正交試驗法優選蜜枇杷葉炮制工藝

胡 雨，麻雨樂，郭志俊，高 波

（華潤三九現代中藥制藥有限公司，廣東 惠州 516000）

枇杷葉為薔薇科植物枇杷［Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl.］的干燥葉，始載于《名醫別錄》，具有清肺止咳、降逆止嘔的作用，可用于治療肺熱咳嗽、氣逆喘急、胃熱嘔逆、煩熱口渴等病癥［1］。熊果酸和總三萜酸是其主要的抗炎和止咳作用成分［2］。枇杷葉主要有蜜炙、姜炙等炮制方法，臨床常用的炮制品為蜜枇杷葉，其采用蜜炙法進行加工炮制［3］。枇杷葉蜜炙以后清肺止咳、降逆止嘔功能增強［4］?！吨腥A人民共和國藥典（2020 年版）》描述的蜜枇杷葉炮制工藝缺少可控的工藝參數［1］，關于蜜枇杷葉炮制工藝研究的文獻較少［5，6］，且主要以熊果酸、齊墩果酸為評價指標，缺少對蜜枇杷葉的浸出物及標準湯劑出膏率進行評價。本研究以齊墩果酸和熊果酸總量、浸出物及標準湯劑出膏率為綜合評價指標，采用正交設計［7］，考察悶潤時間、蜜水比、炒制溫度及炒制時間4 個因素，優選蜜枇杷葉的加工炮制工藝，以期為蜜枇杷葉的擴大生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

高效液相色譜儀色譜系統，包括四元梯度輸液泵、色譜柱溫箱、二極管陣列紫外檢測器、Chromeleon 7 色譜管理系統；C18 色譜柱、超聲清洗儀、粉碎機等。

1.2 試劑

枇杷葉（批號：2009001）購于亳州某飲片公司；齊墩果酸（批號：110709-201206，純度為94.9%）、熊果酸（批號：110742-201823，純度為99.9%）購于中國食品藥品檢定研究院）；乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；水為娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈飲料科技有限公司）。

試驗所用枇杷葉飲片，經鑒定為薔薇科植物枇杷的干燥葉［1］。

1.3 方法

1.3.1 齊墩果酸和熊果酸總量測定 色譜條件：C18色譜柱，流動相為乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨溶液（67∶12∶21），檢測波長為210 nm；流速為1.0 mL/min ，柱溫為25 ℃，進樣量為10 μL。理論板數應≥5 000（以熊果酸峰計算），色譜峰對稱性較好［1］。齊墩果酸對照品、熊果酸對照品的高效液相色譜見圖1。

圖1 蜜枇杷葉高效液相色譜

1.3.2 對照品溶液和供試品溶液的制備 取齊墩果酸對照品、熊果酸對照品適量，參照《中華人民共和國藥典（2020 年版）》枇杷葉藥材標準含量測定項對照品溶液、供試品溶液的方法制備［1］。

1.3.3 浸出物含量的測定 依據《中華人民共和國藥典（2020 年版）》四部通則“2201 浸出物測定法”測定［1］。

1.3.4 標準湯劑出膏率的測定 根據《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》中關于“標準煎液”的制備制定蜜枇杷葉標準湯劑試驗方案。按照蜜枇杷葉的藥性及用藥部位（葉類）選擇煎煮參數，對加水量（倍數）的要求“煎煮開始時的用水量一般以浸過藥面2～5 cm 為宜”進行考察，確定了蜜枇杷葉標準湯劑加水量及煎煮參數，藥性及飲片種類為一般類/葉類，飲片量為100 g，無前處理，浸泡30 min，煎煮次數2 次，一煎加水量為飲片重量的12 倍，一煎時間30 min，二煎加水量為飲片重量的10 倍，二煎時間25 min。

1.4 正交試驗

1.4.1 蜜枇杷葉工藝的正交試驗設計 基于蜜枇杷葉炮制工藝文獻［5，6］檢索及單因素試驗考察，采用L9（34）正交設計，考察悶潤時間（A）、蜜水比（B）、炒制溫度（C）、炒制時間（D）4 個因素，以齊墩果酸和熊果酸總量、醇溶性浸出物、標準湯劑出率為評價指標，優選蜜枇杷葉的炮制工藝。各因素和水平見表1。

表1 正交設計因素和水平

1.4.2 綜合評分標準 為了更客觀地評價蜜枇杷葉的質量，以蜜枇杷葉齊墩果酸和熊果酸總量、浸出物及標準湯劑出膏率為評價指標，用綜合評分法評定試驗［8］。齊墩果酸和熊果酸總量是《中華人民共和國藥典（2020 年版）》規定的指標性成分，所以其權重系數擬定為0.5；醇溶性浸出物及標準湯劑出膏率權重系數分別為0.3 及0.2。浸出物評分=（浸出物的評分/9 個樣品中最高浸出物的評分）×30；齊墩果酸和熊果酸總量的加權評分=（齊墩果酸和熊果酸總量/ 9 個樣品中齊墩果酸和熊果酸總量的最高含量）×50；出膏率含量的加權評分=（出膏率含量/9 個樣品中出膏率的最高含量）×20。綜合評分=浸出物加權評分+齊墩果酸和熊果酸總量的加權評分+出膏率的加權評分。

1.4.3 不同工藝蜜枇杷葉標準湯劑的制備 取正交試驗各工藝組合蜜枇杷葉樣品約100 g，置于圓底燒瓶中，加入12 倍量水浸泡30 min，加熱回流30 min，濾過；藥渣再加10 倍量水，加熱回流25 min，濾過，合并兩次濾液，稱定濾液重量［9］。

1.4.4 出膏率測定 取合并水煎液50 g，精密稱定，放于已恒定重量的蒸發皿中，置于水浴鍋上蒸干，放在105 ℃烘箱內干燥3 h，移至干燥器中，冷卻30 min，稱重，計算水煎液含固量，并根據水煎液總重量和飲片重量換算出膏率。

出膏率=固體重（g）×水煎液總重量（g）/［取樣量（g）×飲片重量（g）］×100%

1.5 數據分析

采用正交設計助手Ⅱ3.1 軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 供試蜜枇杷葉的高效液相色譜

由圖2 可知，供試蜜枇杷葉的高效液相色譜中，齊墩果酸和熊果酸的出峰時間分別為21.133、22.120 min，與對照樣品的出峰時間相近，說明蜜枇杷葉中含有齊墩果酸和熊果酸。

圖2 供試蜜枇杷葉的高效液相色譜

2.2 正交試驗結果

蜜枇杷葉炮制工藝的正交試驗設計［10，11］及結果見表2，方差分析結果見表3。由直觀分析可知，各因素對蜜枇杷葉炮制工藝的影響大小順序為C＞A＞B＞D。方差分析結果表明，炒制溫度（C）對炮制工藝有顯著影響。A、B、D因素對蜜枇杷葉炮制工藝無顯著影響。因此，從直觀和方差分析結果并結合實際情況進行調整得到，蜜枇杷葉的最佳炮制工藝為A2B1C2D1，即取凈枇杷葉300 g，加入20%的蜂蜜（蜜∶水=3∶1，m∶m）拌勻，悶潤1.0 h，置于140 ℃的炒藥機中炒制15 min，取出，晾涼篩去碎屑，即可。

表2 蜜枇杷葉炮制工藝的L9（34）正交試驗結果（n=3）

表3 綜合評分方差分析結果

2.3 驗證性試驗

取枇杷葉絲500 g，按優選的蜜炙工藝制備蜜枇杷葉樣品3 份，測定其齊墩果酸和熊果酸總量、浸出物及標準湯劑出膏率［12］，驗證結果見表4。結果表明，采用該優選工藝蜜枇杷葉齊墩果酸和熊果酸總量、浸出物及標準湯劑出膏率均較穩定，表明該蜜炙工藝較穩定、可控。即蜜枇杷葉的最佳工藝為取干凈枇杷葉絲，加入20%的蜂蜜（蜜∶水=3∶1，m∶m）拌勻，悶潤1.0 h，置于140 ℃的炒藥機中炒制15 min，取出，晾涼篩去碎屑，即可。

表4 驗證試驗結果

3 討論

李煥平［5］優選的蜜枇杷葉工藝為取枇杷葉，加入40%煉蜜，悶潤0.5 h，炒制溫度（150±5）℃，炒制時間10 min。李文兵等［6］優選的工藝為取煉蜜，按1∶1的比例加入沸水稀釋，加入枇杷葉絲悶潤1.0 h，220 ℃炒制15 min 即可。這兩種優選的工藝各不相同，本研究以齊墩果酸和熊果酸總量、浸出物及標準湯劑出膏率綜合指標代替單一指標來考察和優選蜜枇杷葉的炮制工藝，結果更科學和客觀。

該試驗以浸出物、標準湯劑出膏率及齊墩果酸和熊果酸總量為綜合優選評價指標，采用正交試驗優選出的蜜枇杷葉炮制工藝穩定，重現性良好，可在一定程度上為蜜枇杷葉的工業化生產提供參考。此外，僅從浸出物、標準湯劑出膏率和指標性成分角度來優選蜜枇杷葉的工藝尚且不足，還應結合藥理藥效優選蜜枇杷葉工藝［13］。