羊衣原體病檢測方法的研究進展

曲 磊，魏 天，王成宇，王思月，肖 丹，張芳毓，王永志

吉林省農業科學院畜牧獸醫研究所，吉林長春 130118

羊衣原體病是由衣原體引起的一種亞急性、感染性疾病，在我國各地均有發生，任何品種、日齡和性別的羊均能感染，母羊和羔羊的易感性相對較高。該病主要通過排泄物（如糞便、尿液）、分泌物（如淚液、鼻液）、流產胎兒、呼吸道（污染的塵埃、氣溶膠）及破損的皮膚、黏膜等感染其它健康羊只。另外，羊的自身免疫機能強弱也是患羊衣原體病的原因之一，免疫能力越弱，患病概率就越大，免疫能力弱可能與飼養管理不當、環境衛生不良、攝取營養不均等有關。羊感染后體內持續帶菌，感染初期無明顯臨床表現，懷孕母羊通常在妊娠后期流產、產弱羔或死胎等，臨床上還較多見關節炎、結膜炎或胸膜肺炎等癥狀，嚴重制約了養羊業的快速健康發展。

為了有效遏制羊衣原體病的廣泛傳播、擴散，開展早期檢測意義重大。目前，針對羊衣原體病的檢測方法主要為病原學檢測、血清學檢測及核酸檢測3 個方面。本文就上述檢測方法逐一論述，為檢測羊衣原體病提供參考。

1 病原學檢測

1.1 病原分離培養

病原分離培養主要為雞胚分離法、細胞培養法和小鼠接種等方法。雞胚分離法技術成熟，將處理后的0.4 mL 樣品接種到7日齡雞胚卵黃囊中，置37 ～38.5 ℃環境下孵育，收集接種后4 ～7 d 出現規律性死亡的卵黃囊膜涂片，觀察是否有衣原體染色顆粒。

細胞分離法對細胞生存環境非常嚴格，流產衣原體常用McCoy、BGM 和BHK 細胞分離，將處理后的病料接種至單層細胞，37 ℃、5% CO2條件下孵育2 h，2 ～3 d 后染色鏡檢鑒定。

遇污染嚴重病料，可選擇3 ～4 d 的小白鼠，采用腹腔注射0.5 ～1 mL、腦內接種0.02 mL 或滴鼻2 ～3 滴方式接種，腹腔注射4 ～7 d 后，剖檢取臟器表面淡灰黃色、黏稠的滲出液染色鏡檢鑒定，以腦、肺、肝、脾涂片也可觀察到衣原體。

病原的分離始終被認為是診斷衣原體感染的“金標準”和最敏感的檢測方法，也可以對毒株進行適當的分型，但缺點是對生物樣本的采集、儲存及運輸要求較高，需要依靠專業技術人員及培養設施，確診時間較長，同時需要考慮安全問題。

1.2 病原的鑒定

無菌條件下，將可疑病畜的胎盤、流產胎兒、陰道拭子等組織直接涂片，通過染色鏡檢法鑒定病原，常用方法有姬姆薩氏染色法、碘染色法等。姬姆薩染色技術簡單，特異性較高。采集的樣本涂片甲醇固定，用稀釋后的姬姆薩染色液染色，無菌生理鹽水沖洗，自然風干，通過光學顯微鏡的油鏡觀察到包涵體中的原生小體呈紫紅色，不具有感染性的網狀體呈藍紫色。碘染色法與姬姆薩染色類似，樣本涂片后經甲醇固定，碘染后，油鏡觀察可以看到紫紅色的原生小體顆粒和藍色的網狀體顆粒。直接染色鏡檢觀察較直觀，但缺點是靈敏度很低，適用于感染較嚴重的組織。此外，流產衣原體的染色特征與柯克斯體相似，存在誤檢、漏檢的可能，不適合大規模的檢測。

直接免疫熒光試驗，將熒光標記的多克隆抗體或單克隆抗體滴到涂片上，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3 遍，自然晾干后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的包涵體即可確診為陽性。該方法的優點是特異性高、操作簡單、用時較短；缺點是對儀器要求較高，敏感性較差。

酶免疫測定法（EIA）利用衣原體抗原與酶標抗體的特異性反應，當加入酶的底物出現特征性的反應即判定為陽性，優點是時間短，適合批量檢測；缺點是易與其它微生物發生交叉反應。

2 血清學檢測

2.1 補體結合實驗(CFT)

CFT 是最常用的血清學檢測方法之一，該檢測方法操作繁瑣特異性強，也常用作于衣原體性質識別以及抗原（抗體）研究。該試驗原理包括反應系統、補體系統和指示系統。首先，反應系統與補體作用，隨后，指示系統利用剩余補體反應。若反應系統中有抗體或抗原，則形成免疫復合物而固定和消耗補體，使隨后加入的指示系統無多余補體可利用，則無溶血反應發生，反之亦然。不溶血為補體結合試驗陽性。但由于參與反應的成分多，影響因素復雜，運用該方法有時候會得到假陽性的結果。

2.2 酶聯免疫吸附試驗(ELISA）

ELISA 主要是用已知酶標記的抗體或抗原去檢測與某種固相載體表面結合的未知抗體或抗原，根據反應顏色的深淺做定量或定性分析。在用此方法檢測羊衣原體時，由于衣原體脂多糖（LPS）抗原與一些革蘭氏陰性菌上的表位一致，故會出現假陽性的可能。為防止假陽性的出現，可以考慮用含有特異性單克隆抗體的ELISA 試劑盒，但此試劑盒靈敏度較低，需樣本濃度較高。

2.3 間接血凝試驗(IHA）

將羊衣原體抗原(抗體)包被于綿羊紅細胞表面，成為致敏的載體，然后再加入相應的抗體（抗原）結合，出現肉眼可見的凝集，即為IHA。IHA 的優勢在于檢測效率高、敏感性好，在臨床上得到廣泛應用，在羊衣原體血清學調查方面起到至關重要的作用。

2.4 膠體金免疫層析技術(GICA）

GICA 是一種成本低、易操作、高特異性、肉眼判定的檢測方法。它是以膠體金為顯色媒介，應用于抗原抗體特異性結合的一種新免疫標記技術，它需要在層析過程中完成這一反應，原理與ELISA試劑相似，適用于現場檢測，結果可迅速判定。

3 核酸檢測

3.1 基因探針檢測法

基因探針即核酸探針，是已知且帶有檢測標記的，與目的基因互補的DNA 或RNA 片段。其檢測方法操作繁瑣、靈敏性較高。現已有上市的商品化試劑盒。用基因探針檢測法來檢測衣原體，主要是檢測羊衣原體單鏈RNA。

3.2 聚合酶鏈式反應(PCR）

PCR 是實驗室最常用的核酸檢測方法，應用于體外擴增目的基因片段，此方法經過三個基本反應（變性、退火、延伸），用于定性或半定量檢測。PCR 以速度快、靈敏度高、特異性強等特點被廣泛應用于國內外衣原體的檢測中。

3.3 熒光定量PCR(qPCR)

qPCR 是在傳統的凝膠電泳PCR 方法的基礎上，極大提高了檢測的特異性和敏感性，適用于定量分析。它是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR 產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。此方法在檢測衣原體的外膜主要蛋白基因和多形態膜蛋白基因方面得到廣泛應用。

3.4 環介導等溫擴增(LAMP）

LAMP 不僅是一種新的核酸擴增技術，而且在分子生物學檢測領域得到廣泛應用，它是一種成本低、特異性強、不依賴任何儀器設備、適合臨床大批量檢測的高通量快速檢測方法。它的特征是根據靶基因上的六個區域來設計的四條引物，利用鏈置換Bst DNA 聚合酶進行恒溫擴增反應，15 ～60 min可實現指數級的擴增，通過反應擴增產物的有無來判斷靶基因是否存在。

3.5 限制性片段多態性分析(RFLP）

RFLP 是一種操作復雜、成本高、檢測結果可靠、適合小規模檢測的DNA 標記技術。它是檢測DNA 在限制性內切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小，再將這些片段電泳、轉膜、變性，與標識標記過的探針進行雜交，洗膜，即可分析其多態性結果。

3.6 DNA 微陣列

DNA 微陣列是將大量的探針分子固定于載體上后與標記的待測樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度從而獲得待測樣品分子的數量和序列信息。該技術能進行高通量的檢測，但不能在多細胞類型組織中對待檢的基因精確定位進行判斷。目前，檢測流產衣原體的DNA 微陣列商品化產品很多。該技術主要流程為芯片的制備、樣品的制備、雜交反應及芯片信號的檢測與分析。

4 小結

羊衣原體病不僅給養羊業造成巨大的經濟損失，而且還是重要的人畜共患傳染性疾病，危害著人類和家畜的健康安全。檢測羊衣原體病的方法非常重要，它可以有效地遏制傳染源、降低患病風險。羊衣原體檢測技術經過流行病學調查、分離鑒定、免疫學檢測到現在的分子生物學檢測，檢測技術越來越多。本研究主要講述病原學、血清學及核酸檢測方法在檢測羊衣原體方面發揮的作用，雖部分檢測方法存在一些缺點，但可為檢測羊衣原體病提供參考。