR 兩組之間無明顯差異。由此表明，VPA 500 μmol·L-1及其衍生物HPTA 15 μmol·L-1對EUFA423 細胞具有相似的放射增敏作用，也表明較低濃度的HPTA 即能顯示顯著的放射增敏作用。

Fig.1 Effect of valproate（VPA）and 2-hexyl-4-pentynoic acid（HPTA）on radiosensitivity in EUFA423 cells by clone formation assay. The cells were divided into ionizing radiation（IR）0（cell control），2，4 and 6 Gy groups，VPA+IR 0，2，4 and 6 Gy groups（cultured with VPA 500 μmol·L-1 for 24 h before IR），and HPTA+IR 0，2，4 and 6 Gy groups（cultured with HPTA 15 μmol·L-1 for 24 h before IR）. B was the quantitative analysis result of A. Colony-forming efficiency（%）=number of clone formation/number of inoculated cells×100%.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with corresponding dose of IR control group.

2.2 VPA和HPTA增加EUFA423細胞中lR誘導的DNA損傷蓄積

堿性彗星實驗結果（圖2A1）提示，與相應未照射組相比，IR 各組（IR 后0，30 和60 min）胞核拖尾長度顯著增加，但隨時間延長增加的胞核拖尾長度逐漸縮短，表明IR 可誘導EUFA423 細胞產生明顯的DNA DSB 損傷。圖2A2 結果顯示，與同時間IR對照組相比，照射后0，30 和60 min，VPA+IR 組DNA DSB 百分率均顯著增加到IR 對照組的1.41，1.52和1.83倍（P＜0.01），HPTA+IR 組增加到1.41，1.54 和1.87 倍（P＜0.01）。中性彗星實驗也觀察到相似的結果（圖2B）。

Fig.2 Effect of VPA and HPTA on DNA double strand breaks（DSB）in response to radiation in EUFA423 cells by alkaline comet assay（A），neutral comet assay（B），immunofluorescence assay（C）and Western blotting（D）.See Fig.1 for the cell treatment.IR control，VPA+IR and HPTA+IR groups were treated with IR 8 Gy.Percentage of DNA DSB（%）=Comet tailing length in the experimental group/comet tailing length in the cell control group×100%. γH2AX：phosphorylated histone；IA：integrated absorbance. A2 and B2 were the quantitative analysis results of A1（×200）and B1（×200），respectively；C2 and C3 were the quantitative analysis results of C1（×1000）；D2 and D3 were the semi-quantitative analysis results of D1.±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with corresponding no IR group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with corresponding IR control group.

細胞免疫熒光實驗結果（圖2C）顯示，與相應未照射組相比，IR 各組IR 后6 和24 h EUFA423 細胞γH2AX 和53BP1 焦點陽性細胞百分率均顯著升高（P＜0.01）。IR 處理后6 h，VPA+IR 組γH2AX 和53BP1 焦點陽性細胞百分率較IR 對照組增加了32.5% 和25.5%（P＜0.01），HPTA+IR 組增加了33.2%和27.2%（P＜0.01）。IR 處理后24 h，VPA+IR 和HPTA+IR 組γH2AX 和53BP1 焦點陽性細胞百分率仍顯著高于IR對照組（P＜0.01）。

Western 印跡實驗結果（圖2D）顯示，IR 結束后6 h，與相應未照射組相比，IR 各組EUFA423 細胞γH2AX 和53BP1 蛋白表達水平均顯著增加（P＜0.01）。VPA+IR 和HPTA+IR 組EUFA423 細胞γH2AX 蛋白表達水平較IR 對照組分別增加了74.3%（P＜0.01）和34.2%（P＜0.05），53BP1 蛋白表達水平增加了108.8%和52.7%（P＜0.01）。

以上結 果表明，VPA 500 μmol·L-1和HPTA 15 μmol·L-1可增加EUFA423 細胞中IR誘導的DNA損傷蓄積。

2.3 VPA 和HPTA 抑 制EUFA423 細胞Rad51和BRCA1蛋白表達

細胞免疫熒光實驗結果（圖3A）表明，與相應未照射組相比，IR 各組EUFA423 細胞Rad51 焦點陽性細胞百分率明顯增加（P＜0.01）。與IR 對照組相比，IR處理后6 h，VPA+IR 和HPTA+IR 組EUFA423 細胞Rad51 焦點陽性細胞百分率分別顯著降低了33.1%和35.8%（P＜0.01）；IR處理后24 h，VPA+IR 和HPTA+IR 組Rad51 焦點陽性細胞百分率亦明顯降低（P＜0.01）。另一個HR 相關蛋白BRCA1 焦點陽性細胞百分率變化趨勢與Rad51相似。

Fig.3 Effect of VPA and HPTA on DNA repair proteins in response to lR-induced DNA DSB in EUFA423 cells by immunofluorescence assay（A）and Western blotting（B）. See Fig.2 for the cell treatment. BRCA1：breast cancer susceptibility gene 1. A2 and A3 were the quantitative analysis results of A1（×1000）；B2 and B3 were the semi-quantitative analysis results of B1.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with corresponding no IR group；##P＜0.01，compared with corresponding IR control group.

Western 印跡實驗結果（圖3B）顯示，IR 結束后6 h，與相應未照射組相比，BRCA1蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01），Rad51 蛋白水平無明顯變化；與IR 對照組相比，VPA+IR 和HPTA+IR 組EUFA423細胞Rad51 和BRCA1 蛋白表達水平被顯著抑制（P＜0.01）。

上述結果提示，VPA 和HPTA 對EUFA423 細胞的放射增敏作用與其抑制DNA 修復蛋白Rad51和BRCA1表達有關。

3 討論

本課題組前期應用多種腫瘤細胞（如乳腺癌MCF7 和骨肉瘤U2OS 細胞）以及乳腺癌大鼠模型研究表明，VPA及其衍生物HPTA作為DNA損傷修復抑制劑，在細胞和動物水平上可通過抑制HR 機制中關鍵蛋白BRCA1 和Rad51 活性，對腫瘤組織或細胞發揮放射增敏作用［2-4，8，10］。本研究進一步發現，VPA 和HPTA 還可顯著增強BRCA2雙等位基因失活EUFA423 成纖維細胞對放射的敏感性，其機制亦與靶向抑制BRCA1 介導的HR 修復通路有關。由此提示，VPA 和HPTA 可下調HR 通路增強BRCA2 功能失活EUFA423 細胞對放射的敏感性。

EUFA423 細胞由Alan D D′Andrea 研究小組首次報道和建立［16］，來源于范氏貧血（Fanconi anemia，FA）患者的成纖維細胞。該細胞中BRCA2基因（也稱為FANCD1，Fanconi anemia complementation group D1，FA 互補組基因D1）發生雙等位基因突變（7691 insAT 和9900 insA）引起移碼突變，從而編碼C 端截短的BRCA2 蛋白。因此，EUFA423 細胞所攜帶的BRCA2雙等位基因失活，該基因失活可能導致類似于在BRCA1或BRCA2突變家族中觀察到的癌癥風險。EUFA423 細胞是目前被普遍認可的BRCA2缺失細胞，常用于BRCA2相關功能研究［15-17］。

BRCA2 是HR 修復過程中的關鍵蛋白，可直接調控Rad51 活性，在DNA DSB 修復中發揮重要作用［11］。研究報道，BRCA2缺失的EUFA423 細胞對放射敏感性增強［17］。本研究結果表明，VPA 和HPTA 可進一步增強其放射敏感性。由此推測，在BRCA2失活的EUFA423 細胞中還存在著不依賴于BRCA2 調控的HR 修復通路，BRCA1 和Rad51可能參與其調控。①本課題組既往研究表明，在哺乳動物細胞中有2條獨立的調控Rad51-HR 修復通路，它們分別由BRCA2 和Rad52 所介導［15］；換言之，在BRCA2缺失細胞中還存在著Rad52/Rad51調控的HR修復通路，它不依賴于BRCA2［15］，提示靶向抑制Rad52 介導HR 修復通路可進一步增強BRCA2缺失細胞對放射的敏感性，導致細胞合成致死性。②本研究結果表明，在應答DNA 損傷反應中，BRCA1 和Rad51 表達增加；VPA 和HPTA 可顯著抑制IR 導致增加的BRCA1 和Rad51 表達，提示在BRCA2失活的EUFA423 細胞中BRCA1 和Rad51 還可發揮DNA 損傷修復作用。由上述結果推測，VPA 和HPTA 作為DNA 損傷修復抑制劑，有可能通過BRCA1 抑制Rad52/Rad51 通路，對EUFA423 細胞發揮放射增敏作用，但兩者的細胞放射增敏作用是否與其抑制Rad52 功能有關還需深入探討。此外，本研究結果還需應用另一種BRCA2失活Capan-1 細胞對VPA 和HPTA 放射增敏作用進行驗證。

本研究選擇的VPA 濃度500 μmol·L-1為臨床上治療癲癇病的血藥濃度；同時基于VPA 和HPTA抑制組蛋白去乙酰化酶活性，推算HPTA 用于臨床治療的血藥濃度可能為15 μmol·L-1［1-2］。本研究選用VPA 和HPTA 的臨床使用劑量，研究結果更具有實際臨床意義。同時，在HPTA 濃度遠低于VPA 濃度時，即顯示出與高濃度VPA 相似的放射增敏作用，提示HPTA 可能是更加高效的VPA 替代物。本研究結果可為VPA 及其衍生物應用于腫瘤患者放射增敏治療提供一定的理論和實驗依據。