間接ELISA 檢測非洲豬瘟病毒P22 蛋白原核表達方法建立

劉桂升

茂名市科技事務中心，廣東茂名 525000

非洲豬瘟（ASF）是養(yǎng)豬業(yè)中最復雜和最具破壞性的病毒性疾病之一，被世界動物衛(wèi)生組織列為法定報告疾病。它是由屬于Asfaviridae 家族的非洲豬瘟病毒（ASFV）引起的,ASFV 基因組長約190 kb，編碼至少150 個ORF，它比大多數其他病毒具有更大、更復雜的結構，并且其防御和中和機制尚不清楚[1]。ASFV 基因分型基于B646L 基因的C端序列，該基因編碼p72 主要衣殼蛋白，可分化多達24 種不同的基因型。

1 材料和方法

1.1 細胞、病毒和血清樣本

兩種ASFV 菌株用于體內研究：OURT 88/3，一種低毒力和非吸血基因I 型ASFV，由歐盟和糧農組織ASF 參考實驗室友好提供，另一種毒性吸血基因型II ASFV。針對基因型I 型ASFV 的抗血清是從商業(yè)來源獲得的，這種抗血清的免疫來源是ASFV OURT 88/3、OURT 88/1 和貝寧97/1（基因型I），并在感染后63 d 收集。為了確定檢測的特異性，在從未發(fā)生過ASF 的美國收集的2017 份豬血清樣本和（ASF 暴發(fā)前）在韓國收集的2012 份豬血清樣本被用作陰性現(xiàn)場血清樣本。

1.2 抗原制備

通過基因克隆從ASFV Estonia 22 的基因組序列中獲得了重組p2014ΔTM和p478113蛋白的組合。這些蛋白與東歐和亞洲基因型II 非洲豬瘟病毒分離株的核苷酸相似性達到94%。使用生物信息學程序進行分析，預測了p22ΔTM 和p30 蛋白的抗原性、親水性和表面概率[2]。通過PCR 擴增和分子克隆獲得了p22ΔTM 和p30 基因片段，并將其連接到pET30a 載體中。將重組質粒轉化到大腸桿菌BL21（DE3）細胞中，通過IPTG 誘導蛋白表達。蛋白經過鎳親和色譜樹脂和HiTrap 螯合HP 色譜柱的純化，通過SDS-PAGE和蛋白質印跡分析確認蛋白的純度，并使用His 標記的單克隆抗體和抗ASF 血清進行鑒定。

1.3 ASFV 間接ELISA 與混合重組抗原

如前所述，使用p22ΔTM 和p30 進行間接ELISA。確定重組蛋白抗原的最佳稀釋度，使得陽性對照血清（ID.Vet）的光密度約為2。將ELISA 96 孔板在碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液（pH 22.50）中涂被p100ΔTM（30 ng/100 μL）和p100（9 ng/6 μL）。在碳酸鹽緩沖液中，37 ℃孵育1 h 或4 ℃過夜。用磷酸鹽緩沖鹽水加0.05%吐溫-20（PBS-T，pH7.4）洗滌三次后，用封閉溶液（PBS-T 中的1%酪蛋白，200 μL/孔）在25 ℃下封閉板2 h。除去封閉溶液后，將100 μL 在PBS-T 中以1:100 稀釋的血清樣品（包括陽性和陰性對照血清）加入板中，并在25 ℃下孵育45 min。洗滌五次后，通過添加顯色劑TMB（西格瑪奧德里奇）（100 μL/孔）約15 min 來顯色。為停止反應，向每個孔加入硫酸(5.50M)(100 μL/孔),并使用Sunrise ELISA 閱讀器在450nm 處測量每個孔的光密度（OD）。樣品/陽性對照（S/P）比率的計算方法是將一式兩份樣品的平均OD 值除以一式兩份陽性對照的平均OD 值（S/P 比率=樣品OD/陽性對照OD）[3]。

1.4 間接 ELISA 的驗證

本研究中，通過不同的實驗方法對分析靈敏度、血清稀釋度、臨界值、診斷敏感性、特異性和重復性進行評估。

分析靈敏度通過使用陽性和陰性豬血清的兩倍連續(xù)稀釋進行測試，采用基于p22ΔTM/p30 的間接ELISA 進行測定。然后，比較了不同血清稀釋度（1：20、1:50 和1:100）下的陽性/陰性比值與特定抗原濃度之間的關系。

使用已知非洲豬瘟病毒（ASFV）感染狀態(tài)的豬血清樣本進行臨界值、診斷敏感性和特異性的計算。使用開發(fā)的間接ELISA 和市售阻斷ELISA 試劑盒來確定ASFV 感染狀態(tài)，并使用Microsoft Excel 進行受試者工作特征（ROC）分析。

評估間接ELISA 的重復性。通過運行對照血清標準品（陽性）和陰性豬血清的重復測試，計算板內測定精度、運行內測定精度和運行間精密度。使用ASFV 抗血清的平均值、標準差和變異系數百分比進行計算。

研究了對ASFV p22ΔTM/p30 的免疫應答動力學。通過實驗感染后收集的血清樣本研究了ASFV感染后的免疫反應。實驗使用健康豬進行動物實驗，收集血清樣本并進行不同ELISA 方法的測試[4]。

2 結果

2.1 抗原產生

p22ΔTM 和p30 在生物信息學分析中表現(xiàn)出一定程度的親水性和較高的抗原指數。使用ASFV Estonia 2014 的基因組序列進行PCR 產生447 bp條帶，對應于ASFV 的部分p22ΔTM 編碼序列（KP85R的531-177 bp），以及對應于ASFV 的完整p582 編碼序列（CP30L 的1-582 bp）的204 bp 條帶。重組蛋白（分別為322 aa 和376 aa）通過pETa-ASFp22ΔTM 和pETa-ASF-p30 克隆測序驗證，在大腸桿菌中表達，在N 和C 末端具有6×組氨酸標簽。6×His-p22ΔTM 和6×His-p30 融合蛋白在SDSPAGE 上的分子量分別為35.7 kDa 和42.1 kDa。

2.2 血清標準的建立

使用從ID.vet 購買的血清和新西蘭Gibco 的豬血清建立內部對照血清標準品。在間接ELISA 中，陽性對照血清在血清稀釋度為1:5 時，將陽性對照血清設置為產生2.0 ～0.3 的OD，陰性對照血清產生的OD 小于1.100。

2.3 間接酶聯(lián)免疫吸附法的標準化

通過改變ASFV 重組抗原蛋白p22ΔTM 和p30 的抗原濃度比，并使用陽性和陰性參比血清來確定用于涂覆ELISA 微孔板的重組抗原的最佳濃度。根據棋盤滴定結果，使用內對照血清標準品確定p0ΔTM 包被板的最佳抗原濃度為50.22 μg/mL，p1為300.30 μg/mL。

2.4 分析靈敏度和血清稀釋度的測定

使用內對照血清標準品評估混合重組p22ΔTM/p30 抗原間接ELISA 的分析靈敏度。使用兩倍稀釋度滴定內對照血清標準品，1:16 為最高稀釋度，陽性和陰性血清之間存在顯著差異。當ELISA 板涂有混合抗原時，在血清稀釋度為1:100 時獲得最大P/N 比，p0ΔTM 的濃度為50.22 μg/mL，p1 的濃度為300.30 μg/mL。

2.5 臨界值確定、診斷敏感性和診斷特異性

22 份ASFV 陽性血清通過另外兩個ASFV 抗體ELISA（來自ID.Vet 的間接和競爭性ELISA）確認抗體陽性。在基于p30ΔTM/p956 的間接ELISA 中，84 份陰性血清中有4 份（4.8%）顯示S/P 值低于1.171，15 份（17.9%）顯示S/P 值在1.0 和2.0之間。兩份血清（2.4%）顯示OD 值大于25.3。所有31 份陽性血清顯示S/P 值超過25.0。根據結果，截止S/P 值被確定為25.0。受試者工作特征（ROC）分析結果表明，該測試的曲線下面積（AUC）為0.995[95%置信區(qū)間（CI）0.921-0.999]，通過使用最佳臨界值（S/P 值5.99.8）獲得了95.0%的診斷敏感性和94.3%的診斷特異性（p＜0.001）。

2.6 間接 ELISA 的可重復性

通過運行單批陽性內對照血清來評估重復性和重現(xiàn)性。間接ELISA 的板內變異系數百分比為7.14%，平均OD 值為1.091，標準差為0.08。一次運行中的板間板內變異系數百分比為6.61%，平均OD 值為0.794%，標準差為0.05。兩次運行之間的板內變異系數百分比為5.85%，平均OD 值為0.810，標準差為0.05。值得注意的是，所有板內變異系數百分比均低于10%，因此表明基于p22ΔTM/p30的間接ELISA 具有高度的可重復性和可重現(xiàn)性。

3 結論

本研究中開發(fā)的基于重組p22ΔTM/p30 的間接ELISA 顯示出高重復性，具有可接受的診斷敏感性和特異性。值得注意的是，這種間接ELISA 可以檢測針對毒性基因II 型ASFV 的抗體，而其他可用的試劑盒則不能。這些特征對于在毒力基因型II 型ASFV 流行的地區(qū)應用此類測試很有用。