基于AMPK/mTOR通路介導的自噬探討溫補固腎方對糖尿病腎纖維化的影響

禹靜，劉續春，李振華

（1.黃淮學院直屬附屬駐馬店市中心醫院，河南 駐馬店 463000；2.鄭州市中心醫院，河南 鄭州 450001）

糖尿病腎病是慢性腎臟疾病以及終末期腎衰竭的主要病因，也是糖尿病重要的微血管并發癥和主要的死亡病因［1］。既往研究發現，全球大約有30%～40%的糖尿病患者會伴隨疾病的遷延和進展成為糖尿病腎病，伴有終末期腎病的患者五年生存率低于20%［2］。因此，延緩或阻止糖尿病腎病進展對于改善患者生存質量具有重要的臨床意義。糖尿病腎病發病機制復雜，主要包括纖維化、炎癥反應、氧化應激以及糖脂代謝紊亂等。眾多研究已證實，腎纖維化是糖尿病腎病進行性加重的重要因素［3］。因此，積極尋找能夠抑制腎纖維化的新型治療藥物或方式對于改善糖尿病腎病進展具有重大的意義。

中醫藥在治療糖尿病腎病方面療效確切。溫補固腎方以溫陽補腎固腎為治療根本大法，佐以收澀補氣之品［4］，本課題組前期研究顯示，其能夠通過下調collagen Ⅲ、TGF-β1 蛋白表達抑制腎纖維化，從而改善糖尿病腎損傷［5］。但是有關溫補固腎方對糖尿病腎纖維的調控機制尚不明晰。自噬是細胞中代謝產物及錯誤折疊蛋白降解的重要途徑，即細胞能夠通過降解自噬小體內包裹的損傷細胞器、病原體以及蛋白質，從而維持細胞正常的生理功能［6］。研究顯示，在糖尿病腎病大鼠中自噬水平被顯著性抑制，而激活細胞自噬能夠顯著抑制糖尿病腎病腎纖維化，改善糖腎損傷［3］。可見，細胞自噬與糖尿病腎纖維化的關系密切，通過調控細胞自噬可能是抑制腎纖維化，改善糖尿病腎病的重要機制。AMPK/mTOR 途徑是調節自噬的重要途徑之一，AMPK 激活后能夠激活TSC1/2 蛋白，進而抑制mTOR 活化，從而誘導細胞自噬形成［7］。因此，本研究擬通過構建糖尿病腎病大鼠模型，探究溫補固腎方能否通過調控AMPK/mTOR 通路介導的細胞自噬，抑制糖尿病腎纖維化，并最終改善糖腎損傷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（滬）2021-0002，100只，體質量180～210 g。大鼠適應性喂養7 d，期間正常飲食、飲水，晝夜12 h/12 h 交替光照，溫度（25±2）℃，相對濕度45%～55%，動物實驗經我院醫學倫理委員會批準（批準號：20191002），符合3R原則。

1.1.2 藥物與試劑

溫補固腎方制劑由廣東一方制藥有限公司提供，組方：黨參0.1 g，山茱萸0.12 g，芡實0.2 g，枸杞子0.1 g，覆盆子0.1 g，菟絲子 0.1 g，淫羊藿 0.1 g，益智仁 0.1 g；達格列凈片（AstraZeneca Pharmaceuticals LP，規格：10 mg/片，國藥準字J20170040）；AMPK 抑制劑Compound C（美國Selleck公司，貨號：S7306）；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒、PAS 染色試劑盒、Masson 染色試劑盒、蛋白質濃度測定試劑盒、發光液、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗（上海碧云天生物技術公司，貨號：C0105S、T4106、T4104、P0011、P0018 FS、A0409、A0413）；免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號：SP-9001）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、4%多聚甲醛、2.5%戊二醛固定液（北京索萊寶科技有限公司，貨號：S8050、20151211、P1126）；α-SMA 抗體、E-Cadherin 抗體、LC3 抗體、AMPK 抗體、p-AMPK 抗體、mTOR 抗體、p-mTOR 抗體（英國Abcam 公司，貨號：ab5694、ab76055、ab192890、ab271188、ab131357、ab134903、ab137133）。

1.1.3 儀器

血糖儀（瑞士Roche 公司，型號：卓越精采型）；多功能酶標儀（長春樂鏷科技有限公司，型號：LP-5117）；熒光倒置顯微鏡（日本/奧林巴斯Olympus，型號：CKX53）；高速冷凍離心機（湖南可成儀器設備有限公司，型號：H3-18KR）；凝膠成像系統（美國Bio-Rad伯樂公司，型號：Gel Doc XR+）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病腎病模型構建、分組及干預

SD 大鼠腹腔一次性注射STZ（60 mg/kg）構建糖尿病腎病模型。判定標準：STZ 注射后3 d，血糖值均 ≥16.7 mmol/L，且尿液蛋白呈現陽性者，被確認為模型構建成功。雄性SPF 級SD 大鼠100 只，除對照組20 只外，均采用腹腔注射鏈脲佐菌素（60 mg/kg）構建糖尿病腎病模型。其中60 只大鼠隨機分為對照組、糖尿病腎病組、達格列凈組（1.0 mg/kg）、溫補固腎方低、中、高劑量組（0.92、1.84、3.68 g/kg），每組各10 只。除對照組外，其余各組大鼠均采用STZ 誘導糖尿病腎病模型。溫補固腎方低劑量組劑量為0.92 g/kg，中、高劑量組分別為低劑量組的2 倍和4 倍。達格列凈組給予1.0 mg/kg 劑量達格列凈灌胃。對照組及糖尿病腎病組大鼠給予等量生理鹽水灌胃。以上各組大鼠1次/d，連續灌胃12 周。剩余40 只大鼠隨機分為對照組、糖尿病腎病組、溫補固腎方高劑量組（3.68 g/kg）、溫補固腎方高劑量組 + AMPK 抑制劑組（20 mg/kg），每組各10 只。除對照組外，其余各組大鼠均采用STZ 誘導糖尿病腎病模型。溫補固腎方高劑量組大鼠給予3.68 g/kg劑量灌胃。溫補固腎方高劑量組 + AMPK 抑制劑組大鼠給予3.68 g/kg 溫補固腎方灌胃，同時予以腹腔注射AMPK 抑制劑Compound C 20 mg/kg［8］。對照組及糖尿病腎病組大鼠予以腹腔注射等量生理鹽水。以上各組大鼠均為1次/d，干預12周。

1.2.2 腎功能生化指標檢測

各組大鼠分別干預12 周后，每組隨機取6 只大鼠進行尾靜脈采血，測定血糖值。收集尿液，按照試劑盒檢測說明書測定尿蛋白、肌酐及尿素氮含量。

1.2.3 腎組織病理學觀察

將腎組織放于10%的多聚甲醛中固定24 h、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、組織石蠟包埋、切片3～5 μm，行HE、PAS 及Masson 染色，顯微鏡下觀察心肌組織形態學變化及心肌纖維化程度。

1.2.4 免疫組化檢測α-SMA和E-Cadherin表達

每組隨機取6 只大鼠進行腎組織切片，經內源性過氧化物酶阻斷劑阻斷、抗原修復、組織封閉后，滴加α-SMA 抗體及E-Cadherin 抗體（1∶500），孵育過夜，對應二抗孵育2 h，滴加DAB 顯色液，蘇木素復染，于400倍顯微鏡下觀察腎組織α-SMA 及E-Cadherin 著色情況，并通過ImageJ 軟件計算腎組織α-SMA 及E-Cadherin 陽性細胞數量，以胞漿或胞膜呈棕色顆粒為陽性表達。

免疫組化陽性細胞表達率（%）=免疫組化陽性細胞數量/細胞總數×100%

1.2.5 電鏡觀察自噬小體及腎組織病理變化

將腎組織修剪成大小為1 mm×1 mm×1 mm組織塊，在1%四氧化鋨中固定3 h。采用分級乙醇和丙酮梯度脫水后，將樣品嵌入Spurr 樹脂中，并切成70 nm厚的薄片，最后采用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛染色，并用10 000 倍透射電子顯微鏡觀察自噬小體形態與數量。2.5%戊二醛固定腎組織，制備切片，電鏡下觀察腎組織病理形態變化。

1.2.6 Western blot 檢測腎組織LC3-Ⅱ、p-AMPK、p-mTOR表達

給藥12周后，立即將大鼠處死，剪取大鼠腎組織并提取總蛋白，按照1∶5質量與體積比加入細胞裂解液，于4 ℃條件下裂解40 min；BCA法測定各組大鼠腎組織蛋白質濃度；蛋白上樣（按照每孔上樣量30 μg計算得出上樣體積）；凝膠電泳；濕轉法轉膜；5% BSA室溫封閉2 h；分別加p-AMPK抗體（1∶1 000）、AMPK抗體（1∶1 000）、p-mTOR抗體（1∶500）、mTOR抗體（1∶1 000）、LC3抗體（1∶1 000）及β-actin抗體（1∶2000），4 ℃孵育過夜；加對應的山羊抗兔二抗或者山羊抗鼠二抗（1∶5 000），室溫孵育1～2 h；TBST洗滌3次，每次5 min，滴加顯影液，顯影并拍照。通過Image J 軟件定量分析各組蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法

采用SPSS20.0 統計軟件進行數據分析。所有實驗結果以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用多因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腎功能情況比較

與對照組比較，糖尿病腎病組大鼠FBG、BUN、Scr和24 h-UA均顯著增加（P＜0.01）。與糖尿病腎病組比較，溫補固腎方各劑量組和達格列凈組大鼠FBG、BUN、Scr 和24 h-UA 均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠腎功能生化指標比較（±s）

表1 各組大鼠腎功能生化指標比較（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與糖尿病腎病組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別對照組糖尿病腎病組達格列凈組溫補固腎方低劑量組溫補固腎方中劑量組溫補固腎方高劑量組24 h-UA/mg 5.49±1.35 44.13±7.39**11.12±2.31##35.74±4.77#30.43±4.45##28.65±5.74##n6 6 6 6 6 6劑量/（g/kg）——0.001 0.92 1.84 3.68 FBG/（mmol/L）5.28±0.25 28.20±4.05**10.59±2.42##23.66±1.99#18.05±2.29##16.23±2.41##BUN/（μmol/L）6.47±1.16 26.75±4.33**8.95±1.54##17.94±4.30##16.53±1.96##12.63±2.42##Scr/（μmol/L）45.07±7.05 101.16±15.82**49.98±7.59##76.69±12.15#69.45±11.19##52.23±11.05##

2.2 各組大鼠組織病理學情況比較

與對照組比較，糖尿病腎病組大鼠腎小球體積增大，間質增寬，且腎小管上皮細胞出現空泡變性，可見有部分紫紅色糖原沉積，呈典型的糖尿病腎損傷。與糖尿病腎病組比較，溫補固腎方各劑量組和達格列凈組大鼠腎小球體積增大，間質增寬以及腎小管上皮細胞空泡變性程度均有不同程度的減輕，且紫紅色糖原沉積明顯降低。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理學圖（×400）

2.3 各組大鼠腎纖維化情況比較

與對照組比較，糖尿病腎病組大鼠α-SMA 表達顯著升高，E-Cadherin 表達顯著降低（P＜0.01）。與糖尿病腎病組比較，溫補固腎方各劑量組和達格列凈組大鼠α-SMA 表達顯著降低，E-Cadherin 表達顯著升高（P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組大鼠腎組織α-SMA和E-Cadherin表達

2.4 各組大鼠腎組織細胞自噬水平情況比較

透射電鏡觀察各組大鼠腎組織自噬小體數量。結果顯示，與對照組比較，糖尿病腎病組大鼠自噬小體數量顯著減少。與糖尿病腎病組比較，溫補固腎方各劑量組和達格列凈組大鼠自噬小體數量均顯著增加。Western blot檢測各組大鼠腎組織自噬標志性蛋白LC3表達。結果顯示，與對照組比較，糖尿病腎病組大鼠腎組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著降低（P＜0.01）。與糖尿病腎病組比較，溫補固腎方各劑量組和達格列凈組大鼠腎組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。見圖3。

2.5 各組大鼠AMPK/mTOR通路蛋白表達情況比較

與對照組比較，糖尿病腎病組大鼠p-AMPK/AMPK 比值降低，p-mTOR/mTOR 比值升高（P＜0.01）。與糖尿病腎病組組比較，溫補固腎方各治療組和達格列凈組大鼠p-AMPK/AMPK 比值升高，pmTOR/mTOR比值降低（P＜0.05或P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組大鼠腎組織AMPK/mTOR通路蛋白表達

2.6 AMPK 抑制對溫補固腎方改善糖尿病腎病大鼠腎纖維化的影響

與對照組比較，糖尿病腎病組大鼠腎組織出現明顯的病理損傷，腎小球基底膜彌散性不均增厚，且伴有明顯的系膜基質增生，膠原沉積增多。與糖尿病腎病組比較，溫補固腎方高劑量組大鼠腎組織病理性損傷減輕，腎小球基底膜增厚程度明顯減輕，膠原沉積減少。與溫補固腎方高劑量組比較，溫補固腎方高劑量組 +AMPK抑制劑組大鼠腎組織病理損傷加重，腎小球基底膜增厚程度明顯加重，膠原沉積增多。與對照組比較，糖尿病腎病組大鼠自噬標志性蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著降低，p-AMPK/AMPK 比值降低，p-mTOR/mTOR 比值升高（P＜0.01）。與糖尿病腎病組比較，溫補固腎方高劑量組大鼠自噬標志性蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高，p-AMPK/AMPK 比值升高，p-mTOR/mTOR 比值降低（P＜0.01）。與溫補固腎方高劑量組比較，溫補固腎方高劑量組 + AMPK 抑制劑組大鼠自噬標志性蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著降低，p-AMPK/AMPK 比值降低，p-mTOR/mTOR 比值升高（P＜0.01）。見圖5和圖6。

圖5 AMPK抑制劑對糖尿病腎病大鼠腎組織病理形態及纖維化的影響

圖6 AMPK抑制劑對AMPK/mTOR通路介導的細胞自噬的影響

3 討論

糖尿病腎病屬于“腎濁”“水腫”“關格”“腎勞”“溺毒”等范疇，以水液潴留、腎虛陰陽失衡為主要特征，陽氣虛衰為糖尿病腎病的主要征象，尤其以腎陽虛為主，另伴有瘀血內阻之象。因此，中醫臨床治療糖尿病腎病多以補腎、溫陽、固腎為主。溫補固腎方具有補氣健脾、溫陽、補腎之功［4］。本課題組前期研究發現，溫補固腎方能夠改善糖尿病腎病腎損傷，抑制腎纖維化［5］。本實驗研究發現，與對照組比較，糖尿病腎病組大鼠腎功能出現明顯病理損傷，α-SMA 表達增加，ECadherin 表達降低，腎組織纖維化程度明顯加重。與糖尿病腎病組比較，溫補固腎方各劑量組大鼠FBG、BUN、Scr、24 h-UA 水平顯著降低，腎損傷明顯降低，α-SMA表達降低，E-Cadherin表達增加，表明溫補固腎方具有抗糖尿病腎纖維化作用。但是，目前有關溫補固腎方抗纖維化的作用機制尚不明晰。

自噬是一種高度保守的溶酶體降解途徑，是維持細胞內穩態的重要調節機制。既往研究發現，糖尿病腎病中持續性的高糖能夠抑制自噬相關蛋白（LC3、Beclin-1）表達，降低自噬水平，阻礙細胞器中積累產生的受損蛋白以及細胞毒性產物的清除，從而導致糖尿病腎病腎損傷以及腎實質細胞功能障礙［9-10］。激活細胞自噬可以顯著抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷，改善細胞功能［11］。以上研究表明，自噬水平的不足可能是導致糖尿病腎病進展的重要機制。GUO 等［12］研究發現，在STZ 誘導的糖尿病腎病大鼠腎小管間質纖維化中，伴有明顯的自噬抑制，提示自噬可能是糖尿病腎纖維化的重要調節機制。另外，CAO 等［13］研究證實，激活細胞自噬能夠抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞間質轉化以及糖尿病腎病大鼠腎小管間質纖維化。本研究結果顯示，與對照組比較，糖尿病腎病組大鼠自噬小體數量明顯減少，且自噬標志性蛋白LC3-Ⅱ表達顯著降低。與糖尿病腎病組比較，溫補固腎方各劑量組大鼠自噬小體數量均顯著增加，且自噬標志性蛋白LC3-Ⅱ表達顯著升高，表明溫補固腎方可以通過誘導細胞自噬，抑制糖尿病大鼠腎纖維化。細胞自噬受到多種誘因和基因調控的影響，如mTOR、AMPK 以及沉默信息調節劑T1等，以上信號通路與糖尿病腎病的發生、發展密切相關。高糖環境下上述信號通路的激活/抑制是誘導/抑制自噬活性的關鍵，能夠加重/緩解糖尿病腎損傷加重［14-16］。AMPK 和mTOR 是自噬啟動環節重要的調節因子，其構成的AMPK/mTOR 信號通路是調控細胞自噬形成的重要通路之一［17］。研究發現，mTOR 可以形成兩種不同的復合物，即mTORC1 和mTORC2。在糖尿病腎病大鼠中能夠觀察到mTORC1信號通路被顯著激活。在營養豐富的條件下，mTORC1能夠通過磷酸化ULK1和ATG13，從而抑制細胞自噬，被認為是自噬的負調節劑［18］。與mTOR 通路相反，AMPK 是自噬的正調節劑。研究發現，在糖尿病腎病動物模型中AMPK 磷酸化水平被顯著抑制。另外，AMPK 能夠抑制mTOR 通路的活化，降低mTORC1對ULK1 磷酸化的抑制作用，提高ULK1 活性，從而促進自噬啟動環節［19］。本研究結果顯示，與對照組比較，糖尿病腎病組大鼠p-AMPK/AMPK 比值顯著降低，p-mTOR/mTOR 比值顯著升高。與糖尿病腎病組比較，溫補固腎方各劑量組大鼠p-AMPK/AMPK 比值顯著升高，p-mTOR/mTOR 比值顯著降低。以上研究結果初步表明，溫補固腎方能夠通過調控AMPK/mTOR信號通路介導的細胞自噬抑制糖尿病大鼠腎纖維化。張哲等［20］研究發現，利拉魯肽能夠通過激活AMPK/mTOR 信號通路，增加自噬水平，從而減輕糖尿病心肌病大鼠心肌炎癥和氧化應激損傷，而給予AMPK 抑制劑Compound C 可以逆轉利拉魯肽對AMPK/mTOR 通路的作用，抑制自噬，加重糖尿病心肌病心肌炎癥和氧化應激損傷。為進一步明確AMPK/mTOR 信號通路介導的細胞自噬在溫補固腎方治療糖尿病腎纖維化中的作用。本實驗通過對溫補固腎方干預組大鼠給予AMPK 抑制劑Compound C。結果顯示，AMPK 抑制劑能夠逆轉溫補固腎方對糖尿病腎纖維化的作用，主要表現為p-AMPK/AMPK 比值降低，p-mTOR/mTOR 比值升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，膠原沉積及腎損傷加重。

4 結論

溫補固腎方能夠激活AMPK/mTOR 通路介導的自噬改善糖尿病大鼠腎纖維化。本研究結果初步闡明了溫補固腎方治療糖尿病腎纖維化的作用及調控機制，為其治療糖尿病腎纖維化提供了可靠的實驗依據。