青海藜麥總黃酮及多酚共提工藝及其抗氧化活性

楊 敏，周 蕊，奚軍偉

（1.陜西國際商貿學院，西安 712046；2.陜西省藥品不良反應監測中心，西安 710000）

藜麥（Chenopodium quinoaWilld.）為雙子葉草本植物，屬藜科［1］，具有悠久的栽培歷史。藜麥對鹽堿、干旱、霜凍、病蟲害等生物、非生物脅迫具有良好的適應性，被許多國家推廣種植［2］。中國藜麥種植仍處于初始階段，主要分布于青海省、甘肅省和山西省等地，面積約1 萬hm2。藜麥具有較高的綜合經濟價值和多種營養價值，能夠同時滿足各類人體所需的8 種基本必需營養元素，被稱作是全高營養作物，富含蛋白質、礦物質、氨基酸、纖維素等微量元素，其含量均高于其他糧食作物［3］。藜麥種子不僅具有大量的營養，還富含多酚、皂甙、黃酮等生物活性成分，并具有強抗氧化能力，在抗氧化、降血脂、增強免疫力等生理上起重要作用，作為功能性食品食用能夠降低慢性疾病的發生風險［4］。

本研究以青海格爾木藜麥為原料，采用超聲波輔助法（超聲功率為120 W），通過滿意度-響應面法對提取工藝進行優化，并研究其抗氧化活性，為藜麥資源的利用和開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥材與藥劑

藥材：青海藜麥。

藥劑：蒸餾水；無水乙醇；5% NaNO2溶液；10%Al（NO3）3溶液；4% NaOH 溶液；磷鉬鎢酸試劑；5%碳酸鈉溶液；蘆丁對照品；沒食子酸對照品；維生素C 標準品；抗氧化試劑盒（總抗氧化、羥自由基清除能力，蘇州科銘生物技術有限公司）等。

1.2 試驗儀器

AUW120 型電子天平，艾德姆衡器有限公司；DP-360 型超聲波提取器，北京亞歐德鵬科技有限公司；KDC-40 型低速離心機，江蘇省金壇市恒豐儀器制造有限公司；RE-205 型旋轉蒸發器，上海坎昆儀器設備有限公司；TU-1810 型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藜麥總黃酮及多酚的共提工藝 粉碎、稱量→加入適量乙醇溶液→超聲提取→過濾→回收濾液→測定（總黃酮及多酚）。

1.3.2 藜麥總黃酮及多酚的含量測定

1）蘆丁標準曲線的繪制［5］。稱取蘆丁對照品50 mg，定容至25 mL 容量瓶，再精密量取10 mL，置于100 mL容量瓶中，定容，得到l mL中含蘆丁0.2 mg的標準溶液。分別量取1、2、3、4、5、6 mL 標準溶液至10 mL 容量瓶中定容，得到不同梯度濃度的標準溶液，向蘆丁標準溶液中加入適量的NaNO2溶液、Al（NO3）3溶液、NaOH 溶液，放置15 min，采用紫外可見分光光度計在波長510 nm 處進行吸光值測量，繪制標準曲線（圖1）。

圖1 蘆丁標準曲線

2）沒食子酸標準曲線的繪制［6］。稱取沒食子酸對照品50 mg，定容至100 mL 容量瓶中，再精密量取5 mL，置于50 mL 容量瓶中，定容，得到1.00 mL 中含沒食子酸0.05 mg 的標準溶液。分別在6 個10 mL 容量瓶中吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 溶液并定容，即得到不同梯度濃度的沒食子酸標準溶液，向不同梯度濃度的標準溶液中加入適量的磷鉬鎢酸試劑、5%碳酸鈉溶液，放置一定時間，采用紫外可見分光光度計在波長760 nm 處進行吸光度測量，并繪制標準曲線（圖2）。

1.3.3 提取率計算及滿意度評價 根據“1.3.2”的方法對藜麥總黃酮及多酚含量進行測定，計算其提取率。

利用復合滿意度函數［7］將多響應值轉化為綜合單響應值，計算式如下。

式中，ωi為第i個響應滿意度函數的權重，i=1，2，3，…，n，ω1、ω2分別為總黃酮和多酚的權重，ω1=0.6，ω2=0.4，∑ωi為各響應值占權重的總和，x為考察對象，y為x所對應的響應值。

1.3.4 單因素試驗 將藜麥料液比設為1∶10（g∶mL，下同），超聲提取溫度設置為50 ℃，乙醇體積分數為30%，將超聲提取時間因素設定為5 個水平，分別為10、20、30、40、50 min，考察不同超聲提取時間對總黃酮及多酚提取率的影響；將藜麥料液比設置為1∶10，超聲提取時間設為30 min，乙醇體積分數為30%，將超聲提取溫度因素設定為30、40、50、60、70 ℃，研究超聲提取溫度變化對藜麥總黃酮和多酚提取率的影響；在超聲提取50 ℃、30 min、30%乙醇溶液條件下進行提取，選取料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，觀察不同料液比對2 種物質提取率的影響；將藜麥料液比設定為1∶30，超聲提取溫度設定為50 ℃，超聲提取時間為30 min，選取乙醇體積分數為10%、20%、30%、40%、50%，考察不同乙醇體積分數對總黃酮及多酚提取率的影響。

1.3.5 響應面試驗設計 根據單因素試驗結果，使用Design-Expert 8.0.6 軟件設計4 因素3 水平試驗方案，對多指標進行滿意度評價，以滿意度為試驗方案的響應值。

1.3.6 藜麥總黃酮及多酚提取物抗氧化活性測定 依據“1.3.1”的工藝進行提取，將藜麥總黃酮及多酚提取物配制成不同濃度溶液，以維生素C 為陽性對照，通過抗氧化試劑盒測定樣品的總抗氧化活性和羥自由基清除能力［8，9］。計算樣品的總抗氧化活性和羥自由基清除能力，計算式如下。

式中，V反總為反應總體積，1.02 mL；V樣為反應中樣品體積，0.03 mL。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲提取時間對藜麥總黃酮及多酚提取率的影響 如圖3所示，當超聲提取時間為10、20、30 min時，藜麥總黃酮及多酚提取率隨提取時間的增加而增加，在超聲提取時間為30 min 時達到最大值；當超聲提取時間大于30 min 時，藜麥總黃酮及多酚類物質的含量均未見明顯提高，故可將超聲提取時間考察中心點選擇為30 min。

2.1.2 超聲提取溫度對藜麥總黃酮及多酚提取率的影響 如圖4 所示，當超聲提取溫度上升至50 ℃的過程中，藜麥總黃酮及多酚提取率與提取溫度成正比，隨著提取溫度繼續上升，藜麥總黃酮及多酚提取率出現下降的趨勢。綜上分析，可將超聲提取溫度考察中心點選擇為50 ℃。

2.1.3 料液比對藜麥總黃酮及多酚提取率的影響 由5可知，當料液比在1∶10、1∶20、1∶30 時，藜麥總黃酮及多酚提取率均隨著料液比增大出現上升趨勢；當料液比在1∶40、1∶50 時，藜麥中總黃酮及多酚的提取率隨料液比的增大而下降，故可將1∶30 作為料液比的考察中心點。

2.1.4 乙醇體積分數對藜麥總黃酮及多酚提取率的影響 由圖6 可知，當乙醇體積分數在30%以內時，藜麥總黃酮及多酚的提取率隨乙醇體積分數的增加而增加；當乙醇體積分數為40%、50%時，藜麥總黃酮及多酚的提取率呈下降趨勢，故選擇乙醇體積分數的考察中心點為30%。

圖6 不同乙醇體積分數對藜麥總黃酮及多酚提取率的影響

2.2 響應面法對藜麥總黃酮及多酚提取工藝的優化結果

2.2.1 響應面設計方案及結果 根據Design-Expert 8. 0. 6 軟件進行響應面設計，設置5 個中心點，共29 組試驗（表1、表2）。試驗設計的回歸方程為Y= 0.55 - 0.11A+0.045B-0.021C- 0.12D- 0.17AB+0.079AC+ 0.17AD+ 0.095BC+ 0.067BD- 0.045CD-0.11A2+0.13B2+0.056C2+0.080D2。方差分析（表3）中，模型的P＜0.000 1，表明該試驗模型顯著，失擬項不顯著，說明模型擬合程度高、可信度高［10］。確定系數R2為0.951 4，調整系數為0.902 8，二者相差較小，說明試驗精確度較高［11］。從F可以得到4 個因素對響應值的影響程度，即提取溫度＞料液比＞提取時間＞乙醇體積分數，其中，乙醇體積分數對響應值的影響不顯著。

表1 試驗因素和水平

表3 方差分析結果

2.2.2 各因素交互作用分析 各因素交互作用通過二者等高線及三維曲面（圖7）進行分析。從等高線的橢圓程度和三維圖曲面的陡峭程度分析，料液比與提取時間、乙醇體積分數、提取溫度，提取時間與乙醇體積分數、提取溫度，各因素之間交互作用顯著，乙醇體積分數和提取溫度之間交互作用不明顯。料液比的最佳取值范圍為1∶25～1∶35，提取時間的最佳范圍為30～40 min，最佳提取溫度在40～50 ℃，乙醇體積分數的最佳取值范圍為30%～40%。試驗通過Design-Expert 8.0.6 軟件得到藜麥總黃酮及多酚提取的最佳共提工藝為料液比1.00∶26.25，提取時間35.64 min，乙醇體積分數37.95%，提取溫度41.09 ℃，滿意度為0.948 2%。根據實際可操作性，將工藝調整為料液比1∶25，提取時間35 min，乙醇體積分數40%，提取溫度40 ℃，此條件下藜麥總黃酮的提取率為10.075%，多酚的提取率為2.033%，滿意度為0.936 2%，滿意度與預測滿意度值僅差0.012 個百分點，表明工藝準確可行，模型精確度高。

圖7 各因素的等高線及三維曲面

2.2.3 藜麥總黃酮及多酚提取物抗氧化活性測定結果 通過試劑盒測定藜麥總黃酮及多酚提取物的羥自由基清除率和總抗氧化活性，從結果（圖8）可知，隨著提取物濃度的增大，提取物的羥自由基清除率和總抗氧化活性逐漸增大，藜麥總黃酮及多酚提取物濃度在1.2 mg/mL 時，其羥自由基清除率為89.32%，總抗氧化能力為88.8 U/mL，與同濃度維生素C 對照品的抗氧化活性差距不大。

圖8 藜麥總黃酮及多酚提取物的羥自由基清除率（a）和總抗氧化活性（b）

3 小結與討論

以兩種指標優化青海藜麥的提取工藝，以滿意度為響應值設計試驗方案，選用超聲波輔助法（超聲功率為120 W）提取藜麥中的總黃酮及多酚類化合物，最佳工藝為料液比1∶25（g∶mL），提取時間35 min，乙醇體積分數40%，提取溫度40 ℃，此條件下藜麥總黃酮的提取率為10.075%，多酚的提取率為2.033%，滿意度為0.936 2%。抗氧化試驗結果表明，藜麥總黃酮及多酚提取物具有明顯的抗氧化活性。

藜麥總黃酮和多酚為其主要活性成分，具有抗氧化［12］、抗癌、降糖［13］等藥理作用，對這兩種物質的共提工藝研究較少，試驗通過滿意度函數評價其提取工藝，結果精確度高、易于操作且成本低廉，為青海藜麥總黃酮及多酚的進一步開發提供理論支持。