MiR-132-3p調控FZD4/Wnt/β-catenin通路抑制類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞增殖和侵襲

梁舒，崔玉榮，吳潔，張超，郭占非，高曉，許振丹，范文強

新鄉市中心醫院&新鄉醫學院第四臨床學院風濕免疫科，河南 新鄉 453000

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫性疾病[1]。RA的誘導因子有病毒感染、激素失調以及基因表達失調[2]。RA 患者會出現增生性的滑膜襯里組織，能夠導致患者致殘以及死亡率增加，滑膜襯里組織包含大量成纖維細胞樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，FLSs)。FLSs 能夠產生炎癥細胞因子和分解代謝酶，主要通過和其他免疫相關因子作用促進關節炎癥[2-3]。當FLSs激活后，其遷移和入侵能力會增加，這種特性有助于RA發展[4]。因此探究RA 中FLSs 表型的改變有助于發展RA 治療方案。微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一類不具有蛋白編碼能力的小RNAs，目前已經成為生物醫學研究的一個重要領域[5]。此類小RNAs除了能夠和長非編碼RNAs 以及miRNAs 作用，也能夠結合并破壞mRNAs轉錄[6]。研究指出一些miRNAs失調可能使個體易患RA，這些miRNAs 包括miR-126-3p、miR-339-5p 和let-7i-5p 等[7]，另外有證據表明血清miRNA 水平可以預測RA 治療的反應[6]，表明miRNAs 具有治療RA 的潛力。有文獻已報道miR-132-3p 參與調控顳下頜關節骨關節病[8]，并且具有預測甲氨蝶呤治療RA反應的能力[9]。Tseng等[10]的預測也表明miR-132-3p在RA患者滑膜組織中的表達是失調的，但目前miR-132-3p調控RA 的機制尚不明確。 因此本研究圍繞miR-132-3p 對RA-FLSs 表型影響以及相關機制展開研究，報道如下：

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 miRNA 提取試劑盒、無核酸酶超純水、miRNA 逆轉錄試劑、cDNA 第一鏈合成逆轉錄試劑盒、高特異性染料法qPCR 預混液、TsingZol 總RNA 提取試劑、高純度低電滲瓊脂糖、聚丙烯酰胺電泳預制凝膠和蛋白Marker 購自北京擎科生物；蛋白電泳儀購自美國Invitrogen 公司；增強型ECL 化學發光檢測試劑盒、脫脂奶粉、磷酸緩沖液、RIPA 裂解液、Βradford 蛋白定量試劑、pcDNA3.1 (+)載體和FZD4 過表達載體購自南京諾唯贊生物；蛋白成像系統購自美國UVP 公司；MTT 實驗試劑購自廣州賽云生物；酶標儀購自美國Thermo Fisher 公司；EdU 增值試劑盒、miR-132-3p 模擬物、基因定量分析所用引物、riboFECT?mRNA 轉染試劑和miRNA 陰性對照(miR-NC)均由廣州銳博生物提供；結晶紫、細胞凋亡檢測試劑、FZD4、β-catenin、和c-Myc 抗體、減血清培養基、聚偏氟乙烯膜、二抗抗體和雙熒光素酶檢測試劑購自北京索萊寶生物；基底膜基質購自美國Corning公司；CyclinD1抗體購自武漢三鷹生物。

1.2 實驗方法

1.2.1 滑膜組織收集 于2022年3月至2022年6月在新鄉市中心醫院或新鄉醫學院接受治療的32 例RA患者和27例非RA患者分別提供了32份膜組織和27份正?；そM織(每例患者一份)。每例患者在手術前簽了知情同意書。收集的滑膜組織儲存在-80℃環境中，樣品收集經醫院倫理委員會批準。

1.2.2 RA-FLSs 分離與培養 依據已出版的細胞分離步驟[11]從收集的RA 滑膜組織和非RA 滑膜組織中分離RA-FLSs。首先去除滑膜組織中的脂肪和血管等組織，清洗后，將組織切為1 mm3左右放到裝有適量DMEM完全培養基的培養瓶中，將培養瓶放到含有5%二氧化碳的溫度為37℃的培養箱，在培養期間細胞需每隔3 d 傳代一次；大概14 d 左右，RA-FLSs會從培養的組織中遷移出來并生長成細胞單層，此后培養單層的RA-FLSs，傳代3～5 次的RA-FLSs 凍存在液氮中已備后續實驗所用。

1.2.3 細胞處理與分組 分離的RA-FLSs 匯合度在90%左右時，用磷酸緩沖液清洗兩次，進行傳代培養，根據每個實驗所需培養孔計算所需細胞量，待細胞匯合度達到30%～50%時進行細胞轉染。用減血清培養基稀釋riboFECTTMmRNA 轉染試劑，將此混合液分別和miR-132-3p 模擬物、模擬物陰性對照、pcDNA3.1(+)載體以及FZD4 過表達載體在室溫下孵育5 min 后并根據各個實驗目的將這些寡聚核苷酸和載體單獨或者一起加到培養板中，在培養箱培養48 h，收集細胞后進行功能實驗。單獨轉染miR-132-3p 模擬物以及模擬物陰性對照的培養板記為miR-132-3p組和miR-NC組；聯合轉染miR-132-3p和pcDNA或者FZD4的記為miR-132-3p+pcDNA組以及miR-132-3p+FZD4組。

1.2.4 基因定量分析 RNA 提取操作嚴格按照miRNA提取試劑盒和TsingZol 總RNA 提取試劑說明書步驟。RNA 濃度和質量在微量核酸蛋白分析儀上檢測，隨后計算cDNA 反轉錄所需RNA 的體積，將相應體積的RNA和引物(表1)、miRNA逆轉錄試劑以及cDNA 合成試劑混合合成cDNA。高特異性染料法qPCR預混液用于基因定量分析。利用2-ΔΔCt法分析定量數據。

表1 定量分析所用引物Table 1 Primer sequences used in qPCR

1.2.5 細胞活力分析 接種在96孔板的RA-FLSs培養在正常條件下，待細胞密度達到30%～50%時按照以上方法進行細胞轉染，在培養箱中繼續培養48 h，每孔中加入MTT 試劑并孵育4 h，形成的甲攢結晶用二甲基亞砜溶解，最終用酶標儀分析樣品。

1.2.6 細胞增殖實驗 接種在6孔板的RA-FLSs在正常條件下培養，細胞融合度30%～50%時按照以上方法進行細胞轉染，48 h后將細胞傳代至96孔板(已加有標準濃度EdU 試劑)。細胞和EdU 試劑共孵育2 h后，在RA-FLSs 和Triton X-100、多聚甲醛以及DAPI共培養后，根據熒光顯微鏡下EdU陽性的細胞來確定細胞增殖情況。

1.2.7 細胞侵襲分析 用帶有8 μm 孔室的12 孔板分析細胞侵襲，該12孔板的上室底部涂有基質。將RA-FLSs 接種到上室，并培養在無血清的DMEM 中，同時在培養板的下室添加含有15%胎牛血清的DMEM。24 h后用顯微鏡觀察下室細胞數量。

1.2.8 雙熒光素酶報告實驗 利用在線數據庫預測miR-132-3p 和FZD4 互補序列，FZD4 野生型質粒和突變載體(WT-FZD4 3'UTR和MUT-FZD4 3'UTR)依據是否將FZD4 3'UTR 和miR-132-3p 互補序列突變而構建。點直接突變試劑盒用于FZD4 3'UTR 和miR-132-3p 互補序列的突變。利用PCR 技術擴增包含所預測結合位點的FZD4 3'UTR 序列，將點突變后的FZD4 3'UTR 序列送生物公司合成，最終將PCR 擴增的序列和合成的序列引入pmirGLO 載體構建上述報告載體。細胞轉染48 h后檢測雙熒光素酶活性。

1.2.9 蛋白表達分析 RIPA 裂解液制備蛋白樣品，蛋白的濃度利用Βradford 蛋白定量試劑分析。將20 μg蛋白和蛋白Marker加入到聚丙烯酰胺電泳預制凝膠中，用蛋白電泳儀將不同分子量的蛋白分離開，隨后蛋白轉到聚偏氟乙烯膜上，用脫脂奶粉封閉后，將膜和FZD4、β-catenin、c-Myc 和CyclinD1抗體孵育，隨后與二抗抗體孵育。最終用增強型ECL 化學發光檢測試劑盒和蛋白成像系統顯現蛋白條帶。

1.3 統計學方法 應用GraphPad Prism 統計學軟件分析數據。計量資料以均數±標準差()表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MiR-132-3p 在RA 患者和RA-FLSs 中的表達 如圖1A 所示，與對照組滑膜組織比較，miR-132-3p 在RA 患者滑膜組織中低表達，差異有統計學意義(P＜0.05)。而且結果展示miR-132-3p 在RA-FLSs 中的表達低于正常纖維樣滑膜細胞中的表達，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖1Β。

圖1 miR-132-3p在滑膜組織和成纖維樣滑膜細胞中的表達Figure 1 Expression analysis of miR-132-3p in synovial tissue and fibroblasts synovial cells

2.2 MiR-132-3p 抑制RA-FLSs 增殖和侵襲 本研究數據顯示miR-132-3p在miR-132-3p模擬物轉染的RA-FLSs中的表達比在miR-NC轉染的RA-FLSs中高，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖2A，說明miR-132-3p模擬物能促進miR-132-3p的表達。隨后發現miR-132-3p 模擬物轉染后RA-FLSs 活力、EdU陽性細胞數以及侵襲細胞數減少，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見圖2Β～2D。

圖2 MiR-132-3p抑制RA-FLSs增殖和侵襲Figure 2 MiR-132-3p inhibits the proliferation and invasion of RA-FLSs

2.3 MiR-132-3p 靶向結合FZD4 如圖3A 所示，FZD4 3’UTR 含有miR-132-3p 結合位點(5'-ACUGUUU-3’)。根據此結合序列，本研究構建了FZD4 3’UTR 野生型和突變型報告質粒以鑒定miR-132-3p 和FZD4 的關系。 如圖3Β 所示，WT-FZD4 3’UTR 組的熒光素酶活性在miR-132-3p轉染后降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，但是WT-FZD4 3’UTR 組的熒光素酶活性在miR-132-3p過表達后差異無統計學意義(P＞0.05)。隨后的結果揭示FZD4 在RA 患者滑膜組織中的mRNA 表達量要高于正常纖維樣滑膜細胞中的表達，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖3C，并且FZD4 在RA 患者滑膜組織的表達和miR-132-3p 的表達是負相關的，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖3D。FZD4 在RA患者滑膜組織和RA-FLSs中的蛋白表達也高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖3E和圖3F。

圖3 MiR-132-3p 靶向結合FZD4Figure 3 Combination of miR-132-3p and FZD4

2.4 FZD4 挽救miR-132-3p 在RA-FLSs 中介導的影響 本研究發現FZD4的蛋白表達在miR-132-3p轉染組低于miR-NC 轉染組，差異有統計學意義(P＜0.05)，但是它在miR-132-3p和FZD4 共轉染組的表達又高于miR-132-3p 和pcDNA 共轉染組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見圖4A。此外，數據顯示轉染miR-132-3p的RA-FLSs活力、EdU陽性細胞數和侵襲細胞數低于miR-NC轉染組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，但是這些指標在miR-132-3p和FZD4共轉染組又高于miR-132-3p 和pcDNA 共轉染組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見圖4Β～4D。

圖4 FZD4挽救miR-132-3p在RA-FLSs中介導的影響Figure 4 FZD4 rescue the effect miR-132-3p in RA-FLSs

2.5 MiR-132-3p 通過調控FZD4 表達抑制Wnt/β-catenin通路激活 轉染miR-132-3p組的β-catenin、c-Myc 和CyclinD1 蛋白表達低于miR-NC 轉染組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，但是這些蛋白的表達在miR-132-3p 和FZD4 共轉染組又高于miR-132-3p 和pcDNA 共轉染組，差異均具有統計學意義(P＜0.05)，見圖5。

圖5 MiR-132-3p和FZD4過表達在RA-FLSs中對β-catenin、c-Myc和CyclinD1蛋白表達的影響Figure 5 Effects of overexpression of miR-132-3p and FZD4 on β-catenin,c-Myc,and CyclinD1 protein expression in RA-FLSs

3 討論

RA 患者FLSs 的過度生長是關節損傷的原因之一，FLSs 能夠促進炎性因子和趨化因子產生，這種特性使得骨和軟骨侵蝕加重，并能加重RA 疾病程度[12]。最近的研究指出一些miRNAs 在RA 患者中是異常表達的，并且有助于RA 發展[13-14]。Cheng 等[15]運用基因表達綜合數據庫說明了miR-132-3p 可能通過結合核富含豐富的轉本1 參與RA 疾病進程；Zhang 等[16]研究數據顯示miR-132-3p 可通過結合circsirt1 抑制RA-FLSs 凋亡以及加重炎癥反應。本研究主要分析了miR-132-3p 對RA-FLSs增值和侵襲的影響。結果表明miR-132-3p 在RA 患者滑膜組織以及RA-FLSs中的表達降低，并且能夠抑制RA-FLSs增值和侵襲。

隨后的數據表明miR-132-3p 能夠結合FZD4。FZD4是一種卷曲蛋白，研究指出這個蛋白能夠通過circPTN/miR-145-5p/FZD4[17]、circ_0003972/miR-654-5p/FZD4[18]以及circ_0088036/miR-326/FZD4[19]等通路促進RA疾病進程。當前的工作說明了FZD4在RA患者以及RA-FLSs 中表達增加，并且參與miR-132-3p 介導的RA-FLSs增值和侵襲。Wnt蛋白家族能夠調控增殖、器官發生和遷移，且證據表明Wnt/β-catenin通路有助于FLSs增值[20]。Wnt1屬于Wnt蛋白家族成員，能夠和FLSs 中的FZD4 蛋白作用，這種聯系加重破骨細胞分化導致的骨侵蝕[21]。另外證據證實了Wnt1 誘導的基質降解酶的分泌和細胞因子釋放涉及FZD4[22]。學者也說明Wnt1 和FZD4 的聯合能促進滑膜細胞中β-連環蛋白轉錄因子的活化[23]。因此本研究又分析是否miR-132-3p 能夠通過抑制FZD4 的表達來調控Wnt/β-catenin 通路，結果表明Wnt/β-catenin 通路相關蛋白β-catenin、c-Myc 和CyclinD1 蛋白表達在miR-132-3p過表達后被抑制，但是miR-132-3p和FZD4 的共轉染釋放了miR-132-3p 過表達對這些蛋白表達的影響，表明miR-132-3p 能夠通過調控FZD4 來抑制Wnt/β-catenin通路的激活。

綜上所述，miR-132-3p 通過抑制FZD4/Wnt/β-catenin 通路激活來抑制類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞增殖和侵襲，說明miR-132-3p 可能限制RA發展，開發miR-132-3p相關藥物制劑可能是治療RA的一種新策略。但是當前的研究僅在細胞模型中說明miR-132-3p 對RA有抑制作用，隨后的研究還應用鼠模型實驗驗證此結論。