外用制劑“甲節(jié)減”對昆明小鼠抗炎鎮(zhèn)痛作用的初步探究

陳憲梅，吳濤，曲夢柔，于旭峰，孫春燕，畢迦琦，王杰瓊，喬明琦?

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥經(jīng)典理論教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250355；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)情志病證研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，山東 濟(jì)南250355；4.山東中醫(yī)藥大學(xué)情志病證肝藏象藥理青年科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，山東 濟(jì)南 250355）

甲狀腺結(jié)節(jié)是常見的甲狀腺疾病之一，目前發(fā)病率逐年上升［1］，良性率較高，惡性結(jié)節(jié)不到10%，但常被過度治療造成不可逆的損傷。因此減少因手術(shù)治療帶來的不可逆損傷，成為近年來甲狀腺結(jié)節(jié)研究的新方向［2］。中性粒細(xì)胞促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，而淋巴細(xì)胞抑制腫瘤進(jìn)展［3］，此外感染和炎癥是纖維化組織沉積的關(guān)鍵過程［4］。因此探究外用制劑“甲節(jié)減”是否具有抗炎效果從而輔助治療甲狀腺結(jié)節(jié)具有一定的臨床診療價值。外用制劑“甲節(jié)減”治療甲狀腺結(jié)節(jié)有明顯效果，但就其抗炎鎮(zhèn)痛效果評價及抗炎機(jī)制并沒有作進(jìn)一步研究。炎癥是眾多疾病共同的病理表現(xiàn)，在進(jìn)行藥理學(xué)試驗(yàn)時須使用不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?］。因此本研究旨在采用經(jīng)典急、慢性炎癥模型及鎮(zhèn)痛模型，探究中藥復(fù)方外用制劑“甲節(jié)減”抗炎、鎮(zhèn)痛效果及量效關(guān)系，以期為外用制劑“甲節(jié)減”進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級雄性昆明（KM）小鼠（北京維通利華動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SDA0040003），體質(zhì)量（20±2）g，于本單位動物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：恒溫（22±2 ℃），恒濕（40±5）%，晝夜各12 h。

1.2 藥物與試劑

連翹、浙貝母、夏枯草、煅牡蠣、黃芩、柴胡、牡丹皮和醋莪術(shù)（安徽百歲堂中藥股份有限公司，批號：210301、210601、210301、200401、210801、210701、211101 和211101）；二甲苯（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號：XK13011140001）；云南白藥（三九醫(yī)藥股份有限公司，批號：Z53021103）；角叉菜膠（山東中森生物技術(shù)有限公司，批號：c804872）。

1.3 主要儀器

XIR 型離心機(jī)（賽默飛科技有限公司）；NPP-10000UL 型移液器（北京中西華大科技有限公司）；SpcctraMaxiD5 型全自動酶標(biāo)儀（賽默飛科技有限公司）；SQP 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；BBS-SDC 型超凈工作臺型（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）；75JA150317 立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；ER12-YLS 型鼠尾光照測痛儀（江蘇賽昂斯生物科技有限公司）；DHG-9240A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 外用制劑“甲節(jié)減”的制備工藝

取配伍好的“甲節(jié)減”方劑500 g，10倍量蒸餾水浸泡過夜，次日8倍水量煎煮3次，每次1 h得水提物；取出藥液備用，藥渣中倒入蒸餾水5 L，煎煮提取2 次，每次1.5 h；合并藥液并加入70%醇至1 225 mL，醇沉過夜。將醇提物置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中加熱回流，旋蒸萃取，濃縮至250 mL，生藥濃度2 g/mL，即可關(guān)閉裝置減壓回收溶劑。按比例配取高、中、低濃度（20、10、5 mL/kg）梯度的“甲節(jié)減”藥液各10 mL。

2.2 二甲苯致耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)

SPF級50只健康雄性KM小鼠，自由飲食1周，根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、陽性藥組（云南白藥酊劑）和“甲節(jié)減”高、中、低劑量組（20、10、5 mL/kg），每組10只。各組小鼠每日1 次外涂相應(yīng)藥物于右耳耳廓處，“甲節(jié)減”高、中、低劑量組涂抹20、10、5 mL/kg“甲節(jié)減”，陽性藥組涂抹云南白藥酊劑10 mL/kg，模型組涂抹空白基質(zhì)蒸餾水10 mL/kg。每日上午8：00不間斷給藥7 d，在末次給藥2 h后，將0.05 mL 劑量的二甲苯均勻涂抹于每只KM 小鼠右耳耳廓前后，置于通風(fēng)櫥內(nèi)自由活動30 min后，脫頸處死小鼠，用直徑8 mm的耳廓打孔器在KM小鼠左、右耳耳廓等位處打下8 mm耳片并稱量其重量，分別計算出各組的腫脹度及腫脹抑制率［6］。

腫脹度（mg）=右耳耳廓質(zhì)量 -左耳耳廓質(zhì)量

腫脹抑制率（%）=（模型組右耳耳廓腫脹度均值 -給藥組右耳耳廓腫脹度均值）/模型組右耳耳廓腫脹度均值×100%

2.3 棉球致肉芽腫脹實(shí)驗(yàn)

2.3.1 棉球制作方法

術(shù)前將（5±0.5）mg的脫脂棉球用121 ℃高壓滅菌鍋滅菌30 min，滅菌完成后放入烘箱中60 ℃進(jìn)行烘干。

2.3.2 棉球致肉芽腫脹實(shí)驗(yàn)步驟

小鼠稱重后全身消毒，用濃度為1%的異氟烷進(jìn)行呼吸麻醉。待小鼠麻醉后，用高壓滅菌的手術(shù)器械對KM 小鼠進(jìn)行棉球包埋手術(shù)，具體操作步驟如下：小鼠仰臥位，用無菌手術(shù)刀在其左膝下約0.3 mm處劃開一小切口，將干燥滅菌的棉球植入小鼠膝下，并用75%酒精對傷口消毒。

實(shí)驗(yàn)分組及給藥方案同“2.2”。待手術(shù)完成1 h后對各組小鼠進(jìn)行涂抹給藥。每日8：00 不間斷給藥7 d，每日1次外涂。第7天給藥1 h后，將KM小鼠脫椎處死，取出之前包埋的棉球，去除多余脂肪組織，放入烘箱中60 ℃烘干至恒重，其重量減去棉球重量即為肉芽腫重量［4］。

2.4 小鼠血清中TNF-α 和IL-1β 抗炎因子含量的測定

實(shí)驗(yàn)分組及給藥方案同“2.2”。采用ELISA 法定小鼠血清中細(xì)胞因子含量，末次給藥2 h 后，眼球采血1 mL 置于1.5 mL 離心管中，血液靜置于5 mL 離心管30 min，3 500 r/min 離心15 min，取上清，根據(jù)試劑盒說明書測定其血清中的抗炎因子（TNF-α、IL-1β）的含量［7］。

2.5 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)

將KM 小鼠距尾尖1/3 處用75%酒精擦拭，隨后將相應(yīng)藥物涂抹于小鼠的尾部，0.5 min后固定于小鼠固定器內(nèi)。將筒后蓋中心孔穿出的小鼠尾部保持自然下垂，并放置于小圓棍上待小鼠保持安靜后開始實(shí)驗(yàn)。鼠尾因光照熱痛產(chǎn)生的瞬間抽痛甩尾反應(yīng)即為陽性反應(yīng)，給藥前測試痛閾，以3～13 s為限，舍棄給藥前痛閾＜3 s 或＞13 s 的小鼠。實(shí)驗(yàn)分組及其給藥方案同“2.2”。給藥7 d后，分別在0.5、1.5、2 h把小鼠放在光照測痛儀上，記錄小鼠甩尾時長（甩尾時長＞16.5 s 的按16.5 s 處理）。基礎(chǔ)痛閾的計量方式為給藥前痛閾的3次均值，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理（q檢驗(yàn)）［8］。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。計數(shù)資料用［例（%）］表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠二甲苯致耳廓急性腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

小鼠耳廓急性腫脹模型中，各組間比較均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組二甲苯致KM小鼠耳廓急性腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

3.2 慢性炎癥實(shí)驗(yàn)

3.2.1 各組小鼠棉球致肉芽腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

與模型組比較，“甲節(jié)減”中、高劑量組的肉芽腫質(zhì)量極顯著降低（P＜0.01），表明“甲節(jié)減”中、高劑量組外用制劑均能有效抑制KM 小鼠肉芽腫脹程度。與陽性藥組比較，“甲節(jié)減”中、高劑量組肉芽腫質(zhì)量無統(tǒng)計學(xué)意義，說明“甲節(jié)減”的治療效果與陽性藥相當(dāng)。見表2。

表2 “甲節(jié)減”外用制劑對KM小鼠肉芽腫的影響（±s）

表2 “甲節(jié)減”外用制劑對KM小鼠肉芽腫的影響（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

抑制率/%—43.56 44.78 51.26 32.05組別模型組陽性藥組“甲節(jié)減”高劑量組“甲節(jié)減”中劑量組“甲節(jié)減”低劑量組n 10 10 10 10 10劑量/（mL/kg）10 10 20 10 5肉芽腫質(zhì)量/mg 205.00±6.09 115.00±6.89 113.20±5.62**99.90±2.76**139.30±6.15**

3.2.2 各組小鼠血清中TNF-α 和IL-1β 含量的比較

與模型組比較，“甲節(jié)減”各劑量組血清中TNF-α含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但“甲節(jié)減”中劑量組有降低趨勢，其原因可能與給藥時間過短有關(guān)。“甲節(jié)減”中、高劑量組IL-1β 含量極顯著降低（P＜0.01），說明“甲節(jié)減”中、高劑量組的抗炎效果與體內(nèi)炎癥因子含量的變化有關(guān)。與陽性藥組比較，“甲節(jié)減”中劑量組TNF-α 有降低趨勢，“甲節(jié)減”中、高劑量組IL-1β含量極顯著降低（P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組小鼠TNF-α、IL-1β含量比較

3.3 各組小鼠鎮(zhèn)痛作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

與模型組比較，“甲節(jié)減”中、高劑量組小鼠給藥后2 h痛閾有顯著性升高，中劑量組差異最明顯（P＜0.01，P＜0.05），說明甲節(jié)減外用制劑中、高劑量組對小鼠有鎮(zhèn)痛效果，中劑量最優(yōu)。與陽性藥組比較，各給藥組無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明“甲節(jié)減”治療效果與陽性藥相當(dāng)。見表3。

表3 各組小鼠痛閾的影響比較（±s）

表3 各組小鼠痛閾的影響比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別模型組陽性藥組“甲節(jié)減”高劑量組“甲節(jié)減”中劑量組“甲節(jié)減”低劑量組給藥后2 h/s 5.35±1.47 5.40±1.14 6.95±1.48*7.26±1.58**5.37±1.92 n 10 10 10 10 10劑量/（mL/kg）10 10 20 10 5給藥前/s 5.59±5.50 5.35±3.10 5.36±3.08 5.28±3.24 5.20±2.67給藥后0.5 h/s 5.80±1.66 4.86±1.09 5.39±3.53 6.45±2.30 5.19±1.22給藥后1 h/s 5.89±2.65 6.68±1.39 6.23±2.13 6.00±0.81 6.10±0.57

4 討論

“甲節(jié)減”中主要成分連翹酯苷、夏枯草油、丹皮酚、柴胡皂苷和黃芩素等均具有抗病毒、抗腫瘤及抗菌抗炎等多種功效［9-16］。本方君藥為連翹，具有清熱解毒、消腫散結(jié)之功，抗炎作用是連翹發(fā)揮消腫散結(jié)功效的主要藥理作用之一［17］。柴胡中含有的柴胡皂苷C（SSc），與CNR2相互作用，能夠激活抑制淋巴因子和血管生成因子的釋放，從而影響炎癥過程。黃芩中的成分白楊素能通過對TNF-α 的增敏作用抑制NF-κB 的活性進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用［12-13］。此外腫脹和炎性滲出是評估抗炎反應(yīng)重要步驟和中心環(huán)節(jié)。二甲苯能夠立即促使小鼠耳廓部位發(fā)生急性耳腫脹，本研究中發(fā)現(xiàn)“甲節(jié)減”可顯著減少二甲苯引起的水腫，這種反應(yīng)的抑制可能是消炎作用的跡象［5，18-19］。炎癥反應(yīng)亦可誘發(fā)疼痛，因此檢測小鼠痛閾值可以反映小鼠炎癥情況。受細(xì)菌、病毒等病原體侵襲或機(jī)體自身組織損傷的影響，可使體內(nèi)產(chǎn)生TNF-α、IL-1β，因此檢測TNF-α與IL-1β的含量可反映出機(jī)體的炎性程度，TNF-α與IL-1β含量越高，胰島素抵抗越嚴(yán)重提示小鼠存在低度慢性炎癥反應(yīng)［7，20］。因此，通過檢測機(jī)體腫脹程度，TNF-α和IL-1β 含量以及鎮(zhèn)痛效果可反映機(jī)體的基本炎癥狀況。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)“甲節(jié)減”中、高劑量組能有效抑制小鼠慢性炎癥模型，中劑量組效果最好，且在小鼠慢性炎癥模型中，“甲節(jié)減”中、高劑量組對小鼠慢性炎癥的治療效果與陽性藥組相當(dāng)。“甲節(jié)減”中、高劑量組均可降低小鼠血清中IL-1β 的含量，“甲節(jié)減”低劑量組血清中TNF-α與模型組比較無明顯差異，但“甲節(jié)減”中劑量組有降低趨勢。IL-1β 顯著降低，提示“甲節(jié)減”能夠起到預(yù)防炎癥發(fā)生的作用，其主要抗炎機(jī)制與抗炎因子IL-1β含量有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)通過急慢性炎癥模型分別評價甲節(jié)減的抗炎作用，結(jié)果表明“甲節(jié)減”對慢性炎癥的治療效果較好，但對急性炎癥的治療效果一般。此結(jié)果可能與本方君藥為連翹有關(guān)。王婷婷等［21］分別建立急、慢性炎癥兩個模型評價連翹的抗炎效果，結(jié)果表明，連翹葉對耳腫脹抑制效果一般，但對棉球肉芽腫的抑制效果最好，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

本研究揭曉了中藥復(fù)方“甲節(jié)減”外用制劑的抗炎、鎮(zhèn)痛效果及量效關(guān)系，在抗炎效果的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對其抗炎機(jī)制進(jìn)行初步探究。不足之處為本研究主要從抗炎因子的角度探尋其抗炎機(jī)制，尚未進(jìn)行相關(guān)通路層面的探究。后續(xù)將對“甲節(jié)減”抗炎機(jī)制相關(guān)通路進(jìn)行深入研究，為臨床研發(fā)治療甲狀腺結(jié)節(jié)的新藥奠定前期基礎(chǔ)。