HLA-E與oHSV2 VP5蛋白相互作用研究

姚若一, 范嘉琦, 肖 雄, 周 芹, 汪 洋, 胡 翰, 劉濱磊

(湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院,湖北 武漢 430068)

溶瘤病毒(oncolytic virus,OVs)療法是一種癌癥免疫治療方式。溶瘤病毒可以直接原位感染和裂解腫瘤細(xì)胞,誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)的急性炎癥,并提供病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)和危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(DAMPs),其感染的腫瘤細(xì)胞的死亡會(huì)在這種免疫刺激環(huán)境中釋放腫瘤相關(guān)抗原(TAAs),從而促進(jìn)免疫細(xì)胞流入、抗腫瘤免疫反應(yīng)和腫瘤免疫環(huán)境的重構(gòu)[1]。目前,已有多種病毒被用作溶瘤病毒載體,單純皰疹病毒(herpes simplex virus,HSV)由于其具有多種優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用、研究[2]。

oHSV2是在單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-2)標(biāo)準(zhǔn)毒株HG52的基礎(chǔ)上,敲除了ICP34.5和ICP47,插入編碼人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(human granulocyte macrophage colony stimulating factor,hGM-CSF)的表達(dá)序列的新型溶瘤病毒。ICP34.5是一種神經(jīng)毒性因子,可以抑制I型干擾素(IFN)反應(yīng),拮抗非分裂細(xì)胞內(nèi)的PKR信號(hào)通路。ICP34.5的敲除提高了腫瘤細(xì)胞的選擇性,防止神經(jīng)元的感染。ICP47可以阻斷TAP(與抗原加工相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)體)的功能,從而阻止了受感染細(xì)胞向CD8+T細(xì)胞呈遞抗原。ICP47的敲除誘導(dǎo)了US11啟動(dòng)子的早期激活,增加溶瘤病毒治療活性,還使健康細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞都呈遞病毒抗原,抑制健康組織的感染,免疫介導(dǎo)破壞腫瘤細(xì)胞,選擇性繁殖溶瘤病毒。hGM-CSF可以促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的積累和成熟,改善腫瘤抗原呈遞并刺激強(qiáng)大的T細(xì)胞反應(yīng)[3]。目前,其產(chǎn)品OH2注射液作為多適應(yīng)癥單藥(NCT03866525)和聯(lián)合用藥HX008(NCT04616443)均正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)是基因組中多態(tài)性最強(qiáng)的區(qū)域,并且富含編碼具有免疫學(xué)意義的分子的基因[4]。人的MHC被稱為人類白細(xì)胞抗原(human leucocyte antigens,HLA)基因復(fù)合體,可分為HLAⅠ、HLAⅡ、HLAⅢ[5]。HLAⅠ類基因通常分為兩類:經(jīng)典類(Ⅰa類),包括HLA-A、HLA-B和HLA-C,具有明顯的多態(tài)性;非經(jīng)典類(Ⅰb類),包括HLA-E、HLA-F、HLA-G等,不顯示或僅顯示有限的多態(tài)性[6]。HLA Ⅰ a分子可被殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immnoglobulin-like receptor,KIR)識(shí)別,而HLAⅠb分子主要通過(guò)同源二聚體NKG2D和異二聚體CD94-NKG2受體介導(dǎo)識(shí)別[7]。

在腫瘤細(xì)胞表面,HLA Ⅰ a類分子的表達(dá)通常下調(diào)甚至丟失,從而逃避細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)對(duì)其的識(shí)別和特異性殺傷。理論上,自然殺傷(NK)細(xì)胞可以殺傷缺乏HLAⅠ分子的腫瘤細(xì)胞。但實(shí)際上,它們之所以能逃避NK細(xì)胞的攻擊,此現(xiàn)象可能與HLA Ⅰ b分子在腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)有關(guān)[8]。

人類白細(xì)胞抗原E(HLA-E)是功能和作用途徑較為明確的HLAⅠb類分子,具有組織分布狹窄但細(xì)胞表面表達(dá)較低的特征,幾乎在所有成人細(xì)胞表面低水平表達(dá)。不過(guò),已有多項(xiàng)研究證實(shí)了HLA-E在許多類型的人類腫瘤細(xì)胞的表面過(guò)表達(dá)。HLA-E是CD94/NKG2A的主要配體,該受體在來(lái)自外周血的超過(guò)50%的CD56bright或CD56dimNK細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞的一些亞群上表達(dá)[9]，是一種抑制性受體。HLA-E與CD94/NKG2A結(jié)合后,SHP-1磷酸酶被招募到NKG2A的酪氨酸磷酸化的免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM),然后將抑制信號(hào)傳遞給免疫效應(yīng)細(xì)胞,最終產(chǎn)生抑制作用[10]。因此,HLA-E在腫瘤細(xì)胞上的上調(diào)表達(dá),對(duì)NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤功能是不利的。

前期研究發(fā)現(xiàn),UV-oHSV2的處理可以使BGC823、LoVo和U87MG細(xì)胞上的HLA-E上調(diào)表達(dá)。在體外實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)過(guò)HLA-E抗體預(yù)處理的BGC823細(xì)胞被殺傷效果更明顯。在皮下荷瘤裸鼠瘤內(nèi)給藥模型,和腹腔荷瘤裸鼠腹腔給藥模型中,藥物中添加HLA-E抗體均可以減小小鼠腫瘤體積,并延長(zhǎng)小鼠的生存期。基于此,本文進(jìn)行oHSV2與HLA-E的相互作用研究,并運(yùn)用激光共聚焦實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

溶瘤病毒oHSV2由本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)基因改造,并進(jìn)行生產(chǎn)、純化。293T細(xì)胞,BGC823細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)保存。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)制備。質(zhì)粒載體pGEX-6p-1、EGFP-C1由本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)保存,pCMV-N-DsRed購(gòu)于碧云天生物。

總RNA提取、通用型DNA純化回收、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒均于TIANGEN購(gòu)買。限制性內(nèi)切酶于NEB購(gòu)買。非連接酶依賴型單片段快速克隆試劑盒、2×Phanta?Max Master Mix(Dye Plus)于Vazyme購(gòu)買。GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒于碧云天生物購(gòu)買。HLA-E抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗于proteintech購(gòu)買。DAPI、4%多聚甲醛于biosharp購(gòu)買。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、總RNA提取

細(xì)胞均用DMEM/F12(添加10%FBS)培養(yǎng)基,在5% CO2,37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。總RNA提取步驟依據(jù)試劑盒說(shuō)明書。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建

目的基因PCR體系配制及反應(yīng)程序依據(jù)說(shuō)明書。所用到的引物見(jiàn)表1。

表1 引物信息

質(zhì)粒載體雙酶切,反應(yīng)體系:質(zhì)粒2000 ng,內(nèi)切酶各4 μL,cutsmart buffer 20 μL,補(bǔ)加DEPC水至200 μL。反應(yīng)條件:37℃,2 h。

以上體系用試劑盒回收后進(jìn)行同源臂連接。連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂板。第二天挑取單菌落,進(jìn)行菌落PCR鑒定。

1.4 GST-HLA-E融合蛋白的表達(dá)與純化

將pGEX-6p-1-HLA-E質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DE3感受態(tài),以1∶100接種于LB液體培養(yǎng)基(含100 mg/L Amp),37℃搖菌;然后加入IPTG,20℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜。接下來(lái)4℃離心收集菌體,超聲破碎15 min;再次4℃離心后的上清使用GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化。

1.5 質(zhì)粒提取、轉(zhuǎn)染及總蛋白提取

質(zhì)粒提取步驟依據(jù)試劑盒說(shuō)明書。

293T細(xì)胞在六孔板中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時(shí),更換細(xì)胞培養(yǎng)液,均勻加入轉(zhuǎn)染體系(質(zhì)粒2.5 μg,lipo8000轉(zhuǎn)染試劑4 μL,MEMα培養(yǎng)基補(bǔ)至125 μL),培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)基,用RIPA(強(qiáng))裂解液冰上裂解細(xì)胞20 min,轉(zhuǎn)至1.5 mL EP管,13000 r/min,4℃離心15 min收集上清,加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液煮沸變性。

1.6 western blot

蛋白樣品經(jīng)電泳分離后,使用半干法轉(zhuǎn)膜(電壓15 V),將蛋白轉(zhuǎn)到NC膜上。然后膜用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h,一抗(1∶1000)4℃孵育過(guò)夜,二抗(1∶10000)室溫孵育1 h。最后在膜上滴加ECL顯色液進(jìn)行顯影。

1.7 激光共聚焦實(shí)驗(yàn)

293T細(xì)胞在玻底培養(yǎng)皿中培養(yǎng),pCMV-N-DsRed-HLA-E質(zhì)粒和EGFP-C1-UL19質(zhì)粒、pCMV-N-DsRed-UL19質(zhì)粒和EGFP-C1-HLA-E質(zhì)粒分別1∶1共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后,用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15 min,再用DAPI(1 μg/mL)室溫避光染核10 min。最后加入抗熒光淬滅劑,在激光共聚焦顯微鏡下觀察VP5與HLA-E的共定位情況。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

提取BGC823細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板擴(kuò)增HLA-E基因(1～600 bp),瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增出的條帶在約600 bp處,與目的基因大小相符(圖1)。然后將回收的DNA與原核表達(dá)載體pGEX-6p-1連接,連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取11個(gè)Amp抗性菌落為模板進(jìn)行菌落PCR鑒定,均擴(kuò)增成功,條帶位置與目的基因相符(圖2)。再?gòu)闹刑羧?個(gè)送公司測(cè)序,測(cè)序得到的基因序列同GenBank中發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)序列一致。提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定(圖3),證明pGEX-6p-1-HLA-E質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 PCR擴(kuò)增HLA-E基因

圖2 菌落PCR篩選pGEX-6p-1-HLA-E重組子

圖3 pGEX-6p-1-HLA-E(EcoR Ⅰ、Not Ⅰ)雙酶切

2.2 GST-HLA-E融合蛋白的純化

破碎后的上清與GSH-瓊脂糖珠孵育,收集孵育后的上清和洗脫(共4次)下來(lái)的蛋白樣品,加入蛋白上樣緩沖液煮沸變性,然后通過(guò)SDS-PAGE分離。考馬斯亮藍(lán)染液染色(圖4)和western blot(圖5)顯示的結(jié)果一致,GST-HLA-E蛋白在45 kDa上方。

圖4 考馬斯亮藍(lán)染色

圖5 western blot驗(yàn)證純化蛋白HLA-E的表達(dá)

2.3 GST pull-down及質(zhì)譜鑒定

先使純化后的GST-HLA-E蛋白結(jié)合在GSH-瓊脂糖珠上,然后與oHSV2(RIPA強(qiáng)裂解液裂解)蛋白孵育,洗掉其中不與HLA-E結(jié)合的雜蛋白,保留剩余的樣品。質(zhì)譜分析結(jié)果為oHSV2的主要衣殼蛋白VP5與HLA-E相互作用(圖6)。

圖6 質(zhì)譜分析結(jié)果

2.4 HLA-E熒光質(zhì)粒構(gòu)建

PCR擴(kuò)增見(jiàn)2.1。回收的DNA產(chǎn)物與載體EGFP-C1、pCMV-N-DsRed連接,連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取10個(gè)Kana抗性菌落為模板進(jìn)行菌落PCR鑒定,均擴(kuò)增成功(圖7)。各挑取3個(gè)重組子送公司測(cè)序,測(cè)序得到的基因序列同GenBank中發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)序列一致。提取質(zhì)粒后,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,然后在體視熒光顯微鏡下觀察,均發(fā)熒光(圖8),同時(shí)將細(xì)胞裂解取上清進(jìn)行western blot分析,可以檢測(cè)到HLA-E(圖9),證明EGFP-C1-HLA-E、pCMV-N-DsRed-HLA-E質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖7 菌落PCR篩選EGFP-C1-HLA-E、pCMV-N-DsRed-HLA-E重組子

圖8 體視熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染HLA-E熒光質(zhì)粒的細(xì)胞

圖9 western blot驗(yàn)證熒光質(zhì)粒HLA-E的表達(dá)

2.5 UL19熒光質(zhì)粒構(gòu)建

提取oHSV2病毒DNA,以其為模板PCR擴(kuò)增UL19基因(1～1002 bp),瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖10所示。

圖10 PCR擴(kuò)增UL19基因

將回收產(chǎn)物與載體EGFP-C1、pCMV-N-DsRed連接,連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。各挑取10個(gè)Kana抗性菌落為模板進(jìn)行菌落PCR鑒定,均擴(kuò)增成功(圖11)。

圖11 菌落PCR篩選EGFP-C1-UL19、pCMV-N-DsRed-UL19重組子

各挑取3個(gè)重組子送公司測(cè)序,測(cè)序得到的基因序列同GenBank中發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)序列一致。提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定(圖12)。同時(shí)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,在體視熒光顯微鏡下看到均發(fā)熒光(圖13)。證明EGFP-C1-UL19、pCMV-N-DsRed-UL19質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖12 EGFP-C1-UL19(Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ);pCMV-N-DsRed-UL19(EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ)雙酶切

圖13 體視熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染UL19熒光質(zhì)粒的細(xì)胞

2.6 激光共聚焦實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證HLA-E與VP5蛋白相互作用

HLA-E和UL19熒光質(zhì)粒1∶1共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,細(xì)胞經(jīng)過(guò)固定、染核處理后,在激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示,無(wú)論質(zhì)粒帶何種熒光標(biāo)簽,熒光均在細(xì)胞質(zhì)中分布,在熒光疊加后,可以觀察到HLA-E和VP5蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的共定位(圖14)。

圖14 激光共聚焦實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證HLA-E與VP5蛋白相互作用

3 結(jié)論

已有研究報(bào)道HCMV(人巨細(xì)胞病毒)、HCV(丙型肝炎病毒)也存在病毒感染引起HLA-E表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象。HCMV感染細(xì)胞后,通過(guò)其糖蛋白UL40產(chǎn)生的多肽與HLA-E結(jié)合,上調(diào)HLA-E在細(xì)胞表面的表達(dá),然后通過(guò)CD94/NKG2A受體,從而逃脫NK細(xì)胞的裂解[11]。Nattermann等在HCV中也發(fā)現(xiàn)了類似的機(jī)制,HCV導(dǎo)致HLA-E上調(diào),通過(guò)其與CD94/NKG2A的相互作用,從而抑制NK細(xì)胞的裂解功能[12]。但EBV(Epstein-Barr病毒)能夠產(chǎn)生一種多肽綁定HLA-E分子,破壞NKG2A的識(shí)別,導(dǎo)致NK細(xì)胞的激活[13]。我們前期也發(fā)現(xiàn)oHSV2在體外上調(diào)部分腫瘤細(xì)胞系表面HLA-E的表達(dá)水平。為了研究oHSV2是否也能與HLA-E結(jié)合,從而通過(guò)CD94/NKG2A調(diào)控NK細(xì)胞激活或抑制,本文應(yīng)用GST pull-down和質(zhì)譜技術(shù)篩選出了oHSV2的VP5蛋白(由UL19基因編碼)為HLA-E的相互作用蛋白,并進(jìn)行了初步驗(yàn)證。

HSV-1/HSV-2 UL19基因編碼的VP5蛋白是病毒的主要衣殼蛋白,是一種晚期(leaky-late)表達(dá)蛋白,在感染復(fù)制周期中晚期最高表達(dá)[14]。冷凍電子顯微鏡下觀察到HSV-2(MS株)衣殼結(jié)構(gòu)由大約3000個(gè)蛋白質(zhì)組成,分為3種類型:六鄰體(hexons)、五鄰體(pentons)和三聯(lián)體(triplexes)。六鄰體和五鄰體都包含VP5(六鄰體還包含VP26);三聯(lián)體包括VP23和VP19C。VP5蛋白形成了廣泛的分子間網(wǎng)絡(luò),包括多個(gè)二硫鍵(總共約1500個(gè))和非共價(jià)相互作用,與VP26蛋白和三聯(lián)體支撐衣殼穩(wěn)定和裝配[15]。

我們截取UL19基因前1002 bp構(gòu)建了紅/綠熒光質(zhì)粒,與HLA-E的熒光質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,通過(guò)激光共聚焦顯微鏡的觀察,發(fā)現(xiàn)它們?cè)诩?xì)胞質(zhì)中有共定位。但這只是初步的驗(yàn)證,后期將進(jìn)行免疫共沉淀(co-IP)和雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)實(shí)驗(yàn)作進(jìn)一步驗(yàn)證。