血滿草多糖介導巨噬細胞M1型極化抑制肺癌的作用機制研究

袁雷，胡亞東

（1.西藏農牧學院，西藏特色農牧資源省部共建協同創新中心，西藏自治區 林芝 860000；2.中國科學院成都生物研究所，四川 成都 610041）

腫瘤防治是一個全球性難題，2013年《Science》雜志將腫瘤的免疫治療評為當年十大科技進展之首，2018年抑制免疫負向調控用于腫瘤治療的研究被授予諾貝爾生理學與醫學獎，從而使腫瘤免疫治療成為時代主流。與傳統的直接靶向腫瘤細胞的治療方法不同，通過激活宿主的免疫系統從而達到消除腫瘤是腫瘤免疫療法的主要作用機制［1］。

重塑腫瘤相關巨噬細胞（TAM）是癌癥免疫治療的有效策略［2-3］。TAM 是腫瘤微環境（TME）的重要組成部分之一，占腫瘤體積的50%，可分為兩種亞型，即典型激活的巨噬細胞（M1）和交替激活的巨噬細胞（M2）。簡單地說，M1 亞型具有強大的抗原呈遞能力，可以促進Th1 免疫以殺死腫瘤細胞。然而，TME 中的大多數TAM 傾向于分化為M2 表型。M2 巨噬細胞可誘導組織修復和血管生成的Th2 型免疫，從而促進腫瘤生長和轉移［3-4］。因此，將TAM 極化為M1 亞型的免疫調節劑是近年來研究的熱點。

多糖的免疫調節作用是其最重要的生物活性之一，靈芝多糖［5］、紅花多糖［6］、紫錐菊多糖［7］、蛹蟲草多糖［8］等均可通過調控巨噬細胞極化抑制腫瘤的發生發展。血滿草（Sambucus adnata）為我國民間常用藥，也是藏藥的藥源植物之一，其味辛、澀、性溫，具有祛風、利水、活血、通絡的功效，主治急慢性腎炎、風濕疼痛等癥［9］。前期研究中，本課題組詳細解析了血滿草多糖（Sambucus adnatepolysaccharide，SPS-1）的結構特征，并發現SPS-1 與TLR2 受體結合并通過MAPKs 和NF-κB 信號通路激活RAW 264.7 細胞的免疫活性［10］。本研究在前期研究基礎上通過探討SPS-1 對巨噬細胞極化的影響及在共培養條件下對Lewis 細胞的抑制作用研究，以期為深入開展血滿草多糖SPS-1的抗腫瘤作用及實際應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 細胞株

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 和小鼠肺癌細胞Lewis由武漢普諾賽生命科技有限公司提供。

1.1.2 實驗藥物

血滿草多糖SPS-1 為本課題組自制，糖含量94.76%。

1.1.3 主要試劑

DMEM 高糖細胞培養基、青霉素/鏈霉素雙抗和胎牛血清（美國Gibco公司）；白細胞介素-4（IL-4，美國PeproTech 公司）；Trizol（美國Ambion 公司）；小鼠單抗β-肌動蛋白（β-actin）、辣根過氧化物酶/HRP標記羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；兔多抗巨噬細胞甘露糖受體（CD206）、E-鈣黏蛋白（ECadherin）、N-鈣黏蛋白（N-Cadherin）和波形纖維蛋白（Vimentin）（武漢三鷹生物技術有限公司）；兔多抗磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDHF，杭州賢至生物有限公司）；兔單抗B 淋巴細胞瘤-2 蛋白（Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bax）（美國Abcam 公司）；A 型血管表皮生長因子（VEGF-A）、缺氧誘導因子-1（HIF-1α）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；兔多抗白細胞分化抗原（CD86）、反轉錄試劑盒、SYBR Green（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；引物合成（北京擎科生物科技有限公司）；其他試劑均為分析純或色譜純。

1.1.4 主要儀器

電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司，型號：CPA225D）；酶標儀（美國Thermo 公司，型號：mμlISKANMK3）；熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司，型號：QuantStudio 6）；CO2恒溫培養箱（日本SANYO 公司，型號：MCO-15AC）；流式細胞儀（美國Beckman coulter 公司，型號：cytoFLEX）；離心機（美國Eppendorf公司，型號：5702R）。

1.2 細胞培養

將液氮保存的RAW264.7 細胞和Lewis 細胞于37 ℃水浴中溶解凍存液；并將細胞轉移至含有5 mL培養基的離心管中，常溫條件下1 000 r/min離心5 min收集細胞；用高糖DMEM 培養基（含10%胎牛血清）懸浮細胞，接種至培養皿，37 ℃、5% CO2條件下培養。后續實驗選擇對數生長期細胞。

1.3 巨噬細胞極化分析

將RAW264.7細胞接種于6孔板中，加入20 ng/mL的IL-4 培養24 h，收集細胞并用PBS 清洗2 次，得到M2 型巨噬細胞。隨機分為M0 組（對照組）、M2 組（M2極化組）、M21 組（M2 極化組 + 200 μg/mL SPS-1）、M22 組（M2 極化組+ 400 μg/mL SPS-1）和M23 組（M2 極化組 + 800 μg/mL SPS-1），給予相應藥物處理24 h。

1.3.1 表面標志物的檢測

采用Western blot 技術分析不同極化狀態RAW264.7 細胞的表面標志物（CD206 和CD86）。各組培養24 h后用胰蛋白酶消化并收集細胞，RIPA 裂解液將細胞裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清測定蛋白質濃度。樣品經SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉1 h 后，一抗孵育過夜，TBST 洗滌5 次，孵育二抗，用ECL 試劑盒進行顯影，成像系統顯像并采用BandScan 軟件分析條帶灰度值，重復3 次。一抗包括抗CD206（1∶500）、抗CD86（1∶1 000）和抗β-actin（1∶500），二抗包括山羊抗兔/小鼠IgG-HRP。以目的蛋白條帶與內參β-actin 蛋白條帶的灰度值之比表示目的蛋白的相對表達水平。

1.3.2 TNF-α、iNOS、IL-10、TGF-β 和Arg-1 基因表達水平

各組培養24 h后去除培養基，按照Trizol法提取總RNA，檢測純度后，根據逆轉錄試劑盒操作說明逆轉錄合成cDNA，進行RT-qPCR 反應。根據GenBank 中基因序列設計PCR 引物，檢測TNF-α、iNOS、IL-10、TGF-β 和Arg-1 基因的表達水平，以β-actin 為內參。PCR擴增條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s；60 ℃退火60 s，共40 個循環。每組設置3 個復孔，以2-△△Ct值表示目的基因的相對表達水平。RT-qPCR引物信息見表1。

表1 RT-qPCR各目的基因引物序列

1.4 對細胞遷移、侵襲及凋亡的影響

1.4.1 細胞遷移和侵襲試驗

將處于對數生長期的RAW264.7細胞以3×105個/孔移植于無血清DMEM的6孔板中，根據分組加入不同試劑（終濃度800 μg/mL 的SPS-1 或/和終濃度20 ng/mL的IL-4），培養24 h 后收集上清，得到條件培養基（Conditioned medium，CM），備用。

實驗分組：Control 組（Lewis 細胞）、CM0 組（SPS-1 + Lewis 細胞）、CM1 組（RAW264.7 + IL-4 的條件培養基 + Lewis細胞）、CM2組（RAW264.7 + SPS-1的條件培養基 + Lewis細胞）和CM3組（RAW264.7 + IL-4 +SPS-1 的條件培養基 + Lewis 細胞），處理24 h 后收集細胞開展遷移和侵襲試驗。體外細胞的侵襲和遷移實驗用24孔板Transwell小室進行檢測。侵襲實驗，在小室的上層鋪100 μg 的基質膠。遷移實驗不鋪基質膠。并于Transwell 小室上室加入3×105個/mL 的Lewis 細胞200 μL，培養24 h 后吸棄培養液，小心擦掉小室上層沒有發生侵襲或遷移的細胞，PBS 沖洗2 次后，10%甲醇固定30 min，5%結晶紫染色20 min 后進行拍照計數。

1.4.2 HIF-1α和VEGF-A的測定

將Lewis細胞按106個/mL接種于96孔細胞培養板中，加入不同培養基培養24 h，收集上清液，采用ELISA法檢測HIF-1α和VEGF-A含量。

1.4.3 流式細胞術檢測腫瘤細胞凋亡

實驗分組同“1.4.1”，培養24 h 后收集6 孔板中Lewis 細胞，使用AnnexinV-APC/7-AAD 細胞凋亡檢測試劑盒檢測Lewis細胞凋亡。

1.4.4 免疫印跡試驗

采用Western blot 技術檢測腫瘤細胞轉移和凋亡相關蛋白E-Cadherin（1∶5 000）、N-Cadherin（1∶2 000）、Vimentin（1∶2 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶2 000）的表達水平，方法同“1.3.1”項，以目的蛋白條帶與內參GAPDH（1∶1 000）蛋白條帶的灰度值之比表示目的蛋白的相對表達水平。

1.5 統計學方法

實驗重復3 次，實驗結果采用均值±標準差（±s）表示。實驗數據采用IBM SPSS 19.0進行統計分析，不同組間數據采用單因素方差分析（One-way ANOVA），并使用Origin 8.1 軟件進行繪圖。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 SPS-1 誘導RAW264.7 細胞由M2 表型向M1 表型極化

20 ng/mL IL-4 處理RAW264.7 細胞可增加膜表面分子CD206 和減少CD86 的表達，這表明形成了極化的M2 型巨噬細胞。在SPS-1 處理后，CD86/CD206 以劑量依賴性方式顯著增加，SPS-1 濃度為400、800 μg/mL 時，CD86/CD206 比值較M2 組具有極顯著差異（P＜0.01）。結果見圖1。與M1 表型相關的炎癥因子TNF-α mRNA 的表達量升高，特異性M1 指標iNOS mRNA 的表達量也顯著上調；與之相反，IL-10、TGF-β mRNA 及特異性M2 指標Arg-1 mRNA 的表達量則顯著下調，與M2 組相比，差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），見表2。綜上，SPS-1 可誘導RAW264.7 細胞由M2 表型向M1 表型極化。

圖1 SPS-1對RAW264.7細胞膜表面CD206和CD86蛋白表達的影響

表2 各組對RAW264.7巨噬細胞極化相關基因mRNA相對表達量的比較（±s）

表2 各組對RAW264.7巨噬細胞極化相關基因mRNA相對表達量的比較（±s）

注：與M0組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與M2組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別M0組M2組M21組M22組M23組Arg-1 0.94±0.08 3.29±0.21**2.64±0.16**2.07±0.14**△△1.58±0.18△△TNF-α 1.03±0.12 0.39±0.06*0.84±0.06△△1.16±0.16△1.84±0.14*△△iNOS 1.02±0.15 0.49±0.04 0.89±0.08△1.30±0.13△1.91±0.04*△△IL-10 1.05±0.13 1.43±0.12 1.24±0.05 1.01±0.06 0.81±0.04△TGF-β 1.01±0.11 2.52±0.17**2.05±0.11**1.65±0.11*△1.38±0.13△△

2.2 SPS-1 調控M1/M2 巨噬細胞極化抑制Lewis 細胞的遷移與凋亡

SPS-1 調控M1/M2 巨噬細胞極化抑制Lewis 細胞的遷移與凋亡的實驗結果見表3 和圖2。共培養條件下，與對照組相比，CM0、CM2、CM3 組均可不同程度地降低Lewis細胞的遷移能力，與CM1組相比，CM0、CM2組均可極顯著降低Lewis 細胞的遷移（P＜0.01），CM3組也可顯著或極顯著的降低Lewis 細胞的遷移能力（P＜0.05，P＜0.01）。ELISA 和Western blot 實驗結果顯示，CM0、CM2、CM3 組均可顯著或極顯著的降低HIF-1α和VEGF的分泌及N-Cadherin和Vimentin的表達，而E-Cadherin 表達則極顯著增加（P＜0.01）。以上結果表明SPS-1 可通過誘導RAW264.7 細胞極化為M1 亞型抑制Lewis 細胞的遷移能力。流式細胞儀檢測Lewis 細胞凋亡，與對照組和CM1 組相比，CM0、CM2、CM3 組共培養體系中，Lewis 細胞凋亡率明顯增加（P＜0.01）。進一步通過Western blot實驗檢測Lewis 細胞中凋亡相關蛋白Bcl-2 和Bax 的表達水平，結果顯示經SPS-1 處理，可顯著降低Lewis 細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達及提高促凋亡蛋白Bax 的表達，以上結果表明，SPS-1 可誘導RAW264.7 細胞極化促進Lewis細胞的凋亡。

圖2 共培養條件下SPS-1對Lewis細胞轉移及凋亡相關蛋白表達的影響

表3 各組對Lewis細胞的抑制作用比較（±s）

表3 各組對Lewis細胞的抑制作用比較（±s）

注：與Control組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與CM1組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別Control組CM0組CM1組CM2組CM3組凋亡指數4.13±0.12△△24.10±0.67**△△3.19±0.10**39.36±1.07**△△19.38±1.17**△△遷移率/%100.00±3.03 62.12±4.01**△△128.28±7.63 40.40±1.75**△△85.35±3.15*△侵襲率/%100.00±2.29△△55.00±2.29**△△121.50±3.97*35.00±1.73**△△90.00±2.60*△△HIF-1α/（pg/mL）575.20±43.75△△287.03±18.96*△△868.79±35.87**186.19±11.58*△△477.54±34.59△△VEGF/（pg/mL）229.96±25.66△△112.78±11.94*△333.59±30.52 62.58±6.79*△188.57±20.51△

3 討論

非小細胞肺癌（NSCLC）是肺癌的主要類型，約占肺癌的85%～90%［11］。目前免疫治療、靶向治療等新的治療方法已引入到NSCLC 治療中［12］。作為腫瘤組織中主要的免疫調節細胞，腫瘤相關巨噬細胞在腫瘤的免疫反應中發揮重要作用［13］。但是，巨噬細胞存在著高度異質，會在局部微環境刺激下從M0 階段極化到不同的亞型即M1和M2型，顯示完全相反的功能。

在腫瘤發生、發展過程中，腫瘤相關巨噬細胞的極化普遍存在，M1 型和M2 型巨噬細胞在表型、標記物、精氨酸代謝和對腫瘤的影響方面存在差異。M1 型巨噬細胞是典型激活的促炎性細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）的統稱，其細胞膜分子CD40、CD80 和CD86等表達增加［14］。M2 型巨噬細胞表現出更高的甘露糖受體（CD206）轉錄表達，并通過分泌抑制性細胞因子IL-10、TGF-β 等下調免疫應答，減少促炎細胞因子的產生［15］。它們也可以根據精氨酸代謝相互區分，其中M1 型巨噬細胞優先通過誘導型一氧化氮合酶（iNOS）將精氨酸代謝為NO，而M2 樣巨噬細胞優先通過精氨酸酶-1（Arg-1）將精氨酸代謝為鳥氨酸［16］。本研究發現血滿草多糖（SPS-1）能促進M1 型巨噬細胞極化，上調其特征標記CD86、下調清道夫受體CD206 表達。SPS-1 處理的RAW264.7 細胞具有濃度依賴的TNF-α、iNOS mRNA 水平升高及IL-10、TGF-β、Arg-1 mRNA 水平降低，可顯著誘導RAW264.7細胞由M2型向M1型極化。

抑制腫瘤的侵襲和遷移能力是藥物發揮抗癌作用的一個重要因素。血管的生成在腫瘤生長和轉移過程中發揮著重要的作用［17］，可以促進腫瘤細胞的快速生長，從而進一步加速實體腫瘤的發生、侵襲和轉移［18］。HIF-1α 通過活化上調P13K/Akt 信號通路在轉錄水平介導VEGF 蛋白表達。VEGF 是一種血管生成因子，參與許多生理和病理過程，其意義與促進腫瘤生長和轉移有關［19］。缺氧也會引發上皮-間質轉化（EMT），EMT 是原發性腫瘤轉移進展的重要生物學機制，它的主要變現是極性的上皮細胞轉換為活動能力強的間質細胞并獲得侵襲和遷移能力［20］。上皮標志物如ECadherin 等表達下調、間充質細胞標志物Vimentin 和N-Cadherin 表達的增加是EMT 表型改變的主要特征，這導致EMT過程的發生，導致轉移的起始［21-23］。本研究的Transwell 實驗結果表明，共培養條件下，SPS-1 通過調控RAW264.7 細胞極化顯著抑制Lewis 細胞的侵襲和遷移，并降低HIF-1α和VEGF的分泌及NCadherin 和Vimentin 的表達，同時顯著上調ECadherin 的表達，從而起到抑制Lewis 細胞轉移的作用。凋亡實驗結果顯示，SPS-1 亦可通過調控RAW264.7細胞極化顯著促進Lewis細胞的凋亡。

4 結論

SPS-1 可促進巨噬細胞M1 型極化并通過調控巨噬細胞極化抑制Lewis細胞的轉移及促進其凋亡。