男性精子DNA 碎片率與年齡、精液參數的相關性研究

徐嵐，胡泉，黃麗麗

咸寧市中心醫院（湖北科技學院第一附屬醫院）生殖中心，湖北咸寧 437100

據研究報道，中國大約有15%的育齡夫婦面臨不孕不育困境[1]。當前，臨床對男性生育力的評估主要依據WHO 標準通過對精子濃度、精子活力、形態等指標來判斷，只能反映精液的一般現狀，即使檢測正常也可能被診斷為不育，臨床上需要尋找能預測男性生育能力的檢測方法[2]。當前研究表明，高齡患者體內活性氧（reactive oxygen species, ROS）自由基過度產生會損傷精子DNA，導致精子受精能力下降[3]，因此高齡對男性精子的DNA 完整性可能存在不利影響[4]。而又有研究表明，男性精子頭部DNA 完整性（DNA fragmetation index of sperm, DFI）受損可能會增加其配偶發生復發性流產的風險[5]，因此完善精子DNA 碎片的檢測對男性生育力的評估非常重要。本研究回顧性分析2021 年8 月—2022 年8 月在咸寧市中心醫院生殖醫學中心就診的503 例男性患者的精液常規指標和DFI 指數，分別按照年齡和DFI 指數分組，探討不同年齡組、不同DFI 組精液質量的差異。現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

在獲得患者及其家屬知情并同意的情況下選取在本院生殖醫學中心就診的503 例男性患者作為研究對象，年齡23～50 歲。此次研究獲得咸寧市中心醫院生殖醫學中心倫理委員會批準。

1.2 納入與排除標準

納入標準：男性身體健康，無睪丸外傷，無家族遺傳性疾病及性功能障礙病史，無不良生活習慣（嗜煙、嗜酒、吸毒等）；無腮腺炎病史；男性體征明顯，睪丸、附睪及輸精管體檢無明顯異常。排除標準：患者無遺傳性疾病家族史、無隱睪、睪丸腫瘤、無精癥、精索靜脈曲張、腮腺炎病史等。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 患者在取精前禁欲2～7 d，洗凈雙手手淫法取精，且精液完整取出收集在取精杯內，稱重后立即放置于37℃恒溫箱內溫育至完全液化后檢驗。

1.3.2 精液常規檢測 用3 mL 巴斯德吸管上下吹吸使精液完全液化，充分混勻后移液器取10 ul 精液樣本于makler 計數板加樣池中，然后采用計算機輔助精液分析系統（CASA BEION V4.2）對男性精液參數進行分析。

1.3.3 精子形態學檢測 將精液標本制片干燥至少4 h并采用改良巴氏染色法染色，制片完成后將由檢驗人員按照第五版操作手冊[6]正常精子判定標準在100 倍油鏡下篩選至少200 條精子，并計算正常精子形態百分率，≥4%即為正常。

1.3.4 精子染色質結構分析 將適量精液標本，用緩沖液稀釋成濃度為（1.5～2.0）×106/mL 的100 μl 精子懸液，然后與200 μl 酸處理液混勻30 s，再加入600 μl 吖啶橙染液進行染色，再將標本置于流式細胞儀檢測，每個待檢測精液標本至少檢測1 000 個精子，吖啶橙染液對精子核進行染色，用于評估單鏈和雙鏈DNA 的比例。采用精子DFI 表示精子DNA 損傷的程度，并對研究對象進行分組。目前臨床上用于檢測DNA 損傷的方法主要有：彗星實驗，精子染色體結構檢測（sperm chromatin structure assay, SCSA），精子染色質擴散實驗（sperm chromatin diffusion, SCD），TUNEL 檢測以及基于熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, FISH）技術等。與其他檢測方法相比SCD 是一種性價比高的檢測方法且已經廣泛應用于臨床。

1.4 觀察指標

根據WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5 版）[6]精液各項參數的參考標準如下：禁欲天數：2～7 d，精液體積≥1.5 mL，pH:7.2～8.0，精子濃度≥15×106/mL，精子總數≥39×106個，前向運動精子PR≥32%，總活力PR+NP≥40%，不動精子IM＜60%，正常精子形態≥4%，精子DNA 碎片指數（DFI）參考值＜25%。

1.5 統計方法

采用SPSS 26.0 統計學軟件分析數據，非正態分布采用中位數(四分位間距)[M（P25，P75）]來描述，方差不齊采用多個獨立樣本的非參數（Kruskal-Wallis H）檢驗法對數據進行分析。對于不服從雙變量正態分布的計量資料進行spearman 秩相關性分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同程度DFI 組男性精液參數比較

3 組結果分析表明，年齡越大，DFI 指數越高，不動精子占比越高，而精子總活力越低，正常精子形態率越低，差異有統計學意義（P＜0.05），其他參數比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 男性精子DFI 與年齡、精液常規參數的相關分析

精子DFI 與患者年齡、不動精子呈正相關（P＜0.001）；與精子總活力、精子正常形態率呈負相關（P＜0.001）；而其他參數與精子DNA 碎片不存在相關性（P＞0.05），見表2。

表2 精子DFI 與年齡、精液參數的相關性分析

3 討論

研究表明，高齡、吸煙、生活作息不規律等不良生活習慣等因素會影響精子產生、降低精子質量和損害精子功能，導致精子DNA 受損和男性不育[7]。學者們對男性不育患者的年齡與其精子DFI 相關性的研究比較多，且一致認為DFI 水平越高，顯示研究對象年齡越大，這類似的結果也在一些研究中得到證實，例如當男性年齡＞35 歲時精液質量開始下降；20～35 歲組精子DNA 碎片率顯著低于36～57歲[8-9]等，本文結果也證實了這一點。高齡之所以影響男性生育力，其機制可能是高齡男性睪丸結構及功能發生異常改變，而精液內活性氧自由基濃度升高，同時伴隨體內抗氧化能力減弱，繼而造成精子頭部DNA 單鏈或雙鏈出現損傷和斷裂，影響男性生育功能[10]。另外其他精液參數分析結果顯示，隨著DFI 水平的增加，精子總活力下降、正常形態精子率顯著降低，不動精子占比增加；相關性分析結果顯示，精子DFI 與患者年齡、不動精子呈正相關，與精子總活力、精子正常形態率呈負相關，而與其他參數不存在相關性。因此檢測精子 DFI 可以在一定程度預測受檢者的年齡、精液中的精子活力和精子形態等情況。研究表明，隨著男性年齡的增大，會導致精液質量下降，精子活力降低以及正常形態精子比例減少[11-12]，這與本研究的結果一致。而辜秀麗等[13]研究表明精子DFI 與精子活力（r=-0.406，P＜0.001）顯著相關，DFI 影響精子活力，與本研究結果“精子DFI 與精子活力（r=-0.365，P＜0.001）具有相關性”一致。此外，本研究中DFI 與精子濃度卻沒有明顯相關性，但隨著DFI 水平的增加，精子濃度有下降的趨勢，這可能與樣本選擇有關。DFI 影響精子活力與精子形態的機制可能是因為高齡患者精子DNA 損傷程度越高，為精子運動提供能量的線粒體功能缺陷越嚴重，導致精子運動能力下降，同時也會誘導精子細胞發生凋亡，引起精子形態結構的改變[14]。這在Xu S 等[15]研究中有類似報道，男性年齡在40 歲以后精子總活力和精液參數則開始下降。在另外一篇文獻中也報道DFI≥25%組男性精子總活力、正常精子形態率明顯低于DFI＜25%組，受精率、可移植胚胎率、優胚率、妊娠率均劣于對照組，而流產率高于對照組[16]。其他也有類似報道顯示DFI＞30%的男性配偶受精率不顯著低于DFI≤30%的男性配偶，但其囊胚發育不良的風險會更高[17]。這表明高DFI 指數不僅明顯降低精子活力和正常精子形態，而且導致不動精子占比增加，繼而影響男性配偶受精率，還可能導致囊胚發育不良，男性的生育能力明顯下降。

綜上所述，男性高齡對精子參數有顯著影響，因此高齡男性在生育前應該進行全面的精液質量分析，充分評估男性生育能力，才能更有利于患者治療。在今后的研究中還將探討精子DNA 損傷對輔助生殖技術后生育結局的影響，進一步探索精子DFI 在男性不育中的臨床應用價值。