云南香格里拉不同海拔葡萄果皮酚類物質差異及成因分析

張柯楠，尹海寧，王家逵，曹建宏，惠竹梅,3

云南香格里拉不同海拔葡萄果皮酚類物質差異及成因分析

1西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西楊凌 712100；2香格里拉酒業(yè)股份有限公司，云南香格里拉 674400；3陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西楊凌 712100

【目的】酚類物質是釀酒葡萄的重要次級代謝產物，對葡萄和葡萄酒的品質有重要影響。結合土壤及氣候因子研究不同海拔葡萄果皮酚類物質含量的差異及成因，為高海拔釀酒葡萄種植及葡萄品質差異化管理提供理論依據(jù)。【方法】本研究以云南香格里拉產區(qū)釀酒葡萄‘梅爾諾’（Merlot）為試材，連續(xù)3年（2020、2021、2022年）分析2個海拔（2 181、2 300 m）成熟期葡萄果皮總酚、總類黃酮、總單寧、總花色苷、單體花色苷及非單體花色苷酚類物質含量差異，同時監(jiān)測葡萄生長發(fā)育期間不同海拔的光照、溫度、濕度等氣候因子，進而分析氣候因子對葡萄果皮酚類物質的影響?！窘Y果】兩個海拔葡萄園土壤主要礦質養(yǎng)分無顯著差異，光照、紫外線強度、溫濕度等氣候因子存在一定差異。海拔對葡萄果皮酚類物質含量具有顯著影響，較高海拔有利于葡萄果皮酚類物質的積累。在2020—2022年，海拔（2 300 m）葡萄果皮總酚、總單寧、總花色苷、大部分單體花色苷以及槲皮素物質含量顯著高于海拔2 181 m，其中總單寧含量提高幅度為56.27%—174.49%；而海拔2 181 m處葡萄果皮的總類黃酮含量顯著高于海拔2 300 m，提高32.25%—79.48%。OPLS-DA分析顯示，兩個海拔葡萄果皮酚類物質的主要差異化合物為總單寧（TTC）、總類黃酮（TFo）、二甲花翠素-3--葡萄糖苷（Mv）、二甲花翠素-3--（6--乙?；┢咸烟擒眨∕v-Ace）、花青素-3--葡萄糖苷（Cy）以及甲基花青素-3--葡萄糖苷（Pn）?；疑P聯(lián)分析顯示，葡萄生長季晝夜溫差對葡萄果皮總酚和總類黃酮含量影響較大；光照強度和紫外線強度對果皮總花色苷、單體花色苷和槲皮素含量影響較大；3種單體花色苷（Pt、Pn-Ace和Pn-Cou）和槲皮素含量主要受葡萄轉色期（7月）光照強度的影響?！窘Y論】不同海拔晝夜溫差、光照強度和紫外線強度是引起葡萄果皮酚類物質含量顯著差異的主要氣候因素。高海拔下較大的晝夜溫差、光照強度和紫外線強度有利于葡萄果皮總酚、槲皮素、總花色苷及其單體物質的積累。

葡萄；酚類物質；海拔；氣候因子；灰色關聯(lián)分析

0 引言

【研究意義】葡萄（）是世界上最重要的果樹之一，葡萄漿果中含有豐富的營養(yǎng)物質[1]。酚類物質（phenolics）作為葡萄果實的重要次級代謝產物，不僅可以保護植物免受生物和非生物脅迫，還可影響葡萄及葡萄酒的顏色和口感[2-5]。酚類物質的合成途徑包括類黃酮和苯丙烷途徑，其中花色苷、類黃酮、單寧等物質是主要的類黃酮途徑代謝產物[6]，也是決定葡萄與葡萄酒品質的重要指標。近年來全球氣候持續(xù)變暖，葡萄品質易受到高溫干旱氣候的影響，而在溫度較低的高海拔地區(qū)進行葡萄種植很可能成為應對氣候變暖的一種途徑[7]。因此，研究海拔及其環(huán)境因子對葡萄果實酚類物質的影響，有助于明確不同海拔葡萄酚類物質含量差異及成因，為高海拔釀酒葡萄產區(qū)葡萄園址選擇、種植管理和差異化葡萄酒產品的研發(fā)提供理論依據(jù)。【前人研究進展】光照、溫度、濕度、土壤、水分、地形等環(huán)境因子作為葡萄品質形成的基礎，對葡萄生長發(fā)育至關重要，其中海拔作為主要影響因子之一，顯著影響葡萄果皮酚類物質的積累[8-10]。不同海拔山地葡萄園在世界范圍內分布較廣，葡萄果皮中花色苷、單寧、兒茶素、表兒茶素等酚類物質含量也因海拔不同而存在顯著差異[11-13]。海拔通過改變葡萄果實酚類物質含量進而影響葡萄和葡萄酒品質。JIN等[14]研究發(fā)現(xiàn)隨海拔高度增加，‘赤霞珠’葡萄酒中總酚、總花色苷、總類黃酮和黃酮醇含量增加。為了應對不同海拔多樣的微氣候環(huán)境，葡萄一般通過調整代謝通路和代謝物如酚類物質進行適應[15-17]。通常隨著海拔高度的增加，葡萄園空氣溫度逐漸降低，光照強度和紫外線輻射逐漸增強[18]，不同的光強、光質、溫度均會影響葡萄花色苷等酚類物質的積累[19-21]。同時，適宜的濕度可以促進葡萄、番茄等水果的光合作用，有利于可溶性固形物、Vc以及花色苷含量的提高。因此，人們在生產中通過微噴等農業(yè)技術提高作物微氣候濕度以應對高溫干旱的不利影響[22-26]?！颈狙芯壳腥朦c】目前關于海拔對葡萄酚類物質影響的研究較多，但不同海拔釀酒葡萄品質尤其是酚類物質差異的成因研究較少，還需進一步深入研究?！緮M解決的關鍵問題】本研究以釀酒葡萄梅爾諾（Merlot）為試材，分析不同海拔成熟期葡萄果皮總酚、總類黃酮、總單寧、總花色苷、單體花色苷組分和非單體花色苷酚類物質含量差異；同時，在葡萄生長發(fā)育期監(jiān)測不同海拔葡萄園的氣候因子，從氣候因子角度綜合探究不同海拔葡萄果皮酚類物質含量積累差異的原因，為不同海拔葡萄優(yōu)質生產提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

本試驗于2020、2021和2022年在云南香格里拉產區(qū)德欽葡萄基地（28°10′ N，98°52′ E）進行，設置2個試驗區(qū)，海拔分別為2 181 m和2 300 m（圖1）。供試材料為歐亞種釀酒葡萄‘梅爾諾’（Merlot），定植于2008年，南北行向，株行距1.0 m×1.5 m，樹形為單干雙臂，采用短梢修剪，新梢間距為10—15 cm，葉幕高度和寬度分別為140 cm和80 cm，灌溉方式為滴灌，采用常規(guī)葡萄園管理方式，施肥、灌溉、病蟲害防治采用相同標準。

圖1 德欽葡萄基地采樣點及等高線示意圖

1.2 試驗材料

在果實轉色后，每隔3—5 d隨機采集試驗區(qū)果實樣品測定可溶性物含量及含酸量，監(jiān)測果實成熟曲線，當果實可溶性物含量趨于穩(wěn)定不再上升（即27%左右），且種子變?yōu)樽睾稚珪r采集葡萄樣品（2020年9月16日、2021年9月20日、2022年9月22日）。于每個海拔葡萄園隨機選取10株生長勢一致的葡萄植株，在每株葡萄樹的陽面和陰面各采集一穗葡萄，共20穗，果粒剪下混勻后于-40 ℃下保存待測，重復3次。樣品用于測定葡萄果皮的總酚、總花色苷、總類黃酮、總單寧、單體花色苷及非花色苷單體酚類物質含量。

1.3 氣候因子的監(jiān)測

分別于2021年和2022年的5—9月監(jiān)測各海拔葡萄園主要氣候因子。采用溫濕度記錄儀（RC-4HC，中國江蘇省精創(chuàng)電氣公司）測定每個葡萄園5—9月的空氣溫度和空氣相對濕度，溫濕度記錄儀探頭放置在葡萄果穗附近，距離地面1.5 m，每隔30 min記錄一次。在每月晴天的上午11：30—12：30采用數(shù)字照度計（Z-10，中國深圳格信達科技有限公司）、紫外輻射照度計（UV340B，中國西安欣寶科儀電子科技有限公司）和光纖光譜儀（FX2000，中國上海復享光學股份有限公司）分別測定2個海拔葡萄園的光照強度、紫外線強度和不同光質（300—1 000 nm）的相對光照強度。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 土壤養(yǎng)分含量的測定 按照五點取樣法取表層0—20 cm的土壤樣品，采用四分法[27]取1 kg土樣帶回實驗室待測。土壤質地采用激光粒度儀（2000E，Mastersizer，UK）測定；pH采用pH測定儀（S400，梅特勒托利多有限公司，中國）測定；參考《土壤農化分析》[27]，土壤全氮含量的測定采用半微量凱式法，有機質含量的測定采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法，全磷含量的測定采用高氯酸-硫酸-鉬銻抗法，速效磷含量的測定采用碳酸氫鈉提取-鉬銻抗法，全鉀含量采用NaOH熔融，火焰光度法測定，速效磷含量采用NH4OAc浸提，火焰光度法測定，所有樣品重復測定3次。

1.4.2 果實酚類物質含量的測定 參考TIAN等[28]的方法，每個樣品設置3個生物學重復，每個生物學重復隨機取葡萄50粒，立即剝取葡萄皮，將葡萄皮液氮冷凍并研磨成粉末后裝于培養(yǎng)皿中，在真空冷凍干燥器（Goldsim Cellular Science LLC，USA）中凍干24 h，取出裝于自封袋中，存放于-80 ℃冰箱。提取時，每個重復分別稱取1 g干粉于50 mL離心管中（離心管要用黑膠帶或錫箔紙包裹），加入20 mL鹽酸甲醇溶液（體積分數(shù)60%甲醇，質量分數(shù)0.1%鹽酸）使料液比為1﹕20，超聲提取器于水溫30 ℃、40 W功率下提取30 min，接著在4 ℃下10 000 r/min離心10 min，收集上清液于絲口瓶中。然后在沉淀物中加入20 mL鹽酸甲醇，重復以上提取步驟2次，合并3次所有上清液搖勻并于-80 ℃冰箱中儲存。以上操作均要避光。

總花色苷含量的測定采用pH示差法[29]；總單寧含量的測定采用甲基纖維素沉淀法[30]，結果以兒茶素表示；總酚含量的測定采用福林-肖卡法[31]，結果以沒食子酸表示；總類黃酮含量的測定采用PEINADO等[32]的方法，結果以蘆丁含量表示，所有樣品重復測定3次。

1.4.3 單體花色苷含量的測定 葡萄果皮單體花色苷的提取：每個樣品設置3個生物學重復，每個生物學重復隨機取葡萄100粒，于-80 ℃預冷并去皮，在液氮中磨成粉末后在真空冷凍干燥器（Goldsim Cellular Science LLC，USA）中凍干24 h。稱取0.1 g葡萄果皮干粉，加入5 mL色譜甲醇，避光超聲10 min后，置于搖床25 ℃，130 r/min提取30 min，隨后8 000 r/min離心5 min取上清液。重復提取2次，合并上清液。

單體花色苷含量的測定：提取液0.22 μm有機濾頭過濾，采用LC-20AT高效液相色譜儀（島津，日本）和二極管陣列檢測器（島津，日本）進行測定。色譜條件：色譜柱為Synergi Hydro-RP 80A柱（250 mm×4.6 mm，4 μm，Phenomenex，USA）。流動相A：甲酸﹕乙腈﹕水（1﹕4﹕32，V/V）。流動相B：甲酸﹕乙腈﹕水（1﹕20﹕16，V/V）。洗脫程序：0—18 min，10%—25% B；18—20 min，25% B；20—30 min，25%—40% B；30—35 min，40%—70% B；35—40 min，70%—100% B。流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，二極管陣列檢測器檢測波長520 nm，進樣量20 μL，所有樣品重復測定2次。結合Yang等[33]方法中花色苷的保留時間對樣品各單體花色苷進行定性分析；參照趙裴等[34]方法，花色苷定量分析采用外標法，以純度95%的二甲花翠素-3--葡萄糖苷為標準品（索萊寶科技有限公司，中國），準確稱取標準品0.0100 g并以色譜甲醇定容得到10 mL單標溶液，使用單標溶液梯度稀釋5個不同濃度（重復3次），在上述色譜條件下分析并繪制標準曲線，標準曲線的相關系數(shù)在0.999以上。結合標準曲線對樣品的二甲花翠素-3--葡萄糖進行定量分析。其余單體花色苷的濃度以二甲花翠素-3--葡萄糖苷當量表示。果皮中單體花色苷含量用“mg·g-1DW”表示。

1.4.4 非花色苷單體酚類物質含量的測定 葡萄果皮非花色苷單體酚類物質的提取：每個樣品設置3個生物學重復，每個生物學重復隨機取葡萄100粒，于-80 ℃預冷并去皮，在液氮中磨成粉末后在真空冷凍干燥器（Goldsim Cellular Science LLC，USA）中凍干24 h。取葡萄果皮干粉2 g溶于45 mL乙酸乙酯，加入5 mL蒸餾水，在25 ℃條件下?lián)u床振蕩30 min（避光，130 r/min），12 000 r/min、4 ℃離心20 min，將上清液轉移至100 mL絲口瓶中，重復上述步驟3次。合并4次上清液并轉移至圓底燒瓶，在33 ℃條件下旋轉蒸發(fā)至干，用色譜級甲醇重溶定容至5 mL，-20 ℃避光存放待測。

非花色苷單體酚類物質含量的測定：提取液0.22 μm有機濾頭過濾，采用LC-2030CD高效液相色譜儀（島津，日本）和二極管陣列檢測器（島津，日本）進行測定。色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent，USA）。梯度洗脫：流動相A：水﹕乙酸（1﹕99，V/V），流動相B：乙腈。洗脫程序：0—3min，3%—6% B；3—7 min，6%—15% B；7—11 min，15%—30% B；11—13 min，30% B；13—15 min，30%—3% B。流速0.20 mL·min-1，柱溫30 ℃，二極管陣列檢測器檢測波長280 nm，進樣量10 μL，所有樣品重復測定2次。以兒茶素、表兒茶素、槲皮素、山奈酚、綠原酸、咖啡酸、反式阿魏酸、對香豆酸、沒食子酸、原兒茶酸、香草酸和丁香酸為標準品（索萊寶科技有限公司，中國），標準品純度均為98%，分別準確稱取標準品0.0100 g并以色譜甲醇定容得到10 mL單標溶液，分別對12種單標溶液梯度稀釋5個不同濃度（重復3次），在上述色譜條件下分析各標準品并繪制標準曲線，標準曲線的相關系數(shù)在0.999以上。結合各標準品的保留時間對樣品進行定性。結合標準曲線采用外標法對樣品進行定量分析。果皮中非花色苷單體酚類物質含量用“mg·g-1DW”表示。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2016（Microsoft，USA）進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，使用SPSS 25.0（SPSS，IBM，Chicago，IL，USA）進行單因素方差分析和相關分析，采用Turkey極差法（＜0.05）進行差異顯著性檢驗，使用Origin 2022（OriginLab，USA）進行主成分分析，使用SMICA14.1（Umetrics，SE）進行正交偏最小二乘分析，利用灰色關聯(lián)分析評價酚類物質相關聯(lián)的氣候因子[35]。

1.5.1 光合有效輻射系數(shù)（PARC）計算

計算公式：

式中，1：400—700 nm相對光照強度，2：300—1 000 nm相對光照強度。

1.5.2 灰色關聯(lián)分析關聯(lián)度計算

對海拔、氣候和酚類物質數(shù)據(jù)進行無量綱處理：

計算關聯(lián)系數(shù)：

式中，min?()、max?()分別為所有比較數(shù)列絕對差值的最小值和最大值，?()為i個比較數(shù)列絕對差值。本研究中min?()為0、max?()為0.98；ρ為分辨系數(shù)，0＜ρ＜1，通常取0.5。

計算關聯(lián)度：

式中，γi為第i個比較數(shù)列與參考數(shù)列的等權關聯(lián)度，N為樣本數(shù)量。

2 結果

2.1 不同海拔葡萄園土壤養(yǎng)分情況

如表1所示，兩個海拔葡萄園的土壤質地均為粉砂質壤土，土壤中有機質、全氮含量、全磷、全鉀、速效磷和速效鉀含量無顯著性差異。兩個海拔葡萄園土壤pH分別為7.34和7.09，海拔2 300 m處土壤pH顯著低于海拔2 181 m，各海拔土壤均屬于中性土壤，適于葡萄種植。參照第二次土壤普查土壤養(yǎng)分含量分級標準，兩海拔葡萄園土壤有機質含量較貧乏（四級），全氮含量中等（三級），鉀含量豐富（一級），磷含量中等（三級）。綜上，兩個海拔的土壤養(yǎng)分水平基本一致。

表1 葡萄園土壤養(yǎng)分

同列不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）。下同

Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (＜0.05). The same as below

2.2 不同海拔葡萄生長發(fā)育期氣候因子參數(shù)

由圖2-A可以看出，2021年兩個海拔葡萄園生長季（5—9月）及各月份最高、平均和最低空氣溫度在兩個海拔之間無顯著差異；在2022年，海拔2 181 m葡萄園6月、生長季（5—9月）最高及平均空氣溫度顯著高于海拔2 300 m，但兩個海拔最低空氣溫度無顯著差異；海拔2 300 m連續(xù)兩年生長季（5—9月）晝夜溫差顯著高于2 181 m，兩個海拔晝夜溫差在不同月份差異不同，兩個海拔7、8月晝夜溫差無顯著差異，而在2022年6月和9月出現(xiàn)顯著差異。

由圖2-B可以看出，在2021年兩個海拔生長季（5—9月）及各月份相對濕度無顯著差異；在2022年，海拔2 300 m生長季（5—9月）及各月份最高相對濕度均顯著高于2 181 m，海拔2 300 m平均相對濕度除6月顯著高于2 181 m外，其余月份兩個海拔葡萄園平均相對濕度無顯著差異，而在5月和6月，海拔2 300 m最低相對濕度顯著低于2 181 m，其余月份兩個海拔最低空氣相對濕度無顯著差異。

不同小寫字母表示同一氣候因子不同海拔之間差異顯著（＜0.05）。下同

Different lowercase letters of same climatic factor indicate significant difference between different altitudes (＜0.05). The same as below

圖2 不同海拔葡萄園氣候因子

Fig. 2 Climate factors of vineyards at different altitudes

在2021和2022年，5月和6月兩個海拔葡萄園光照強度無顯著差異，7月和5—9月平均光照強度存在顯著差異，且以海拔2 300 m較高（圖2-C）。5月，海拔2 300 m紫外線強度顯著低于2 181 m，6月則兩個海拔之間無顯著差異，而7月時2 300 m紫外線強度顯著高于2 181 m，分別是海拔2 181 m的1.73倍（2021年）和3.65倍（2022年），在9月則以海拔2 181 m紫外線較強（圖2-D）。由圖2-E可知，2021年和2022年兩個海拔葡萄園5—9月平均有效光合輻射系數(shù)無顯著差異，海拔2 181 m光合有效輻射系數(shù)在部分月份（2021年6、7月和2022年8月）顯著高于2 300 m，其余月份兩海拔無顯著差異。連續(xù)兩年兩個海拔有效積溫無顯著差異，2022年有效積溫較2021年高（圖2-F）。

2.3 不同海拔葡萄果皮酚類物質含量

2020—2022年，海拔2 300 m處葡萄果皮的總酚（TPC）、總花色苷（TAC）和總單寧含量（TTC）均顯著高于海拔2 181 m；相比于2020和2022年，2021年海拔2 300 m處葡萄總花色苷（TAC）和總單寧（TTC）較海拔2 181 m增加幅度大，分別增加了44.34%和174.49%。2020—2022年，海拔2 181 m處葡萄果皮的總類黃酮含量（TFo）連續(xù)3年顯著高于2 300 m，提高幅度分別為32.24%、57.64%和79.48%（圖3）。

圖3 不同海拔葡萄果皮酚類物質含量

由圖4可以看出，不同海拔葡萄果皮測定的9種單體花色苷中，以二甲花翠素-3--葡萄糖苷（Mv）的含量最高，其次是甲基花青素-3--葡萄糖苷（Pn）。海拔對葡萄果皮單體花色苷含量具有顯著影響。2020—2022連續(xù)3年，海拔2 300 m葡萄果皮的總單體花色苷含量顯著高于海拔2 181 m。在2020年，海拔2 300 m葡萄果皮單體花色苷除花青素-3--葡萄糖苷（Cy）和二甲花翠素-3--葡萄糖苷（Mv）含量顯著低于2 181 m，其余單體花色苷含量均為海拔2 300 m顯著高于2 181 m；在2021和2022年，海拔2 300 m葡萄果皮各單體花色苷含量均顯著高于2 181 m，其中二甲花翠素-3--（6--乙?；┢咸烟擒眨∕v-Ace）含量較海拔2 181 m增幅大，兩年分別增加了198.65%和42.22%。連續(xù)3年，海拔2 300 m葡萄果皮甲基化和?；ㄉ蘸枯^高，相較于海拔2 181 m，分別增加了25.62%—117.00%和31.10%— 159.16%，說明海拔對葡萄果皮的甲基化花色苷和?；ㄉ蘸坑绊戄^大。

Dp：花翠素-3--葡萄糖苷Delphinidin-3--gliucoside，Cy：花青素-3--葡萄糖苷Cyanidin-3--glucoside，Pt：甲基花翠素-3--葡萄糖苷Petunidin-3--glucoside，Pn：甲基花青素-3--葡萄糖苷Peonidin- 3-- glucoside，Mv：二甲花翠素-3--葡萄糖苷Malvidin-3--glucoside，Pn-Ace：甲基花青素-3--（6--乙?；㏄eonidin-3--(6--acetate)- glucoside，Mv-Ace：二甲花翠素-3--（6--乙酰化）葡萄糖苷Malvidin- 3--(6--acetate)-glucoside，Pn-Cou：甲基花青素-3--(6--香豆酰化)葡萄糖苷Peonidin-3--(6--coumarate)-glucoside，Mv-Cou：二甲花翠素-3--（6--香豆酰化）葡萄糖苷Malvidin-3--(6--coumarate)- glucoside

*表示不同海拔之間單體花色苷含量差異顯著（＜0.05）且含量較高

* meant significant difference (＜0.05) and higher content of individual anthocyanin between different altitudes in same year

圖4 不同海拔葡萄果皮單體花色苷物質含量

Fig. 4 The individual anthocyanin content in grape skins of different altitudes

由表2可以看出，不同海拔葡萄果皮共檢測出12種非花色苷單體酚類物質，包括2種黃烷醇類、2種黃酮醇類、4種羥基肉桂酸類和4種羥基苯甲酸類，其中槲皮素的含量較高，其次是山奈酚。在2021和2022年，海拔2 300 m葡萄果皮槲皮素含量顯著高于2 181 m。在黃烷醇類物質中，較高海拔葡萄果皮表兒茶素含量高于海拔2 181 m，其余黃烷醇類物質在2022年兩個海拔之間差異顯著。非類黃酮物質包括羥基肉桂酸類和羥基苯甲酸類，2021年，兩個海拔葡萄果皮中羥基肉桂酸類和羥基苯甲酸類物質含量無顯著差異；而在2022年，海拔2 300 m葡萄果皮的綠原酸、反式阿魏酸、對香豆酸、沒食子酸和香草酸含量顯著高于海拔2 181 m。

2.4 不同海拔葡萄果皮酚類物質的OPLS-DA分析

為進一步探究海拔對葡萄果皮酚類物質含量的影響，建立OPLS-DA模型進行正交偏最小二乘回歸分析。如圖5所示，采用2020、2021和2022年葡萄果皮的總酚、總類黃酮、總單寧、總花色苷及單體花色苷數(shù)據(jù)構建模型，同時對模型進行200次置換檢驗。一般而言，置換檢驗后intercept2＜0說明模型無過度擬合現(xiàn)象，2值＞0.7說明模型有較好的解釋能力，2值＞0.5說明模型有較好的預測能力。本試驗構建的模型intercept2值為-0.98，2值為0.74，2值為0.53，說明模型有效，且篩選差異化合物能力較好。通過模型篩選VIP值＞1的酚類化合物發(fā)現(xiàn)，海拔2 181 m和海拔2 300 m葡萄果皮的主要差異化合物是總類黃酮（TFo）、總單寧（TTC）、二甲花翠素-3--葡萄糖苷（Mv）及其乙?；∕v-Ace）、花青素-3--葡萄糖苷（Cy）及其甲基化（Pn）。

2.5 葡萄果皮酚類物質與氣候因子的關聯(lián)分析

采用2020、2021和2022年數(shù)據(jù)對海拔及9種單體花色苷物質進行Pearson相關分析，采用2021和2022年數(shù)據(jù)對海拔及12種非花色苷單體酚類物質進行Pearson相關分析。相關分析顯示，葡萄果皮單體花色苷（Pt、Pn-Ace、Pn-Cou）和槲皮素（Qu）與海拔顯著正相關，可以進一步分析其與氣候因子的關系。對2021、2022年葡萄生長季（5—9月）氣候因子、TPC、TAC、TFo、TTC、Pt、Pn-Ace、Pn-Cou和Qu數(shù)據(jù)均值化處理后構建灰色關聯(lián)分析模型。由圖6可知，葡萄果皮的TPC和TFo含量與晝夜溫差的關聯(lián)度最大，其次分別是紫外線強度和最高空氣相對濕度。TTC與最低空氣相對濕度關聯(lián)度最大，其次是光照強度。TAC、Pt、Pn-Ace、Pn-Cou和Qu含量均與光照強度的關聯(lián)度最大，但它們的次級關聯(lián)指標不同，依次是TAC、Pt、Qu與紫外線強度，Pn-Ace、Pn-Cou與晝夜溫差。綜上，葡萄果皮總酚和總類黃酮物質含量主要受葡萄生長季（5—9月）晝夜溫差的影響，總單寧含量受最低相對濕度的影響，槲皮素含量、花色苷總量及其部分組分含量主要受生長季（5—9月）光照強度的影響。

表2 不同海拔葡萄果皮非花色苷單體酚類物質含量

Table 2 The non-individual anthocyanin content in grape skins of different altitudes (mg·g-1DW)

圖5 不同海拔葡萄果皮酚類物質OPLS-DA得分及檢驗圖

Fig. 5 OPLS-DA score and test plots of phenolic compounds in grape skins at different altitudes

Qu：槲皮素 Quercetin；AL：海拔 Altitude；HAT：最高空氣溫度 Highest air temperature；MAT：平均空氣溫度 Mean air temperature；LAT：最低空氣溫度 Lowest air temperature；HRH：最高相對濕度 Highest relative humidity；MRH：平均相對濕度 Mean relative humidity；LRH：最低相對濕度 Lowest relative humidity；DIF：晝夜溫差 Day-night temperature difference；LI：光照強度 Light intensity；UVI：紫外線強度 UV intensity；PARC：光合有效輻射系數(shù) Photosynthetic active radiation coefficient；GDD：有效積溫 Growing degree days；SDIF：9月晝夜溫差 September day-night temperature difference；JLRH：7月最低相對濕度 July lowest relative humidity；JLI：7月光照強度 July light intensity。*表示酚類物質與海拔顯著相關（P＜0.05）*represent phenolics are significantly correlated with altitude (P＜0.05）

為進一步分析葡萄生長發(fā)育過程中影響葡萄酚類物質積累的主要氣候因子，在原有模型中增加引入各月光照、溫度、濕度類氣候因子形成新的灰色關聯(lián)模型。結果顯示（圖6綠色部分），葡萄果皮TFo與9月晝夜溫差的關聯(lián)度最大，TTC與7月最低空氣濕度關聯(lián)度最大。Pt、Pn-Ace、Pn-Cou和Qu與7月光照強度關聯(lián)度最大。兩個灰色關聯(lián)模型比較分析發(fā)現(xiàn)，葡萄果皮TPC和TAC受生長季（5—9月）氣候因子的影響較大，Pt、Pn-Ace、Pn-Cou和Qu含量主要受葡萄轉色期（7月）光照強度的影響，TFo含量主要受葡萄成熟期（9月）晝夜溫差的影響，最低相對濕度尤其是轉色期（7月）最低相對濕度對果皮TTC影響較大。

3 討論

3.1 海拔影響葡萄果皮酚類物質

海拔對葡萄的生長發(fā)育有重要影響，目前有關海拔影響葡萄品質的研究較多。不同海拔葡萄果實的還原糖、可滴定酸以及葡萄果皮中的單體花色苷、單寧、黃酮醇、二苯乙烯等代謝產物存在顯著差異[8-10]。對葡萄果皮酚類物質的研究發(fā)現(xiàn)，高海拔有利于增強葡萄抗氧化活性[14]，提高葡萄果皮花色苷[8]、黃酮醇[10]等物質含量。本研究中不同海拔葡萄果皮酚類物質含量差異顯著，而較高海拔有利于葡萄果皮總酚、總單寧、槲皮素類黃酮醇、總花色苷及多種單體花色苷含量的積累，與Mateus等[36]對不同海拔釀酒葡萄的研究結果一致。花色苷、單寧等酚類物質是類黃酮途徑主要的代謝產物，較高海拔地區(qū)葡萄果皮類黃酮合成途徑中F3′H支路的代謝較為活躍[17]。本研究中部分羥基肉桂酸類物質如對香豆酸、反式阿魏酸在較高海拔含量較高，對香豆酸是類黃酮物質合成的前體物質，說明較高海拔可能促進了葡萄果皮酚類前體物質的合成，這也是葡萄果實代謝物和代謝通路多樣化適應不同海拔生態(tài)環(huán)境的結果[15]。不同海拔土壤類型、土壤肥力均會影響葡萄果實的品質，例如土壤中氮、磷、鉀含量配比會影響‘梅爾諾’葡萄的花色苷、總類黃酮等物質含量[37]。本研究中兩個海拔的土壤養(yǎng)分水平相近，土壤對兩個海拔‘梅爾諾’葡萄酚類物質含量的差異影響較小，因此，本研究主要分析不同海拔氣候因子與果實酚類物質的關系。

3.2 氣候因子影響葡萄果皮酚類物質

酚類物質作為植物的保護劑，可以保護植物免受環(huán)境生物和非生物脅迫[4]，其種類和含量受到氣候如溫度、光照、濕度等多種因素的影響。在本研究中，不同海拔的氣候條件尤其是光照強度和紫外線強度是影響‘梅爾諾’葡萄果皮酚類物質積累的主要因素，這也與‘赤霞珠’[38]、‘黑比諾’[39]、雷司令[40]的研究結果一致。目前有關氣候因子調控葡萄酚類物質合成代謝的研究較多，但是大部分研究是在人工調控的微氣候環(huán)境中進行，往往借助氣候箱、日光溫室或通過調整葡萄樹形、葉幕等方式[41-42]。本研究在大田自然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)，在葡萄生長季和轉色期（7月），較高海拔（2 300 m）為葡萄果皮總花色苷、單體花色苷（Pt、Pn-Ace和Pn-Cou）和槲皮素類黃酮醇（Qu）物質積累提供了較強的光照和紫外線，這在田間自然條件下驗證了較強的光照和紫外線促進了葡萄果皮花色苷物質和槲皮素類黃酮醇物質含量的合成。轉錄組分析發(fā)現(xiàn)，遮光處理下葡萄果皮花色苷含量以及相關基因、表達量顯著降低[43]；紫外線通過影響類黃酮代謝途徑中一些酶的活性如PAL、CHS[44]，促進葡萄果皮花色苷的合成[45]。高海拔較強的光照和紫外線可能通過影響葡萄類黃酮代謝途徑中相關酶的活性或者相關基因的表達來影響花色苷等酚類物質含量，具體機制有待進一步深入研究。

溫度是影響葡萄酚類物質合成的另一重要氣候因子。本研究發(fā)現(xiàn)，葡萄果皮總酚、總類黃酮和單體花色苷（Pn-Ace、Pn-Cou）物質含量與晝夜溫差的關聯(lián)度較大（圖6），較高海拔伴隨較大的晝夜溫差有利于葡萄果皮酚類物質的積累。晝夜溫差較大，夜間空氣溫度較低，葡萄葉片呼吸作用強度減弱，葡萄果實糖含量得到積累，而糖作為花色苷物質合成的前體物質，在一定程度上可以促進類黃酮尤其是花色苷的合成[46]。MORI等[47]研究發(fā)現(xiàn)，夜間溫度顯著影響葡萄果皮單體花色苷的含量，較高的夜間溫度不利于非甲基化花色苷的積累，這可能與其化學結構不夠穩(wěn)定有關。在高海拔地區(qū)，較大的晝夜溫差，較低的夜間溫度（11.5—12.36 ℃）一方面促進了花色苷前體物質糖的合成，另一方面有利于類黃酮合成途徑代謝產物尤其是非甲基化花色苷的積累。同時，高海拔地區(qū)平均空氣溫度在20.86—21.96 ℃，最熱月平均空氣溫度不超過23.15 ℃，葡萄果皮花色苷積累的最佳溫度約20℃，這與YAN等[48]對‘梅爾諾’葡萄研究的結果一致。空氣相對濕度與葡萄葉片的光合速率變化呈拋物線關系，較低或較高的空氣相對濕度均會影響葡萄葉片的氣孔導度、蒸騰速率并降低葉片光合速率，進而影響葡萄果實次級代謝產物的合成[26]。本研究發(fā)現(xiàn)葡萄果皮的總類黃酮、總單寧含量分別受到最高相對濕度和最低相對濕度的影響。該產區(qū)位于瀾滄江流域，屬于干熱河谷，蒸發(fā)量大[49]，海拔2 181 m葡萄果皮較低的總單寧含量和海拔2 300 m較低的總類黃酮含量可能分別與低濕（14.05%—14.30%）和高濕（87.69%—93.61%）環(huán)境下葡萄葉片光合作用受阻有關。

4 結論

不同海拔（2 181 m和2 300 m）的‘梅爾諾’葡萄果皮酚類物質含量存在顯著差異，較高海拔的葡萄果皮酚類物質含量較高。不同海拔的氣候條件，尤其是晝夜溫差和光照強度是引起酚類物質含量差異的主要因子。較高海拔較大的晝夜溫差、較強的光照和紫外線促進了葡萄果皮總酚、槲皮素類黃酮醇和總花色苷及其單體物質的積累。在云南香格里拉干旱河谷產區(qū)，建議葡萄種植選擇光照較強和晝夜溫差較大的高海拔區(qū)域，同時對于濕度較低的海拔區(qū)域可以考慮采用微噴等農業(yè)技術進行增濕，以提高葡萄果皮總單寧物質含量。

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Differences and Genesis of Grape Phenolic Compounds Among Different Altitudes in Yunnan Shangri-la

1College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi;2Shangri-la Winery Co, LTD, Shangri-la 674400, Yunnan;3Shaanxi Grape and Wine Engineering Center, Yangling 712100, Shaanxi

【Objective】Phenolic compounds are important secondary metabolites of wine grape, which have an important influence on the quality of grape and wine. In this study, the differences and genesis of phenolic substances in grape skins among different altitudes were studied combined with soil and climate factors, so as to provide a theoretical basis for the planting management of wine grapes at high altitudes region. 【Method】In the present research, Merlot wine grape was used as the test material. For three consecutive years (2020, 2021 and 2022), the differences of total phenols, flavonoids, tannins, total anthocyanins, the content of individual and non-individual anthocyanin components in grape skins at two altitudes (2 181, 2 300 m) at maturity stage were analyzed. Meanwhile, climate factors such as light, temperature and humidity at different altitudes were monitored during grape development, and the influences of climatic factors on phenolic substances of grape skins were analyzed. 【Result】There were no significant differences in the main mineral nutrients of the soils of the two altitude vineyards, and some differences in climatic factors, such as light, UV intensity, temperature and humidity. Altitude had a significant effect on the content of phenolic substances in grape skins. In the years of 2020-2022, the higher altitude was conducive to the accumulation of phenolic substances in grape skins. the content of total phenols, total tannin, total anthocyanins, most of the individual anthocyanins and the quercetin in berry skins were higher at the altitude of 2 300 m; compared with that at 2 181 m, the content of total tannin in grape skins at 2 300 m increased by 56.27%-174.49%. The flavonoid content at 2 181 m altitude were significantly higher than that at 2 300 m, with an increase of 32.25% to 79.48%. OPLS-DA analysis showed that, the main different compounds of phenolic compounds between the two altitudes were total tannin (TTC), total flavonoids (TFo), malvidin-3-glucoside (Mv), malvidin-3-acetly-glucoside (Mv-Ace), cyanidin-3- glucoside (Cy), and peonidin-3-glucoside (Pn). Grey correlation analysis showed that day-night temperature difference in grape growing season had a great effect on the content of total phenols and total flavonoids in grape skins. The content of total anthocyanins, individual anthocyanins and quercetin in skins were significantly affected by light and ultraviolet intensity. The content of three anthocyanins (Pt, Pn-Ace and Pn-Cou) and quercetin were mainly affected by the light intensity during grape veraison (July).【Conclusion】The climatic conditions of different altitudes, especially day-night temperature difference, light and ultraviolet intensity were the main factors causing the differences of phenolic content. The larger day-night temperature difference, stronger light and ultraviolet intensity at higher altitude were conducive to the accumulation of phenolic substances in grape skins.

grape; phenolic; altitude; climate factors; grey correlation analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.19.014

2023-03-15；

2023-06-05

國家自然科學基金（31772258）、國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項（CARS-29-zp-6）、迪慶州雪域人才項目

張柯楠，E-mail：kenanzhang@nwafu.edu.cn。通信作者惠竹梅，E-mail：xizhumei@nwafu.edu.cn

（責任編輯 趙伶俐）