YY1作用機制及在動物繁殖調控中的研究進展

邢文文,齊南南,李夢軒,劉吉英

(江蘇科技大學生物技術學院,鎮江 212018)

人類基因組約有 7% 的順式調控元件作為基因表達調節的開關[1]?；虻募せ罨蛞种剖琼樖秸{控元件上多個轉錄因子和輔因子協同作用的結果?，F已證實轉錄因子通過激活或抑制調控基因表達,在細胞增殖、分化、衰老和凋亡等功能調控中起到關鍵作用。YY1是進化保守的C2H2型鋅指蛋白,屬于GLI-Krüppel蛋白家族,最初由Shi等[2]、Seto等[3]、Park 和 Atchison[4]多個研究組同時克隆并描述。YY-1在中國古代哲學中代表陰陽或正負,反映了該蛋白質在基因調節中發揮的雙重功能,這取決于其與DNA的結合位點或細胞類型。YY1在動物體內廣泛表達,HiChIP結果表明[5],在哺乳動物細胞中,YY1通常占據增強子-啟動子相互作用的位點,偶爾也占據絕緣子相互作用的位點。且研究發現大約 10% 的哺乳動物基因受該轉錄因子調控[6-8],因此YY1對基因的調控具有重要意義。本文將綜述YY1的結構與功能、作用機制及其在動物繁殖調控過程中的研究進展,以期為深入挖掘該基因的功能及研究動物的繁殖調控機理提供理論參考。

1 YY1蛋白結構及特點

YY1是調控真核細胞生命活動的關鍵轉錄因子。YY1在某些無脊椎動物和所有脊椎動物廣泛表達且高度保守[9]。在人類基因組中,YY1位于人的 14 號染色體,包含 5 個外顯子,編碼 414 個氨基酸,預測分子量為 44 ku,然而,蛋白質在SDS凝膠上遷移為 65～68 ku,這可能與其空間結構有關。YY1基因表達的雙重調控功能由其特殊的結構(N端激活域與C端抑制域)來決定的。YY1的N端 1～100 氨基酸序列[10],包含一段由 11 個連續的酸性氨基酸殘基組成的區域、一段由 12 個不間斷的組氨酸殘基組成的區域(主要參與核定位)、一段富含甘氨酸和丙氨基酸的區域,一段富含脯氨酸和谷氨酰胺的區域[11]。YY1中心區域被證明參與轉錄抑制:176～200 氨基酸序列組成的HID結構域;201～225 氨基酸序列組成的REPO結構域,能夠招募PcG蛋白到DNA并且引起組蛋白H3賴氨酸 27 甲基化[12-13]。YY1的C端氨基酸序列為 298～414,由鋅指結構域與某些特殊結構域構成的4個C2H2型鋅指蛋白結構區域,C2H2型鋅指蛋白既在轉錄過程中調控基因的表達,也參與轉錄后的修飾過程,轉錄后的修飾過程能提高鋅指蛋白的抑制作用[14]。熱力學和動力學研究表明,雖然YY1的N端片段本身不與DNA結合,但它的存在影響YY1與NDA結合參數,進而影響YY1對靶基因的調控。YY1靶向的基因范圍廣泛,大約 10% 的哺乳動物基因受該轉錄因子調控,大多數YY1結合位點靠近轉錄起始位點,有時也出現在調控基因的遠端。它通常綁定到具有以下位點的DNA序列[15-16]:GGCGCCATnTT、CCGCCATnTT、CGCCATnTT、GG-CGCCATnTT、GCCATnTT、CnCCATnTT、GnC-GACATnTT、CCGCCATnTT、TACGCCATtTTG、CGCCATCTT、CGCCATTTT和GCCATnTT(n表示任意堿基)。最新研究表明YY1可以與單鏈RNA結合,但具有低序列特異性[17]。

2 轉錄因子YY1的作用機制

通過分析總結YY1的結構和功能得知,YY1調控基因表達的方式主要有:1)YY1作為傳統轉錄因子調控基因表達;2)YY1通過調控染色質結構影響基因表達;3)YY1通過相分離機制調控基因的表達。

2.1 YY1作為傳統轉錄因子調控基因表達

2.1.1 YY1直接與基因啟動子區結合調控基因表達 首先,YY1作為一種傳統的DNA結合轉錄因子調控基因的表達,YY1能夠直接與啟動子結合抑制或者激活下游基因表達。例如,YY1與TGF-β1啟動子結合能有效抑制TGF-β1的表達[18]。YY1可以直接與Xist(X-inactive-specific transcript,Xist)基因的5′調控區結合,激活Xist的轉錄,導致染色體失活,但YY1僅與未甲基化的Xist等位基因結合[19]。乳腺癌細胞中,YY1可與FAM111B基因啟動子結合,增強其轉錄活性,加速了乳腺癌的進展[20]。胰腺β細胞中,YY1結合到Ins1和Ins2外顯子 2 的增強子區域,激活胰島素轉錄,進而調控葡萄糖穩態[21]?？关i流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染過程中,YY1與MUC2啟動子的結合[22]促進MUC2的表達,降低仔豬對PEDV的易感性,但該位點的調控作用受甲基化影響。YY1可以直接結合在PTX3基因的啟動子區,還可以與PRMT1關聯一起募集到PTX3啟動子上[23]。Nhlh2參與卵泡發育等繁殖活動,而YY1可以直接結合到該基因的啟動子上調控Nhlh2的表達[24]。截止目前,對YY1功能的研究多集中在其對DNA的直接調控上,但通常情況下YY1不是單獨起作用的,YY1通常與其他的輔助因子共同發揮作用。

2.1.2 YY1與其他輔助因子結合后共同調控基因表達 除了直接與啟動子結合外,YY1能夠與其他輔助因子結合共同調控基因表達。在小鼠神經元中,YY1及其相互作用蛋白Brd4激活了谷氨酸信號的上游調節因子Senp1,在神經元可塑性中起著關鍵作用[25]。另外,YY1能夠破壞p53和輔激活因子p300之間的相互作用,阻斷p300依賴的乙酰化且降低p53的穩定[26]。不僅如此,YY1可與p53直接物理相互作用,而槲皮素能夠直接與p53競爭結合YY1,降低YY1與p53蛋白對接能量進而發揮抗癌作用[27]。功能試驗表明,circ-RCCD調控心臟搏動細胞簇的形成,主要通過將YY1招募到MyD88的啟動子上來抑制MyD88的水平,促進心肌細胞分化[28]。QKI是一種可在上皮-間質轉化過程中調節環狀RNA形成的剪接因子,與肝細胞癌發生密切相關,YY1通過與p65和p300形成復合物增強QKI的轉錄和翻譯,是治療肝癌的潛在靶點[29]。在HepG2細胞中,RBM25是YY1高效靶向全基因組所必需的,YY1和RBM25之間存在廣泛的共結合,RBM25首先與靶基因啟動子相互作用,然后將YY1招募到這些啟動子上,共同調控基因的轉錄[30]。

2.1.3 YY1的轉錄后修飾對基因表達調控的影響 YY1的生物學功能受其翻譯后修飾的調控,如乙?；⒎核鼗土姿峄?。首先,YY1的轉錄活性可以通過乙?；蛉ヒ阴；瘉碚{控。蛋白質賴氨酸乙?；钦{節蛋白質結構和功能的翻譯后修飾,GCN5在YY1的兩個殘基(K392和K393)上乙酰化,破壞了YY1鋅指和DNA之間的相互作用維持結構蛋白的表達,從而正向調節肌肉完整性[31]。另外,YY1蛋白可以在兩個區域被p300或PCAF乙酰化。在體外,YY1的C端結構域的乙?；档土薉NA結合能力,而中心結構域的乙酰化是YY1作為完全阻滯劑所必需的[32]。在小鼠前神經外胚層發育過程中,Otx2激活需要YY1的乙?；痆33]。E3連接酶Smurf2可以泛素化YY1,抑制其下游基因VEGFA和Snail1表達[34]。另外,JWA是一種有效的環境反應基因,具有促凋亡作用。三陰性乳腺癌中JAC1引起YY1泛素化激活JWA,解除YY1對JWA的抑制[35]。磷酸化使蛋白結構發生變化引起蛋白質活性的改變,CK2α催化YY1第118位絲氨酸磷酸化干擾了Caspase 7對其的切割,促進癌細胞存活。YY1是Src家族激酶介導酪氨酸磷酸化的一個靶點,研究表明YY1第383位酪氨酸磷酸化影響它結合DNA和RNA的能力[36],但對于負責YY1去磷酸化的特定酪氨酸磷酸酶,以及體內酪氨酸磷酸化YY1的定位和動態變化需要進一步研究。

2.2 YY1通過調控染色質結構影響基因表達

大量的證據表明,染色質結構在基因調控中起到重要作用,但對于基因啟動子和增強子之間互相作用的調控蛋白了解很少。基因及其調控元件的大DNA環的形成需要CTCF-CTCF相互作用,但大多數情況下這種結構蛋白并不參與啟動子和增強子之間的相互作用。通過研究發現,YY1在所有被檢測的細胞中普遍表達,且占據增強子和啟動子位置,YY1的二聚化促進DNA環的形成[37],推測YY1介導的增強子-啟動子相互作用可能是哺乳動物基因調控的一般特征。YY1在不同類型的細胞中通常占據活躍的增強子和啟動子,擾動YY1結合會破壞增強子-啟動子環[37]。同樣,敲低神經祖細胞中的YY1后,許多3D結構被破壞,這表明YY1可能是一種連接基因啟動子和增強子的結構蛋白[38]。作為增強子和啟動子的連接蛋白,YY1與其招募的共激活因子和增強子元件共同作用,增強子-啟動子相互作用穩定,激活下游靶基因的轉錄。例如:YY1與許多轉錄輔激活因子相互作用,如EP300、BRD4、MED1等,并在穩定增強子-啟動子環中發揮關鍵作用。分析YY1序列時,發現其TAD結構域(topologically associating domain,TAD)具有較高的結構紊亂傾向,它的大多數結合位點都靠近轉錄起始位點,只有少數位點位于調控基因的遠端[39-41]。然而,在YY1-單倍缺陷淋巴母細胞系中,差異表達最多的基因是由YY1遠端結合位點控制的[39]。為了進一步揭示YY1影響增強子-啟動子互作的機制,研究發現DNA的鳥嘌呤四聯體的結構(G4)是YY1促進增強子與啟動子之間環形成的具體結合位置[42],同時也表明YY1除了結合雙鏈DNA的共識序列外,還能夠直接與G4直接結合對基因表達調控起作用。

2.3 YY1通過相分離機制調控基因的表達

液-液相分離是指溶液相的組分由于溶解度的差異而分離,自 2009 年Brangwynne等[43]通過P顆粒液體的性質證明了液-液相分離的存在,已有研究表明相分離現象在細胞中普遍存在,是研究活細胞基因調控的新方法。越來越多的研究發現,相分離與基因的轉錄調控密切相關[44-46]。轉錄控制可能是由相分離進行驅動的[47],共激活蛋白MED1和BRD4在超增強子處發生相分離形成液滴樣物質[45],胚胎干細胞多能性轉錄因子OCT4、雌激素受體(estrogen receptor,ER)和酵母轉錄因子GCN4與Mediator形成相分離的液滴樣凝聚物,并且需要相同的氨基酸或配體來激活相分離。Boija等[44]認為,內在無序區域介導的相分離與輔激活劑是轉錄因子活化結構域激活基因的一種機制。大量研究一致表明,YY1參與形成增強子或超級增強子,調節生物過程多種基因的表達,然而,YY1如何招募、協調共激活因子和染色質增強子元件,組裝增強子簇或超級增強子的調控機制還不清楚。目前,試驗數據表明了YY1在體外和細胞內進行液-液相分離的能力[48]。YY1已被報道通過促進增強子活性來調節基因表達,而相分離是增強子機制的一個特征[49],YY1蛋白在細胞內形成液-液凝聚物,YY1的組氨酸簇對于其產生相分離和維持細胞招募Pol II轉錄復合體非常重要,將H3K9me3隔離在凝聚物外,增強FOXM1轉錄[50]。生化試驗表明,轉錄因子Twist1和YY1以相分離的形式形成轉錄復合體。Twist1-YY1-p300形成核相分離凝聚體,當Twist1和YY1蛋白共存時,輔激活劑p300刺激轉錄因子Twist1和YY1的相分離液滴物質在細胞內形成Twist1/YY1/p300復合物,可在miR-9超級增強子上形成相分離的凝聚體[51],發揮轉錄激活功能。這種類型的結合調節miR-9的表達,從而增加細胞遷移和擴散,促進HCC中的EMT。目前關于YY1相分離的研究不多,相信隨著科研的不斷進步,將深入探討YY1如何通過相分離調控轉錄,為研究發育和疾病過程中基因表達調控機制提供新思路。

總結前人研究,可以將YY1作用機制概括如圖1所示:1)YY1作為傳統的轉錄因子直接結合在基因啟動子區,或者通過招募其他輔因子結合到靶基因啟動子區共同調控基因的表達,或者通過調控YY1轉錄后修飾改變YY1的表達進而對下游基因進行調控;2)YY1作為啟動子-增強子重要的結構物質,維持啟動子-增強子環,G4是其與DNA結合的具體位點;3)YY1通過轉錄復合物與超級增強子形成液滴凝聚物,以相分離的形式調控下游基因的表達。

A. 激活因子;R. 抑制因子A. Activation factor; R. Inhibitory factor圖1 YY1調控基因表達的作用機制[37,42,50]Fig.1 The mechanism of YY1 regulating gene expression[37,42,50]

3 YY1在動物繁殖方面的研究進展

在哺乳動物中,隨著研究的不斷深入,無論是卵巢發育與精子生成,還是胚胎發育,亦或生殖激素及受體表達的調控,YY1在其中都扮演著至關重要的角色。

3.1 YY1對卵巢發育的影響

信號分子和轉錄調節因子是卵泡發生、成熟和排卵期不可缺乏的,YY1作為一種重要的轉錄因子,在調節卵泡發育過程中起著重要的作用。2011年,Griffith等[52]通過構建卵母細胞YY1(CKO-YY1)特異性敲除小鼠,發現YY1是卵母細胞成熟和顆粒細胞擴張及卵母細胞-顆粒細胞通信所必需的。此外,有團隊研究發現YY1基因在恒河猴的卵母細胞及胚胎發育過程中表達豐富,揭示其可能調控相關重要基因的轉錄[53]。雞的全基因組關聯分析顯示YY1處于與排卵數性狀的顯著相關的候選區域[54],但其與雞產蛋數之間的關系需要進一步探究。近期研究發現,基質細胞源性因子-l(stromal cell-derived factor-l,SDF1)處理增加了YY1和TET1的mRNA和蛋白質水平,對卵母細胞質量至關重要,可能增強成熟卵母細胞支持后續胚胎發育的能力[55]。然而,敲低多囊卵巢綜合征小鼠卵巢顆粒細胞YY1促進細胞增殖,抑制細胞凋亡[56]。盛中偉等[57]發現,12～13周齡文昌母雞的卵巢迅速發育是其性成熟啟動時期,而qRT-PCR檢測結果表明YY1此時在下丘腦組織中的表達水降低,提示YY1可能參與了下丘腦性腺軸對雞性成熟啟動的調節。高婷等[58]研究發現,六味地黃丸能夠治療小鼠卵巢儲備功能減退,而YY1是六味地黃丸發揮作用的潛在靶點。以上研究表明,YY1在卵巢發育過程中的功能比較復雜,可能與細胞的狀態和類型相關,這些研究發現有利于擴展研究者對卵巢發育分子機制的理解。

3.2 YY1對精子發生的影響

YY1不僅參與雌性動物卵巢發育調控,還在雄性性腺的發育和精子發生中起著關鍵作用。研究發現,小鼠雄性性腺的發育過程中,YY1也扮演著重要的角色。YY1在精子發生的不同階段表達量不同,這取決于生精小管的發育階段。Kim等[59]在2016年的研究中發現,YY1強烈定位于精原干細胞,YY1與CP2c共定位促進精子發生,同時發現YY1對精原干細胞的干性至關重要,但在成熟的精子中不表達。利用RNAi技術敲除小鼠睪丸中的YY1基因,引起DNA修復缺陷造成精母細胞單倍染色體形成,非整倍體增加,粗線期細胞死亡,說明YY1在小鼠精子減數分裂過程中起重要作用[60]。同樣,有研究發現在雞胚睪丸中,YY1在精原細胞和支持細胞中表達,而在成年雞睪丸中,YY1在生精細胞和支持細胞中表達[61],而在精子中不表達,這與小鼠中的研究結果一致。由此可見,YY1可能通過影響雞睪丸中支持細胞內的細胞因子來調控雞性腺的發育和功能,進而影響精精子的發生。

3.3 YY1對胚胎發育的調控

胚胎發育過程中,YY1在除1細胞胚胎外的所有組織中均表達,但主要定位在 2 細胞胚胎的細胞質及4 細胞、 8 細胞、桑葚胚和囊胚期胚胎的細胞核[62],推測YY1對胚胎的調控可能從 4 細胞開始。YY1缺失并不影響OCT4和SOX2 mRNA的表達[62],但會影響兩者的共定位, 推測乙酰化的YY1可能特異性調節OCT4/SOX2復合物形成,但具體機制未知。在小鼠胚胎干細胞中,YY1和OCT4具有協同作用,同時YY1與BAF復合物相互作用促進小鼠胚胎干細胞增殖[63]。Donohoe等[64]通過構建YY1敲除小鼠模型試驗研究發現,缺乏YY1的胚胎植入子宮后未能發育到原腸胚期,導致胚胎在植入時死亡,說明了YY1在小鼠胚胎發育中的關鍵作用。PHLDA2(印跡基因)會影響山羊胎盤發育,而YY1和CpG甲基化均會抑制PHLDA2的表達,YY1更傾向與CpG-甲基化序列相結合來抑制PHLDA2的表達,進而對胎盤發育進行調節[65]。Rhee等[66]研究發現,雖然YY1不是胚胎內胚層衍生器官形成所必需的,但YY1在內胚層中是鄰近中胚層血管生成所必需的,且YY1對小鼠胚胎血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGFA)的產生和卵黃囊的發育都具有重要的作用。YY1直接結合lncRNAXist啟動子,促進Xist在圍產期小鼠卵巢中的表達[67],但siRNA介導的YY1表達下調可以抑制Xist的表達,上調X連鎖基因的表達,提高克隆豬胚胎的發育效率[68]。除此之外,YY1還與胚胎的DNA甲基化有關,水牛植入前胚胎注射YY1過表達載體不會影響囊胚發育率,但會提高DNA甲基化水平[69]。PGC7主要在卵母細胞中表達,PGC7和YY1相互作用能夠抑制YY1對PRC2的募集,促進AKT與EZH2相互作用,減弱YY1與EZH2的相互作用,從而降低H3K27me3水平。在受精卵中,PGC7缺乏和AKT抑制劑均會促進EZH2進入原核,增加原核中H3K27me3的水平,抑制H3K27me3調控的合子激活基因的表達,最終影響兩細胞胚胎的早期發育[70]。因此,YY1在胚胎發育過程中起重要的調控作用,但是YY1是如何調控胚胎發育生物學過程的,仍需要深入探究。

3.4 YY1調控生殖激素及其受體的表達

YY1除了調控卵巢發育、精子發生和胚胎發育以外,還參與生殖激素的調控。芳香化酶(CYP19)是雌二醇合成的關鍵酶,大鼠CYP19啟動子中含有YY1應答元件[71],但YY1的下調顯著促進了多囊氏綜合征小鼠卵巢顆粒細胞中雌激素的產生[56]。促卵泡激素受體(follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)在卵巢顆粒細胞中特異性表達,并連接配體FSH和細胞內信號分子,如PKA和AKT,以調節雌性哺乳動物的卵泡發育和不孕癥。FSHR已被確定為決定豬排卵率和多態性的主要候選基因,轉錄因子YY1通過與湖羊FSHR啟動子的核心啟動子結合而影響其轉錄活性,但不參與核心啟動子內突變位點對轉錄活性的調控[72]。Ai等[73]證實,YY1能夠直接結合在膽固醇調節元件結合蛋白(sterol regulatory element binding protein,SREBP)啟動子上。研究發現YY1-AR相互作用對YY1介導的AR轉錄活性至關重要,YY1是與雄激素反應元件結合復合物的必要組成部分[74-75]。ChIP、qPCR和YY1敲低/過表達試驗表明,YY1在睪丸間質細胞中作為轉錄激活因子直接調節類固醇激素生成的關鍵基因StAR和3β-HSD的表達,最終協同調控睪酮的產生[76],但YY1有時可以作為類固醇生成基因的轉錄抑制因子,具體原因尚未揭示。

以上研究表明,YY1在動物繁殖調控中起到關鍵作用,但相關研究尚處于起步階段,需開展相關研究進行深入探索。

4 結語與展望

截止目前YY1蛋白結構基本明確,且在多個物種中高度保守,它通常綁定到保守的DNA結合序列上,但有新的研究發現YY1還可以結合到DNA的G4結構上影響啟動子-增強子的結構。同樣,不同物種中YY1的結合位點是否相同尚無定論。除了與DNA結合以外,有研究揭示YY1可以與單鏈RNA結合,但其結合序列的特異性不高,YY1與單鏈RNA結合位點的特征及功能目前還不清楚,因此YY1的作用機制要復雜的多。

對于YY1作用機制的研究多集中在傳統的轉錄因子作用機理上,YY1既可以促進基因的表達也可以抑制基因的表達,因此,對于YY1作用機制的研究重點在于要確定YY1對基因表達的調控是正向的還是反向的。另外,一般YY1的靶基因啟動子區含有多個結合位點,那么YY1和這些位點結合對于基因的表達調控是否一致也需要進一步揭示。YY1轉錄后修飾的方式多種多樣,多數研究顯示轉錄后修飾影響了YY1作為經典轉錄因子對下游靶基因的調控。生物體的調控網絡比較復雜,DNA環的形成可以更好的解釋增強子-啟動子遠距離互作的機制。YY1可以以CTCF介導DNA相互作用的方式促進基因啟動子-增強子之間的相互作用[37],未來研究可關注YY1對染色質結構的影響。除此之外,最新的研究揭示YY1在液-液相分離中表現出重要的調控作用。目前,液-液相分離的研究已經成為生命科學領域的新焦點,但是對于相分離形成的機制仍知之甚少,因此YY1通過相分離影響基因表達的機理目前依然不清楚。

雖然YY1在癌癥調控中的作用已經被廣泛的證實,但YY1對動物繁殖調控影響的研究并不多,YY1是卵母細胞成熟、卵丘擴張的關鍵因子,對胚胎發育至關重要,可以調控睪酮、雌激素等的產生,因此YY1在動物繁殖調控中的作用比較復雜,有必要展開更多的試驗進一步揭示YY1對動物繁殖調控的作用。

綜上所述,YY1除了作為傳統的轉錄因子發揮作用外,能夠作為一種結構蛋白參與染色質環的形成,除此之外還通過相分離機制來調控基因表達。此綜述使廣大科研工作者對YY1功能機制的理解更全面。YY1參與動物卵巢發育、精子生成、胚胎發育、生殖激素調控及其受體表達等繁殖相關的重要生物學過程。但目前關于YY1在動物繁殖調控中作用機制的研究還不透徹,許多重要的問題還沒進行有效的解答。因此,YY1在動物繁殖領域的功能和作用機理需要更加深入和全面的研究,以便為畜牧領域提供理論基礎。