中藥杜仲皮總黃酮提取工藝及抗氧化活性研究

陸梅元，李 杉，楊夢霞，盧新麗，曾海生

（1.廣西壯族自治區食品藥品審評查驗中心，南寧 530029；2.右江民族醫學院附屬醫院，廣西 百色 533000；3.廣西嘉路人力資源顧問有限責任公司，南寧 530031）

杜仲皮為杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoidesOliv.）的干燥樹皮，是臨床上常用的中藥材，具有強筋骨、補肝腎、安胎等作用，常與其他中藥組成經驗方，多用于治療腎虛腰痛、高血壓、筋骨無力、胎動不安等癥［1］。中藥材產地及加工方法是控制藥材質量的關鍵，查閱《本草經集注》及相關文獻發現，中藥杜仲有采皮陰干、去粗皮曬干和去粗皮“發汗”后曬干等加工方法［1，2］，但加工標準并不統一，臨床療效參差不齊。總黃酮具有抗氧化、降血壓、降血脂和抗腫瘤等藥理作用［3-5］，是杜仲重要的活性成分。

鮮見有關杜仲皮總黃酮含量測定的研究。為保障中藥杜仲的質量及臨床療效，本研究以杜仲皮總黃酮含量為評價指標，采用單因素試驗考察提取方法、提取溶劑、提取溶劑體積、提取時間對杜仲皮總黃酮含量的影響，采用正交試驗優選最佳提取工藝，以期建立中藥杜仲皮總黃酮含量的測定方法，為全面建立和評價中藥杜仲加工方法質量標準體系提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

EnVisionXcite 型全波長多功能酶標儀，美國PerkinElmer 公司；EL204 型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；A-S082 型多功能酶標儀，瑞士Tecan 公司。

1.2 試藥

總抗氧化（T-AOC）測定試劑盒、羥基自由基（-OH）測定試劑盒，購于南京建成生物工程研究所。

蘆丁（批號100080-202012），購于中國食品藥品檢定研究院，其余試劑均為分析純。中藥材購于南寧市老百姓大藥房，經廣西中醫藥大學第一附屬醫院藥學部曾超主任中藥師鑒定為杜仲科植物杜仲的干燥樹皮。

1.3 試驗方法

1.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥至恒重的蘆丁對照品12.85 mg，加60%乙醇溶解，定容至25 mL 的容量瓶中，輕輕搖勻溶解，配制成濃度為0.514 mg/mL 的對照品溶液，保存備用。

1.3.2 供試品的制備 精密稱取杜仲皮粉末適量，加樣品10 倍體積60%乙醇加熱回流進行提取，提取時間1.5 h，提取液過濾、合并、濃縮至無乙醇味，備用。取樣品適量加熱水，超聲溶解，冷卻后抽濾，得到杜仲皮濾液。濾液經預處理好的大孔吸附樹脂HPD-100 吸附后，先以2 倍柱體積的純水洗去雜質，再用3 倍柱體積的60%乙醇進行洗脫，收集洗脫液，濃縮至無乙醇味，冷凍干燥后即得杜仲皮藥材總黃酮供試品。測定杜仲皮總黃酮的吸光值，使用回歸方程得出杜仲皮供試品溶液中總黃酮的含量。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的選擇

精密量取按照“1.3.1”方法制備的對照品溶液2 mL，置于25 mL 容量瓶中，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，輕輕搖勻，靜置7 min，加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，輕輕搖勻，靜置7 min，再加入10 mL 4%氫氧化鈉溶液，加純水至刻度，輕輕搖勻，靜置12 min。用對應試劑（除對照品不放，其他試劑同前）作空白對照試驗，在波長400～800 nm 下測定蘆丁對照品的吸光度（圖1）。由圖1 可知，其最大吸收波長為510 nm。

圖1 蘆丁對照品吸收光譜

2.2 線性關系的考察

精密量取按照“1.3.1”方法制備的對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL，分別置于25 mL 的容量瓶中，加入1 mL 的5% 亞硝酸鈉，輕輕搖勻，放置7 min，再加入1 mL 的10%硝酸鋁，輕輕搖勻，放置7 min，再加入10 mL 的4%的氫氧化鈉，加純水至刻度，輕輕搖勻，放置12 min，然后在波長510 nm 處進行測定［6］。以濃度（mg/mL）為橫坐標（x），吸光值為縱坐標（y），繪制標準曲線并進行回歸分析，線性方程為y=12.198 0x-0.028 4，R2=0.999 2，說明線性方程在0.010 4～0.083 2 mg/mL 水平上線性關系良好。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 精密稱取杜仲皮粉末1.0 g，按照“1.3.2”方法制備供試品，于波長510 nm 處連續進樣6 次，測定供試品吸光度。RSD為2.04%，小于3%，表明該方法精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 精密稱取杜仲皮粉末1.0 g，按照“1.3.2”方法制備供試品，分別于0、10、20、30、40、50、60 min，連續進樣7 次，于波長510 nm 處測定樣品吸光度。

計算得到杜仲皮總黃酮含量RSD為1.91%，小于3%，表明樣品在60 min 內穩定性良好。

2.3.3 重復性試驗 精密稱取杜仲皮粉末樣品6份，每份1.0 g，按照“1.3.2”方法制備供試品，于510 nm波長處平行測定樣品吸光度。計算得到杜仲皮總黃酮平均含量為15.08 mg/g，RSD為2.36%，RSD小于3%。表明該方法重復性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗 精密稱取同一批已知總黃酮含量的杜仲皮粉末0.5 g，共9 份，分成3 個組，即低、中、高加樣組，按照“1.3.2”方法制備供試品，于波長510 nm 處平行測定樣品吸光度，計算杜仲皮總黃酮的含量。由表1 可知，杜仲皮低、中、高加樣組的總黃酮平均回收率分別為100.36%、100.93%、99.29%，RSD分別為2.33%、1.71%、2.81%（n＝3），表明該方法準確性良好。

表1 加樣回收率試驗

2.4 單因素考察試驗

2.4.1 提取方法考察 精密稱取杜仲皮粉末1.0 g，置于具塞錐形瓶中，以60%乙醇為提取劑，提取時間為1 h，提取體積25 mL，分別采用溶劑浸漬法、超聲提取法和回流提取法對杜仲皮進行總黃酮提取（圖2），按照“1.3.2”方法制備供試品，于波長510 nm處進樣測定。結果表明，回流提取法的提取效率最高，因此本研究選擇回流提取法。

圖2 提取方法考察

2.4.2 提取溶劑濃度考察 精密稱取杜仲皮粉末1.0 g，置于具塞錐形瓶中，提取時間為1.0 h，溶劑提取體積為25 mL，采用回流提取法，設置提取溶劑乙醇的濃度分別為30%、50%、60%、70%、80%和95%，按照“1.3.2”方法制備供試品，進樣測定。由圖3 可知，50%乙醇回流提取的杜仲皮總黃酮提取率最高，因此本研究乙醇溶劑提取濃度選擇50%。

圖3 提取溶劑濃度考察

2.4.3 提取時間考察 精密稱取杜仲皮粉末1.0 g，置于具塞錐形瓶中，以25 mL 50%乙醇為提取條件，采用回流提取法，設置提取時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，按照“1.3.2”方法制備供試品，進樣測定。由圖4 可知，提取時間為1.5 h 時總黃酮提取率最高，因此本研究提取時間為1.5 h。

圖4 提取時間考察

2.4.4 提取溶劑體積考察 精密稱取杜仲皮粉末1.0 g，置于具塞錐形瓶中，提取時間為1.5 h，提取劑為50%乙醇，采用回流提取法，50%乙醇溶劑設置不同體積，分別為20、30、40、50、60、70 mL，按照“1.3.2”方法制備供試品，進樣測定。由圖5 可知，提取劑提取體積為40 mL 時的總黃酮提取率最高，因此本研究選擇提取溶劑體積為40 mL。

圖5 提取溶劑體積考察

2.5 正交試驗

根據前期試驗及查閱相關文獻，選用L9（34）正交試驗［7，8］，以乙醇為提取溶劑，試驗各因素水平詳見表2，試驗結果見表3，方差分析結果見表4。

表2 L9（34）正交試驗因素水平

表3 L9（34）正交試驗設計結果

表4 正交試驗方差分析結果

正交試驗結果和方差分析表明，乙醇濃度和提取時間對杜仲皮總黃酮提取工藝有顯著影響，料液比對杜仲皮總黃酮提取工藝無顯著影響，且各影響因素的強弱為乙醇濃度（A）＞提取時間（C）＞料液比（B），所以乙醇濃度和提取時間對杜仲皮總黃酮提取效果具有統計學意義，最佳提取方式為A2B2C2，即杜仲皮總黃酮效率最佳提取方式為乙醇濃度50%，料液比1∶40 g/mL，提取時間1.5 h。

2.6 杜仲皮總黃酮體外抗氧化活性試驗

2.6.1 總黃酮含量測定 稱取杜仲皮藥材粉末6份，每份約1.0 g，置于具塞錐形瓶中，按照最佳提取工藝制備供試品，測定杜仲皮總黃酮的含量，結果見表5。由表5 可知，本研究建立的方法可以在體外進行總黃酮抗氧化能力測定。

表5 杜仲皮總黃酮含量測定結果

2.6.2 總黃酮總抗氧化能力測定 杜仲皮總黃酮總抗氧化能力測定使用總抗氧化（T-AOC）能力試劑盒進行測定。總抗氧化能力測試盒（T-AOC）試驗原理是在酸性條件下，具有抗氧化的藥物或化學成分能使Ferric-tripyridyltriazine（Fe3+-TPTZ）還原成Fe2+-TPTZ，后者可與菲啉類物質形成穩定的絡合物，于紫外波長593 nm 處進行測定，即得杜仲皮總黃酮的總抗氧化能力。

由圖6 可知，杜仲皮總黃酮和維生素C 對照品對鐵離子均具有較強的還原能力，并且隨著總黃酮樣品和維生素C 濃度的增加而增強。杜仲皮總黃酮濃度為3.0 mg/mL 時，總抗氧化能力為132.2 U/mL。相同溶液濃度下，杜仲皮總黃酮的總抗氧化能力強于維生素C。

圖6 杜仲皮總黃酮、維生素C 總抗氧化能力

2.6.3 總黃酮羥基自由基（-OH）清除能力測定 杜仲皮總黃酮清除羥基自由基能力，使用羥基自由基試劑盒方法進行測定。羥基自由基為一種活性氧，其清除能力可作為抗氧化能力的重要指標。Fenton是最常見的產生羥基自由基反應，其原理是H2O2在Fe2+的催化下產生-OH，當給予電子受體后，用Griess 試劑顯色，生成紅色化合物，在波長550 nm 處測定，可反映樣品對羥基自由基的清除能力。

由圖7 可知，總黃酮和維生素C 對羥基自由基具有較好的清除效果，并且清除率隨濃度的增加而增大。當濃度在0.4～1.2 mg/mL 時，總黃酮對羥基自由基的清除率略低于維生素C，當濃度大于1.2 mg/mL后，總黃酮對羥基自由基的清除率高于維生素C，當濃度等于3.0 mg/mL 時，總黃酮羥基自由基清除率為90%。

圖7 杜仲皮總黃酮、維生素C 對羥基自由基的清除能力

3 小結與討論

以杜仲皮為研究對象，考察了不同濃度的乙醇、料液比和提取時間3 個影響試驗的因素，采用回流提取的方法提取中藥杜仲皮總黃酮，利用三因素三水平的L9（34）正交試驗方法來優選杜仲皮總黃酮的最佳提取工藝。結果表明，中藥杜仲皮總黃酮的最佳提取工藝為采用回流提取法，乙醇濃度為50%，料液比1∶40 g/mL，提取時間1.5 h，此提取杜仲皮總黃酮的效果最佳。

對杜仲皮總黃酮的總抗氧化能力和清除羥基自由基進行測定，結果表明，杜仲皮總黃酮具有較強的體外抗氧化作用。總黃酮濃度為3.0 mg/mL時，總抗氧化能力為132.2 U/mL，羥基自由基清除率為90%，并且其清除能力隨濃度的增加而增大。