內生菌協同發酵對半夏多糖及其生物活性的影響

羅 偉，楊立軍，崔晨旭，王玉嬌，陳 瓊，王銳麗，葉 潤

（信陽農林學院制藥工程學院，河南 信陽 464000）

半夏［Pinellia ternata（Thunb.）Breit.］又名地文、守田等，為天南星科植物半夏的干燥塊莖，是中國傳統中草藥，除西藏、新疆外，全國均有分布［1］，有燥濕化痰、降逆止嘔、生用消癤腫等藥理作用［2］。半夏在治療抑郁癥［3］、動脈粥樣硬化［4］、慢性阻塞性肺疾病［5］以及癌癥等方面效果顯著；半夏化學成分豐富，多糖是其重要的化學成分，在抗腫瘤等方面具有較高的潛力［6］。

微生物發酵作為中藥材炮制的重要手段［7］，具有強大的生物轉化功能，不僅能夠產生新的次級代謝產物，還可以增強藥材原有特性或產生新的效果，較大地擴大了藥物的應用范圍，并有助于其滿足臨床應用的嚴格要求［8］。而傳統的中藥發酵存在菌種不純、僅對自然界的菌種進行利用、難以有目的地定向改變藥物的性能等問題［9］。同時自然界中不占優勢、生長條件要求比較嚴格的有益微生物，難以在自然條件下正常生長，較大地限制了微生物的作用。此外，有害菌的落入等也使微生物在藥物中的潛在效能沒有最大限度地發揮出來［10］。內生菌是定植在植物內部組織的微生物，存在于所有已知的植物物種中［11］，與宿主植物互惠共生，植物與內生菌之間的緊密協同作用使內生菌能夠合成各種潛在的次級代謝產物［12］。研究表明，法國梧桐中的內生菌可以將白樺脂酸轉化為具有抗癌、抗HIV等藥理活性的樺木酮酸［13］。Kim 等［14］通過擔子菌發酵減少了漆樹莖皮中漆酚等過敏性物質的含量，并在一定程度上保留了漆樹的抗氧化活性。此外，內生菌在生產重要的藥用化合物如紫杉類、長春新堿、金絲桃素等毒素中也起著至關重要的作用［15，16］。

微生物發酵技術已廣泛應用于各個領域，但鮮見半夏微生物發酵的相關報道。因此，本研究以半夏粉末為原料，協同兩株高產胞外多糖的半夏內生真菌進行固態發酵。以半夏多糖得率為指標，通過單菌和混菌發酵、單因素試驗與正交試驗分別篩選出菌種的最適添加比例與最佳發酵條件；并對發酵前、后半夏多糖的得率，抗氧化、降血糖能力與電鏡結構進行比較分析，探討內生菌協同發酵對半夏多糖生物活性與結構的影響，以期為半夏多糖的高效利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

半夏塊莖購自信陽張仲景大藥房；土曲霉（Aspergillus terreus）與亞黑管菌（Bjerkandera adusta）為分離自半夏的高產胞外多糖內生真菌。馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL。馬鈴薯葡萄糖（PDB）：PDA 內不添加瓊脂。α-葡萄糖苷酶、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺（ABTS）購自合肥千盛生物科技有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

WFJ-15 型超微粉碎機，江蘇康臣干燥工程有限公司；GT10-1 型高速臺式離心機，北京時代北利離心機有限公司；雙層恒溫振蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司；1510 全自動酶標儀，美國賽默飛世爾科技公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海三申醫療器械有限公司；SW-CJ-2F 型落地式潔凈工作臺，上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.3 菌種活化

PDA 與PDB 培養基在220 Pa、121 ℃條件下高壓滅菌15 min。取土曲霉、亞黑管菌，在無菌超凈工作臺中將菌株接種在PDA 培養基中，28 ℃培養5 d后得活化菌株。挑取菌絲體于PDB中，28 ℃、120 r/min條件下振蕩培養5～7 d，待菌種擴大培養至生長指數期后即得種子液。

1.4 發酵菌株篩選

取干燥粉碎后過80 目篩的半夏粉末，設置裝料量為每250 mL 15.0 g，121 ℃滅菌15 min，當發酵底物溫度降至室溫時分別接入菌株種子液，固定總接種量為8%，菌株比例如下，單菌；土曲霉∶亞黑管菌按（m/m）1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1 混菌；不接種的作為空白對照。28 ℃恒溫發酵120 h，發酵結束后將發酵物二次滅菌從而終止發酵的進行，測定多糖含量，以樣品多糖得率為指標篩選出最佳發酵菌種。

1.5 多糖含量測定

1.5.1 多糖提取 參考師景雙等［17］的方法，稍作修改如下，稱取樣品按料液比1∶10（g/mL）加無水乙醇，90 ℃水浴浸提2 h，去油、抽濾、收集固體殘留物，晾干稱重備用。取去油后固體按比例加水，加熱套回流提取，提取后以4 000 r/min 離心15 min 收集上清液，再旋轉蒸發濃縮溶液至1/5，加入Sevage 試劑（三氯甲烷∶正丁醇=4∶1）混合振搖，4 000 r/min 離心15 min 分液除去蛋白質，取上清液加入3 倍無水乙醇后4 ℃靜置過夜，離心后收集沉淀即為多糖樣品。

1.5.2 標準曲線的制備 采用苯酚-硫酸法［18］測定多糖含量，以葡萄糖含量為橫坐標（x）、吸光度為縱坐標（y），建立葡萄糖標準曲線方程y=23.749x+4.107 5，R2=0.995 1。

1.6 單因素試驗

用電子天平稱取15 g 半夏粉末，121 ℃滅菌15 min 后制得發酵底物，選擇發酵溫度、發酵時間和接種量3 個因素進行單因素試驗，每個因素研究5個水平，發酵溫度分別為25、28、31、34、37 ℃；發酵時間分別為100、110、120、130、140 h；接種量分別為6%、8%、10%、12%、14%。

1.7 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，分別選取發酵溫度、發酵時間與接種量進行三因素三水平的正交試驗，試驗設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計

1.8 抗氧化能力測定

1.8.1 DPPH 自由基清除能力測定 參考劉娜等［19］的方法測定DPPH 自由基清除能力。

1.8.2 ABTS 自由基清除能力測定 參考段鴻斌等［20］的方法測定ABTS 自由基清除能力。

1.8.3 羥基自由基清除能力測定 采用羥基自由基清除法［21］進行測定。具體計算式如下。

式中，A0為蒸溜水代替樣品的吸光度；Ai為樣品吸光度；Aj在DPPH、ABTS、羥基自由基清除能力測定中分別表示無水乙醇代替DPPH 應用液的吸光度、蒸餾水代替ABTS 工作液的吸光度、蒸餾水代替FeSO4溶液的吸光度。

1.9 降血糖能力測定

參考Dong 等［22］的PNPG 法，并稍作修改，以阿卡波糖作為陽性對照，將樣品和阿卡波糖分別配置成質量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL 的溶液。取10 μL 各樣品溶液與45 μL 5 U/mL α-葡萄糖苷酶磷酸鹽溶液，振蕩混勻后置于37 ℃培養箱，使其反應10 min。然后加入35 μL 5 mmol/L 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）溶液啟動反應，并置于37 ℃培養箱孵育30 min，加入100 μL 碳酸鈉溶液終止反應，于波長405 nm 處測定其吸光度。具體計算式如下。

式中，B0為磷酸緩沖溶液代替樣品的吸光度；Bi為樣品的吸光度；Bj為磷酸緩沖溶液代替α-葡萄糖苷酶溶液的吸光度。

1.10 表面形態觀察

將樣品固定在導電膠上，鍍金后，利用掃描電鏡對樣品的外觀形貌進行觀察，并選擇放大倍數為5 000 倍時樣品的表面結構進行對比分析。

1.11 數據分析

每組試驗重復3 次，分別使用SPSS 26.0、Origin 2018 軟件進行數據分析與繪圖。

2 結果與分析

2.1 發酵菌株篩選結果

單菌發酵與混菌發酵對半夏多糖得率的影響如圖1 所示，微生物發酵技術能夠提高發酵產物中功能性組分的含量［23］，如可溶性膳食纖維、多酚化合物、蛋白質與多糖等，是一種綠色且環保的生物轉化手段；楊金梅等［24］通過對粉葛的發酵使粉葛中大豆苷元、大豆苷、葛根素、總異黃酮、可溶性多糖和總淀粉含量多數成倍增加；謝瑾［25］通過對干基草石蠶進行發酵使水蘇糖的純度得到較大程度的提高。本研究中，相較于未進行發酵時半夏多糖得率（10.83%），經過發酵后半夏粉末的多糖得率均得到不同程度的提高。其中，第5 種發酵類型（土曲霉∶亞黑管菌=2∶1）的半夏多糖得率最高，為16.58%，因此，選擇土曲霉∶亞黑管菌為2∶1 對半夏進行發酵。

圖1 單菌發酵與混菌發酵對半夏多糖得率的影響

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 發酵溫度對協同發酵半夏多糖含量的影響 溫度是影響菌株生長和代謝的重要因素。Lin 等［26］的研究表明，最佳溫度可以促進菌株更旺盛的生長，使活菌數量更多，酶活性更高，從而保證更好的發酵質量。如圖2 所示，發酵溫度對半夏多糖得率的影響較大，當發酵溫度為25～31 ℃時，半夏多糖得率呈上升趨勢；當發酵溫度為31～37 ℃時，半夏多糖得率呈下降趨勢；在31 ℃時半夏多糖得率達到最大，為18.27%。綜上，選取28、31、34 ℃進行正交試驗。

圖2 發酵溫度對半夏多糖得率的影響

2.2.2 發酵時間對協同發酵半夏多糖含量的影響 發酵時間是決定發酵質量的重要因素。在發酵過程中，隨著發酵時間的延長，微生物通過消耗營養物質不斷繁殖，導致藥物殘留的有效成分和營養價值發生變化［27］。如圖3 所示，隨著發酵時間的延長，半夏多糖的得率先上升后下降，120 h 時達到最大，為16.58%；內生菌以半夏粉末為基質進行發酵，隨著發酵時間延長，發酵基質中有限的營養物質被大量消耗，無法供應菌種的正常生長和代謝，可能會消耗發酵產生的半夏多糖，從而使多糖含量下降。綜上，選取發酵時間110、120、130 h 進行正交試驗。

圖3 發酵時間對半夏多糖得率的影響

2.2.3 接種量對協同發酵半夏多糖含量的影響 接種量與發酵基質中菌種的繁殖速度密切相關，適宜的接種量不僅可以縮短發酵時間，提高發酵速率，而且對發酵基質的狀態及營養物質含量存在調控作用［24］。接種量對半夏多糖得率的影響如圖4 所示，隨著接種量的增加，半夏多糖得率先緩慢上升，在接種量為12%時達到最大；接種量大于12%后急劇下降。綜上，選取接種量10%、12%、14%進行正交試驗。

圖4 接種量對半夏多糖得率的影響

2.3 正交試驗結果與分析

正交試驗設計結果見表2，方差分析結果見表3。R代表極差，極差越大，則表明該因素對多糖得率的影響越大。表3 的F是兩個均方的比值，F越大，說明此項對多糖得率的影響越顯著，則影響多糖得率的主次因素發酵時間（B）＞發酵溫度（A）＞接種量（C）。半夏協同發酵的最佳發酵條件為A2B1C2，即發酵溫度31 ℃、發酵時間110 h、接種量12%。按上述發酵條件進行3 次重復驗證試驗，最終多糖得率為21.76%,相較于未發酵得到顯著提高（P＜0.05）。

表2 正交試驗設計結果

表3 正交試驗方差分析結果

2.4 發酵前、后半夏多糖抗氧化能力的變化

發酵前、后半夏多糖對DPPH 自由基、羥基自由基、ABTS 自由基的清除能力如圖5 所示，可以看出，在一定范圍內，無論是發酵前還是發酵后，半夏多糖對DPPH 自由基、ABTS 自由基、羥基自由基均具有一定的清除能力，且清除率隨著濃度的增加均呈上升趨勢，雖然半夏多糖的抗氧化能力均不及維生素C，但發酵后半夏多糖的抗氧化能力明顯大于發酵前半夏多糖的抗氧化能力。發酵后半夏多糖對3種自由基的半數清除濃度如表4 所示，其對DPPH自由基的清除作用最強，對ABTS 自由基的清除作用次之，對羥基自由基的清除作用最弱；當發酵后半夏多糖濃度為8 mg/mL 時，其對DPPH 自由基、羥基自由基、ABTS 自由基的清除率分別為92.28%、79.12%、83.95%。微生物發酵可以使底物的抗氧化活性得到提升，這與董佳萍等［28］的研究結果一致。

表4 發酵前、后半夏多糖與維生素C 對DPPH、ABTS、羥基自由基的半數清除濃度（IC50） （單位：mg/mL）

2.5 抑制α-葡萄糖苷酶活性結果與分析

α-葡萄糖苷酶作為一種重要的碳水化合物水解酶，在將低聚糖和二糖轉化為葡萄糖，從而降低血糖的過程中起著關鍵作用［22］。由圖6 可知，在0.2～1.2 mg/mL 濃度內，發酵前、后半夏多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制活性均呈量效關系，發酵后的半夏多糖對α-葡萄糖苷酶的半數清除濃度為0.368 mg/mL，低于未發酵時半夏多糖的半數清除濃度為0.661 mg/mL。當濃度為1.2 mg/mL 時，發酵前、后半夏多糖對α-葡萄糖苷酶的清除率分別達70.57%、89.30%，發酵后的半夏多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制效果雖然弱于阿卡波糖，但得到明顯增加，說明發酵后的半夏多糖具有良好的體外降血糖能力。

圖6 發酵前、后半夏多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制能力

2.6 掃描電鏡結果

對發酵前、后的半夏多糖分別進行掃描電子顯微鏡觀察，放大5 000 倍后的觀察結果如圖7 所示。發酵后半夏多糖的微觀結構呈明顯孔絮狀，邊緣不整，內部孔隙多，不平整；而發酵前半夏多糖的微觀結構呈片塊狀，整體形貌較發酵后更規則，表面較平整光滑。發酵后半夏多糖呈碎片孔絮狀結構，可能是由于在進行發酵時，多糖結構被降解成小分子或者發酵導致分子質量與構象發生變化。

圖7 發酵前、后半夏多糖的掃描電鏡觀察

3 小結與討論

通過內生菌協同發酵可以提高半夏多糖的得率與生物活性，最適添加比例為土曲霉∶亞黑管菌=2∶1；通過單因素試驗與正交試驗得出的最佳發酵條件為發酵溫度31 ℃、發酵時間110 h、接種量12%，最終半夏多糖的得率為21.76%，相較于未發酵時的10.83%得到顯著提高（P＜0.05）。降血糖與抗氧化試驗發現，發酵后的半夏多糖抑制α-葡萄糖苷酶的IC50減小了0.293 mg/mL；對DPPH 自由基、ABTS 自由基、羥基自由基的IC50分別減小了0.137、0.231、0.218 mg/mL；其中，它對3 種自由基的清除能力從大到小依次為DPPH 自由基、ABTS 自由基、羥基自由基。這表明，采用植物的內生真菌進行發酵可以有效提高植物的生物活性，這與Kim 等［14］利用內生菌進行協同發酵的結果一致。半夏中多糖得率與活性得到有效提高，為半夏多糖的深入研究以及相關功能性產品的開發與利用奠定了基礎，促進了半夏產業的發展，同時也為內生菌對藥用植物的生物轉化作用提供了理論依據。本研究在對半夏發酵的研究中，僅初步研究了半夏與兩株胞外多糖菌株協同發酵后其多糖的變化，并未對多糖主要活性成分及其他活性進行深入的對比分析。因此，后續將采用紅外光譜、氣質等技術對發酵前、后半夏多糖的結構組成進行分析；并對發酵后半夏多糖的抑菌能力進行測定。