稽留流產患者陰道菌群狀況研究

石素雅 白會會 杜夢瑤 程冬梅 范琳媛 陳素文 劉朝暉

首都醫科大學附屬北京婦產醫院 北京婦幼保健院婦科，北京 100026

自然流產是早期妊娠最為常見的并發癥，其發生率占所有妊娠的15%～25%，而稽留流產是一種特殊類型的自然流產，是指胚胎或胎兒在已經死亡后滯留宮腔內而未能及時自然排出，占臨床的15%～20%[1]。稽留流產導致彌散性血管內凝血的風險增加，或可發生多次成為復發性流產，嚴重影響孕婦身心健康。常見病因有胚胎染色體異常、解剖異常、內分泌異常、感染因素、自身免疫因素等。由陰道菌群失衡引起的感染可能會通過陰道上行傳播到子宮，激活趨化因子并誘導局部免疫反應，進一步導致流產。另外，陰道菌群異常可能引起促炎性細胞因子升高，進而激活炎癥途徑，上行感染宮腔，降低子宮內膜容受性和著床，引起稽留流產[2-4]。本研究主要關注稽留流產患者陰道菌群情況及相關因素分析，以進一步揭示流產相關因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020 年9 月至2021 年6 月就診于首都醫科大學附屬北京婦產醫院的患者，將稽留流產患者30 例納入試驗組，正常早孕擬行人工流產患者30 例納入對照組，并進一步將稽留流產患者根據胚胎絨毛染色體檢查結果分為染色體正常組16 例、染色體異常組6 例、染色體不詳組8例。所有入組者均知情同意，并通過首都醫科大學附屬北京婦產醫院倫理委員會批準（2019-KY-075-01），填寫調查問卷。稽留流產患者納入標準：①年齡18～55 歲；②有性生活史，現妊娠時間＜12 周；③經臨床檢查及B 超輔助診斷確診為胚胎停止發育。滿足以上條件且胚胎絨毛染色體正常的胎停育患者納入染色體正常組，滿足以上條件且染色體數目或結構異常的胎停育患者納入染色體異常組，滿足以上條件但未行胚胎絨毛染色體檢查的胎停育患者納入染色體不詳組。對照組納入標準：①年齡18～55 歲；②有性生活史，現妊娠時間＜12周。排除標準：①72 h 內有性生活或陰道上藥；②因其他疾病長期應用激素、抗菌藥物或免疫抑制劑；③患有慢性全身系統性疾病或惡性腫瘤。

1.2 研究方法

1.2.1 病史采集 ①基線資料，包括年齡、學歷、月收入、吸煙、既往陰道炎史、既往泌尿系感染史、既往盆腔炎史、初次性生活年齡、既往流產史；②陰道微生態指標，包括形態學及功能學評價指標[5]，其中形態學上的評價指標包括菌群密集度、多樣性、優勢菌、乳桿菌分級、清潔度、細菌性陰道病（bacterial vaginosis，BV）Nugent 評分、需氧菌性陰道炎（aerobic vaginitis，AV）Donders 評分、病原微生物檢測（假絲酵母菌、BV）；功能學評價指標包括陰道分泌物酸堿度（pH 值）、過氧化氫、白細胞酯酶、唾液酸苷酶、β 葡萄糖醛酸酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶。

1.2.2 樣本收集 取兩根無菌棉拭子采集陰道側壁上1/3 的分泌物，其中一根拭子涂片，革蘭染色處理后，油鏡觀察陰道菌群情況并評價上述微生態指標；另一根拭子置入含無菌生理鹽水的2 ml EP 管內，-80℃密閉保存，用于菌群測定。

1.2.3 菌群測定及分析 本研究基于Illumina Novaseq測序平臺，選取細菌16S rRNA 基因V3～V4高變區進行測序及微生物分類分析。具體步驟如下：提取陰道分泌物中的細菌DNA，PCR 擴增細菌16S rRNA 基因V3～V4區，構建基因文庫，采用Illumina Novaseq 平臺測序，首先使用Trimmomatic 對原始數據進行質量過濾，使用Cutadapt 進行引物序列的識別與去除，其后使用Flash 對雙端序列進行拼接并去除嵌合體，最終得到高質量的有效序列用于后續分析。使用Usearch軟件對有效序列按照97%相似度分成不同操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），選擇豐度最高的序列作為OTU 代表序列，比對rRNA 基因數據庫進行OTU 聚類分析、物種分類分析、Alpha 多樣性分析、β 多樣性分析、菌群差異分析，來進一步評價樣本中的物種在不同分類水平上的相對豐度情況。其中Alpha 多樣性反應單個樣品物種的豐富度及均勻度，常用的度量菌群豐富度的指標有Ace 指數、Chao1 指數，其值越高，菌群豐富度越高；度量菌群多樣性即菌群豐富度和均勻度的指標有香農-威納多樣性指數、辛普森多樣性指數。香農-威納多樣性指數越高，辛普森多樣性指數越低，代表菌群多樣性越高。其中菌群差異分析主要是采用線性判別分析（line discriminant analysis effect size，LEfSe）來估算每個物種豐度對差異效果的影響，用于尋找各組間具有統計學差異的物種。

1.3 統計學方法

本研究采用SPSS 26.0 統計軟件進行分析，定量資料用中位數和四分位數[M（P25，P75）]表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗。計數資料以例數和百分率表示，比較采用χ2檢驗，等級計數資料比較采用秩和檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組基線資料及微生態指標單因素比較

單因素組間基線資料比較結果顯示，四組既往是否有盆腔炎史比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 四組患者基線資料比較

單因素組間微生態指標比較結果顯示，四組菌群多樣性、優勢菌比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。菌群密集度、乳桿菌分級、清潔度、BV Nugent 評分、AV Donders 評分、假絲酵母菌、BV、pH 值、過氧化氫、白細胞酯酶、唾液酸苷酶比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；染色體正常組與對照組微生態指標比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；染色體異常組與對照組微生態指標比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.2 OTU 聚類分析

各組間OTU 有一定的重疊，應用R 軟件繪制韋恩圖以直觀體現。本研究中稽留流產患者染色體正常組陰道分泌物獲得1 463 個OTU，染色體異常組陰道分泌物獲得1 237 個OTU，染色體不詳組陰道分泌物獲得1 323 個OTU，正常早孕組陰道分泌物獲得1 597個OTU。正常早孕組OTU 數目更多，菌群更豐富。

2.3 物種分類分析

將OTU 根據數據庫進行7 個水平的物種分類，即界、門、綱、目、科、屬和種，本研究共注釋出28 個門、67 個綱、167 個目、326 個科、641 個屬、748個種水平物種，計算各物種豐度，并繪制統計圖。見圖1。

圖1 60 份樣本種分類水平中物種分布柱狀圖

2.3.1 在屬分類水平上，對照組陰道菌群以乳桿菌屬為主，稽留流產患者中染色體正常組占76.49%，染色體異常組占73.31%，染色體不詳組占74.15%，而對照組占73.31%，次要優勢菌屬分別為加德納菌屬、普雷沃菌屬、埃希氏-志賀菌屬及嗜酸菌屬，染色體正常組分別占4.21%、1.51%、0.99%、1.36%，染色體異常組分別占5.56%、0.90%、2.34%、1.32%，染色體不詳組分別占2.82%、2.96%、1.57%、0.86%，而對照組分別占1.57%、1.68%、0.88%、1.41%。與對照組比較，稽留流產患者染色體正常組乳桿菌屬增多，而染色體異常組及染色體不詳組無明顯變化；稽留流產各組加德納菌屬、埃希氏-志賀菌屬均增多，嗜酸菌均減少；但染色體正常組及染色體異常組普雷沃菌屬減少，而染色體不詳組普雷沃菌屬增多。見圖2。

圖2 四組陰道菌群屬分類水平中物種分布柱狀圖

2.3.2 在種分類水平上，對照組陰道菌群以未分類乳桿菌為主，稽留流產患者中染色體正常組占42.35%，染色體異常組占64.33%，染色體不詳組占41.91%，而對照組占47.41%，次要優勢菌分別為惰性乳桿菌、陰道加德納菌、埃希氏-志賀氏菌、嗜酸菌、巨型球菌、普雷沃菌，染色體正常組分別占34.11%、4.21%、0.99%、1.36%、0.79%、0.97%，染色體異常組分別占8.95%、5.56%、2.34%、1.32%、1.46%、0.04%，染色體不詳組分別占32.26%、2.82%、1.57%、0.86%、0.37%、1.43%。與對照組比較，染色體正常組及染色體不詳組未分類乳桿菌均減少，惰性乳桿菌均增多，而染色體異常組未分類乳桿菌增多，惰性乳桿菌減少；另外，稽留流產患者各組陰道加德納菌、埃希氏-志賀氏菌均增多，嗜酸菌均減少，但染色體正常組與染色體不詳組普雷沃菌增多，巨型球菌減少，而染色體異常組巨型球菌增多，普雷沃菌減少。見圖3。

圖3 四組陰道菌群種分類水平中物種分布柱狀圖

2.4 Alpha 多樣性分析

結果顯示，四組菌群豐度比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中染色體正常組菌群豐度低于對照組（P＜0.05），但染色體異常組與對照組菌群豐度比較，差異無統計學意義（P＞0.05），另外，四組間菌群多樣性比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 四組患者陰道分泌物菌群Alpha 多樣性分析結果[M（P25，P75）]

2.5 β 多樣性分析

研究基于Unweighted-unifrac 距離行PCoA 分析以比較四組間微生物的差異，結果顯示第一主成分PCoA1 和第二主成分PCoA2 對區分各組的貢獻度分別為18.74%和5.94%，四組陰道菌群比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4。Anosim 分析對β 多樣性差異進行了統計檢驗，提示β 多樣性比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖4 四組陰道菌群β 多樣性分析

2.6 菌群差異分析

LEfSe 分析結果顯示，四組陰道菌群無明顯差異的物種。見圖5。

圖5 稽留流產各組與對照組陰道菌群的線性判別分析

3 討論

女性陰道微生態系統主要是由陰道菌群、內分泌系統、陰道解剖結構及免疫系統共同組成的，各組之間相互協調[6]，其中，陰道菌群是陰道微生態系統的核心。育齡期女性陰道菌群主要是由種類繁多的需氧菌和厭氧菌組成的，其中乳桿菌是育齡期女性陰道菌群中的優勢菌，寄生于女性陰道內的乳桿菌屬多達20多種，最常見的4 種乳桿菌是卷曲乳桿菌、詹氏乳桿菌、加氏乳桿菌和惰性乳桿菌，通過16S rRNA 測序的方法又將陰道菌群狀態（community state type，CST）分為5 型：CST Ⅰ型（以卷曲乳桿菌為優勢菌）、CST Ⅱ型（以加氏乳桿菌為優勢菌）、CST Ⅲ型（以惰性乳桿菌為優勢菌）、CST Ⅳ型（又稱乳桿菌屬缺失型，以厭氧菌等其他雜菌為優勢菌）和CST Ⅴ型（以詹氏乳桿菌為優勢菌），其中CST Ⅳ型又被分為ⅣA、ⅣB、ⅣC0、ⅣC1、ⅣC2、ⅣC3、ⅣC4 型，分別是以BVAB1、陰道加德納菌、普雷沃菌、鏈球菌、腸球菌、雙歧桿菌、葡萄球菌為優勢菌[7]，乳桿菌尤其是卷曲乳桿菌，可以通過產乳酸、過氧化氫，分泌細菌毒素、黏附陰道上皮細胞等作用，抑制其他細菌生長，維持女性的生殖健康。

關于陰道菌群與胚胎發育之間的具體作用及機制目前研究尚少，目前認為，陰道菌群可能通過以下3 種機制影響妊娠：①陰道菌群可能是維持女性免疫系統平衡的因素，陰道菌群失調可能會引起免疫應答導致過度炎癥反應[8]，表現為炎癥介質及炎癥因子（如白細胞介素-6、γ 干擾素、腫瘤壞死因子-α 等）的升高[9]，進而導致基質金屬蛋白酶與基質金屬蛋白酶抑制劑-1 失衡[10]，損害胚胎的發育導致胎停育；②陰道菌群可能會在女性免疫功能減弱時上行感染子宮腔，形成子宮內膜的定植菌，可能影響胚胎種植，妨礙胚胎的發育[11]；③陰道菌群失調可能會引起宮頸陰道內的屏障功能減弱，增加宮頸細胞通透性，對胚胎發育造成影響。

妊娠期是育齡期女性的一段特殊時期，高雌激素水平可能會導致陰道上皮細胞糖原含量增加、陰道前庭腺體分泌增加、陰道及宮頸黏膜充血等生理變化，妊娠期陰道微生態受感染、遺傳、種族、孕產史及應激等的影響[3]。現已有研究證明，妊娠期女性陰道微生態狀態與非妊娠女性存在明顯差異[12-14]，并且妊娠期陰道菌群的改變從早孕期即開始[15-16]。我國女性妊娠期陰道優勢菌主要為卷曲乳桿菌[17]，德國一項研究同樣證實了妊娠期女性陰道優勢菌主要為卷曲乳桿菌，而只是部分女性妊娠期以惰性乳桿菌和陰道加德納菌為優勢菌，印度女性妊娠期陰道優勢菌主要為加氏乳桿菌[18]。

本研究主要通過對染色體異常組、染色體正常組、對照組患者陰道菌群狀況分析，來揭示稽留流產與陰道菌群之間的關系。本研究發現染色體異常組與對照組在物種組成、菌群豐度上無明顯差異，但染色體正常組較對照組存在不同乳桿菌菌株比例失衡及除乳桿菌以外的其他細菌（如陰道加德納菌、埃希氏-志賀菌、普雷沃菌等）相對豐度增加，故稽留流產患者存在的陰道菌群失調可能與稽留流產有關。目前認為，不同亞型乳桿菌可能對妊娠結局的影響不同[19-22]，以卷曲乳桿菌、詹氏乳桿菌、加氏乳桿菌為主的陰道菌群在妊娠中非常常見，與流產風險較低有關[23]，以惰性乳桿菌為主的陰道菌群似乎與特定妊娠相關病理發展的風險增加有關[24]，在稽留流產患者中卷曲乳桿菌、詹氏乳桿菌、加氏乳桿菌的相對豐度明顯降低，而惰性乳桿菌增加，削弱了乳桿菌對生殖道正常生理功能的保護作用。另外，也有研究認為陰道菌群中乳桿菌相對豐度降低，可能會增加潛在病原體的豐度和多樣性，這種乳桿菌水平低而細菌多樣性增加的陰道菌群，已經檢測到早產和流產的風險增加[11-12]；稽留流產患者除乳桿菌以外的其他菌群，如鏈球菌、普雷沃菌、阿托波菌[25]、解脲支原體、沙眼衣原體等相對豐度高于正常妊娠女性。其中，關于妊娠期支原體的篩查和治療仍有爭議，有一些研究證明稽留流產患者生殖支原體及解脲支原體相對豐度均降低[26]。還有研究報告稱，支原體在陰道環境中普遍存在，似乎不會影響妊娠結局[27]，只有當癥狀出現時才需要治療，所以還需要更多的證據來證實。

綜上所述，妊娠期女性陰道微生態受多種因素的影響，在某些體內外因素的影響下，陰道菌群發生失衡，如乳桿菌相對豐度降低和/或乳桿菌菌株比例失調，或其他細菌（如加德納菌、普雷沃菌、假單胞菌等）相對豐度增加，機體免疫力下降，上行感染宮腔，從而導致稽留流產，然而陰道菌群導致稽留流產的直接病因及機制目前尚未明確。隨著科學技術的發展，可對陰道菌群進行宏基因組測序，尋找關鍵菌群及相關代謝通路，不斷挖掘陰道微生態環境對妊娠結局的影響，進一步探索影響稽留流產的直接病因，從而指導臨床應用。