動(dòng)物腸缺氧模型研究進(jìn)展

戴 文,卞蘇舒,,張聚民,宋厚輝,周瑩珊,劉 萍*,王曉杜*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院·動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 動(dòng)物健康互聯(lián)網(wǎng)檢測技術(shù)浙江省工程研究中心 浙江省動(dòng)物醫(yī)學(xué)與健康管理國際科技合作基地 中澳動(dòng)物健康大數(shù)據(jù)分析聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,杭州 311300;2.杭州市臨安區(qū)畜牧農(nóng)機(jī)發(fā)展中心,杭州 311300)

腸缺氧(intestinal hypoxia)是由不同因素(如失血、感染、炎癥或腫瘤等)導(dǎo)致的腸組織氧氣需求量高于供應(yīng)量的病理現(xiàn)象[1]。缺氧是造成細(xì)胞損傷的主要原因之一[2-3],會(huì)誘發(fā)腸道組織代謝、功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變,是動(dòng)物感染性腹瀉、腸梗阻、腸扭轉(zhuǎn)、炎性腸病以及腸腫瘤等疾病中主要的誘發(fā)因素、預(yù)警信號(hào)和關(guān)鍵病理特征[4-6]。生理狀態(tài)下,腸黏膜上皮位于厭氧腸腔和血液循環(huán)豐富、氧氣供應(yīng)較充足的腸黏膜層之間,形成了腸黏膜上皮中陡峭變化的氧梯度[1,7]。腸腔內(nèi)的腸道菌群通過短鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物介導(dǎo)氧敏感性靶點(diǎn)和腸道上皮屏障功能的調(diào)控,保證了腸黏膜組織氧含量的相對(duì)平衡[8]。隨著禽畜養(yǎng)殖規(guī)模化和集約化程度的提高,飼料污染、抗生素濫用、腸道傳染病、代謝、應(yīng)激和畜舍環(huán)境不佳等因素會(huì)直接或間接造成動(dòng)物腸組織氧穩(wěn)態(tài)的破壞,引起不同程度的腸缺氧[9-12],輕則影響動(dòng)物腸道消化吸收,重則導(dǎo)致動(dòng)物死亡,嚴(yán)重影響了動(dòng)物福利以及養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。因此,建立真實(shí)可靠的腸缺氧狀態(tài)的動(dòng)物模型或者能模擬腸缺氧的細(xì)胞模型,對(duì)動(dòng)物腸缺氧疾病的病理及臨床研究至關(guān)重要。目前,國內(nèi)尚無動(dòng)物腸缺氧模型的系統(tǒng)報(bào)道,本文就近年來腸缺氧模型的構(gòu)建方法作一綜述,為腸缺氧研究提供參考。

1 腸缺氧動(dòng)物模型

腸缺氧動(dòng)物模型能比較全面的反映腸缺氧動(dòng)物機(jī)體的系統(tǒng)性變化。目前,腸缺氧動(dòng)物模型主要有循環(huán)性腸缺氧、化學(xué)性腸缺氧和環(huán)境性腸缺氧三類(表1)。在腸缺氧動(dòng)物模型的建立過程中,可通過對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腸道疾病活動(dòng)指數(shù)、腸黏膜通透性、腸組織微觀形態(tài)病理變化等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估,以及檢測低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor,HIF)等氧穩(wěn)態(tài)核心調(diào)控因子含量[13],從多個(gè)層面評(píng)估該模型是否建立成功[11,14-15]。

表1 腸缺氧動(dòng)物模型

1.1 循環(huán)性腸缺氧動(dòng)物模型

循環(huán)性腸缺氧動(dòng)物模型建立的原理是將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腸系膜上動(dòng)脈(superior mesenteric artery,SMA)暫時(shí)性或永久性閉塞,以減少腸道局部血流量,可造成小腸、結(jié)腸和盲腸缺氧。目前,此法是最常用的誘導(dǎo)腸道缺血損傷的方法[15]。其構(gòu)建方法是對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行開腹手術(shù),暴露右腹腔和主要負(fù)責(zé)回腸、盲腸和近端結(jié)腸供血的SMA,根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康膶?duì)SMA進(jìn)行暫時(shí)性閉塞(用非創(chuàng)傷性微血管鉗)或者永久性閉塞(結(jié)扎)一定時(shí)間,待腸系膜搏動(dòng)停止、腸道變白后即可認(rèn)定SMA閉塞,即成功建立了循環(huán)性腸缺氧動(dòng)物模型,其具體缺血時(shí)間可通過預(yù)試驗(yàn)和損傷評(píng)分確定。有些循環(huán)性腸缺氧動(dòng)物模型還會(huì)涉及到對(duì)缺氧動(dòng)物SMA暫時(shí)性閉塞后再灌注,可在模型建立之前對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物靜脈注射肝素,以防止SMA內(nèi)血栓形成,確保在拆除非創(chuàng)傷性微血管鉗進(jìn)行再灌注時(shí)可重新建立循環(huán)。Murthy等[21]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)SMA阻斷60 min,缺氧大鼠的結(jié)腸血管通透性上調(diào)了3倍,腸黏膜通透性上調(diào)16倍。在Ji等[22]的研究中,大鼠SMA阻斷60 min后,小腸絨毛損傷嚴(yán)重,而泛素特異性蛋白酶22與腸缺氧損傷后細(xì)胞增殖和組織再生密切相關(guān)。Yin等[35]對(duì)腸缺血再灌注小鼠(SMA缺血45 min;再灌注90 min)進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序,鑒定了4萬多個(gè)細(xì)胞中的9個(gè)主要細(xì)胞群,新發(fā)現(xiàn)了多個(gè)亞群細(xì)胞,為腸缺氧疾病中細(xì)胞異質(zhì)性和細(xì)胞通訊等研究提供了數(shù)據(jù)支持。Deng等[18]的研究表明,SMA缺血再灌注的小鼠結(jié)腸微生物群組成發(fā)生變化,擬桿菌門和厚壁菌門相對(duì)豐度增加,而疣狀分枝桿菌豐度降低。Deng等[19]通過代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),SMA缺血再灌注(SMA缺血60 min;再灌注2 h)小鼠的次生代謝產(chǎn)物以及多糖生物合成和代謝途徑的基因組豐度都顯著降低。Dai等[36]對(duì)腸缺血再灌注大鼠模型(SMA閉塞120 min;再灌注6/72 h)進(jìn)行了系統(tǒng)性多組學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)腸缺氧大鼠腸道屏障受損,腸道內(nèi)容物泄漏進(jìn)入外周血和遠(yuǎn)端器官,引起全身性炎癥反應(yīng),且伴隨著腸道代謝物和腸道微生物群組成的明顯改變。此法能較好模擬腸缺氧狀態(tài),可靠性較高,但對(duì)操作者的技術(shù)要求較高,且造模時(shí)間過長容易誘發(fā)全身性病變。一旦SMA結(jié)扎時(shí)間過長,其對(duì)腸道的損傷不可修復(fù),甚至可能誘發(fā)肺部實(shí)質(zhì)性損傷和呼吸衰竭,必要時(shí)需切除閉塞腸段[37]。腸道過度缺氧會(huì)引起毛細(xì)血管通透性增加和間質(zhì)水腫,在移除止血鉗時(shí),缺氧時(shí)產(chǎn)生的黃嘌呤氧化酶會(huì)促使大量活性氧生成,誘導(dǎo)炎性因子產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡,加重腸黏膜損傷[12,24]。考慮到腸道血流恢復(fù)后會(huì)造成進(jìn)一步的實(shí)質(zhì)性損傷,研究者應(yīng)當(dāng)在止血鉗移除前完成組織樣品采集。動(dòng)物臨床中,循環(huán)性腸缺氧發(fā)生在多種腸道疾病和腸外疾病中,如壞死性小腸或結(jié)腸炎、腸疝、腸扭轉(zhuǎn)、腸套疊、機(jī)械性腸梗阻、嚴(yán)重腸脹氣、急性腸系膜缺血、失血性休克以及心肺疾病導(dǎo)致的血栓阻塞等[15]。因此,在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域,循環(huán)性腸缺氧動(dòng)物模型普遍適用于由腸道供血不足導(dǎo)致的動(dòng)物急性腸缺氧疾病及其防治策略研究。如Gao等[23]的研究發(fā)現(xiàn),L-半胱氨酸能有效改善腸缺血再灌注(SMA閉塞45 min;再灌注4 h)導(dǎo)致的C57BL6/J小鼠回腸腸肌層神經(jīng)元損傷。Parlar和Arslan[25]研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇有效改善了腸缺血再灌注(SMA閉塞30 min;再灌注150 min和24 h)誘導(dǎo)的大鼠腸道功能障礙,逆轉(zhuǎn)了腸平滑肌收縮能力受損,降低了MPO、IL-1β和TNF-α等炎性因子的表達(dá)。

1.2 化學(xué)性腸缺氧動(dòng)物模型

化學(xué)性腸缺氧動(dòng)物模型建立的原理是:使血液中的低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白,引起高鐵血紅蛋白癥,進(jìn)而降低腸道局部氧供應(yīng)。其構(gòu)建方法是給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物口服強(qiáng)氧化劑亞硝酸鈉,待亞硝酸鈉進(jìn)入消化系統(tǒng)并吸收入血引起高鐵血紅蛋白癥,導(dǎo)致腸道氧供應(yīng)不足,即可建立化學(xué)性腸缺氧動(dòng)物模型。Ansari等[29]的研究發(fā)現(xiàn),給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物口服60 mg·kg-1BW的亞硝酸鈉24 h后,大鼠十二指腸損傷明顯,主要表現(xiàn)為腸黏膜局灶性壞死和充血,伴隨固有層淋巴細(xì)胞浸潤,而抗氧化劑肌肽和N-乙酰半胱氨酸可以保護(hù)腸道免受亞硝酸鈉誘導(dǎo)的損傷。在Khatun等[30]的研究中,使用光譜漫反射法以非接觸性方式監(jiān)測了不同劑量亞硝酸鈉誘導(dǎo)的體內(nèi)高鐵血紅蛋白濃度和氧飽和度水平,用以評(píng)估高鐵血紅蛋白期間的低氧血癥。此法的優(yōu)點(diǎn)在于監(jiān)測方便,且對(duì)動(dòng)物創(chuàng)傷較小,但對(duì)監(jiān)測設(shè)備要求較高,而且亞硝酸鈉對(duì)人體有毒性,操作者在使用過程中要注意安全防護(hù)。同時(shí),低劑量的亞硝酸鈉在酸性環(huán)境下會(huì)被還原生成一氧化氮,因此要充分考慮動(dòng)物敏感性和使用劑量。在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域,由于農(nóng)業(yè)中氮肥的過度使用、工業(yè)廢物的不當(dāng)處理以及大氣氮污染,極大增加了養(yǎng)殖過程中動(dòng)物對(duì)亞硝酸鹽的接觸和攝入,導(dǎo)致不同程度的生理和神經(jīng)功能障礙[29]。因此,化學(xué)性腸缺氧動(dòng)物模型適用于(環(huán)境或飼料中)亞硝酸鹽不當(dāng)攝入或其他因素誘發(fā)的高鐵血紅蛋白癥導(dǎo)致的動(dòng)物腸缺氧疾病及其防治策略研究,應(yīng)用范圍相對(duì)局限。

1.3 環(huán)境性腸缺氧動(dòng)物模型

環(huán)境性腸缺氧動(dòng)物模型的建立原理是通過降低動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境的氣壓和氧氣含量,減少腸組織氧氣供應(yīng)以誘發(fā)腸缺氧。其構(gòu)建方法有兩種,一是高原實(shí)地造模;二是采用低壓氧艙設(shè)備模擬高海拔高原環(huán)境。造模過程中,當(dāng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)焦躁不安、鼻唇和四肢末梢輕微發(fā)紺以及呼吸急促等缺氧表現(xiàn)時(shí),則判斷環(huán)境性缺氧動(dòng)物模型構(gòu)建成功[38]。在Cheng等[39]的研究中,將C57BL/6J小鼠放置在海拔4 010 m的高原(青海玉樹)進(jìn)行實(shí)地造模,發(fā)現(xiàn)高海拔環(huán)境能引起小鼠結(jié)腸組織顯著缺氧,出現(xiàn)結(jié)腸隱窩間距增大、黏膜上皮脫落以及緊密連接蛋白表達(dá)降低等一系列腸屏障破壞的表現(xiàn),并伴隨HIF-1α表達(dá)的增加。因此,高原實(shí)地造模能較好模擬低氧低壓環(huán)境誘導(dǎo)的腸缺氧,但其不足之處在于耗時(shí)耗力、成本較高,且容易誘發(fā)腸外的肺水腫、腦水腫或心血管疾病。因此,低壓氧艙造模法對(duì)于非高原地區(qū)的研究者來說可操作性更強(qiáng),重復(fù)性較好,且造模效果比較接近自然條件下缺血缺氧的病理性過程。羅涵[32]研究發(fā)現(xiàn),低壓艙模擬海拔7 000 m低壓性缺氧環(huán)境即有良好的腸缺氧造模效果,能有效誘導(dǎo)SD大鼠腸損傷及細(xì)菌移位,其主要表現(xiàn)為腸道微絨毛損傷、上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接破壞以及細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器損傷。赫玉寶[34]在模擬急進(jìn)高原缺氧研究中發(fā)現(xiàn),隨著海拔升高(3 000、4 500和6 000 m)和缺氧造模時(shí)間延長(24、48和72 h),缺氧大鼠的腸損傷情況逐漸加重。在環(huán)境性腸缺氧動(dòng)物模型建立過程中,需注意造模時(shí)間的控制,以免造模時(shí)間過長導(dǎo)致腦損傷。大腦是機(jī)體中耗氧量最高的器官,對(duì)長期缺氧的耐受性較低[40-42],但在急進(jìn)入高原環(huán)境后,機(jī)體會(huì)經(jīng)歷一定的高原習(xí)服狀態(tài)(如心臟供血能力上升),短暫的缺氧暴露(1 d內(nèi))不會(huì)造成顯著的腦水腫和認(rèn)知功能障礙[34]。造模結(jié)束后應(yīng)在操作者能夠適應(yīng)的最大海拔高度進(jìn)行現(xiàn)場取材,以盡可能減少降壓后采樣對(duì)檢測指標(biāo)的影響。在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域,環(huán)境性腸缺氧動(dòng)物模型適用于低壓低氧環(huán)境下(如高原氣候)動(dòng)物的腸缺氧疾病,或因跨地域運(yùn)輸引起的養(yǎng)殖環(huán)境所處海拔、氣壓和氧濃度變化而誘發(fā)的動(dòng)物急性腸缺氧疾病及其防治策略研究,亦可應(yīng)用于心肺疾病和休克等多器官功能障礙導(dǎo)致的腸缺氧損傷機(jī)制研究。如李龍等[43]研究了益生菌對(duì)高原缺氧環(huán)境下肉雞生產(chǎn)性能、腸道消化酶活性和腸道形態(tài)的影響,證明益生菌(LactobacillusplantarumJM113菌株)可以提高缺氧肉雞腸道中的消化酶活性,并改善腸道形態(tài),為益生菌作為抗高海拔低氧環(huán)境日糧添加的研究提供了理論基礎(chǔ)。

2 離體腸細(xì)胞缺氧模型

傳統(tǒng)的腸缺氧動(dòng)物模型研究能較好模擬動(dòng)物體內(nèi)腸缺氧的系統(tǒng)性變化,但其受影響因素較多、成本較高,且操作更復(fù)雜和耗時(shí)。研究人員逐漸將目光轉(zhuǎn)移到離體腸細(xì)胞缺氧模型,通過物理法或化學(xué)法改變細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中氧氣含量或者降低細(xì)胞對(duì)氧氣的利用率,以穩(wěn)定誘導(dǎo)離體腸細(xì)胞缺氧模型(表2)。建立離體腸細(xì)胞缺氧模型過程中,可通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察,檢測細(xì)胞活力、無氧酵解過程中產(chǎn)生的乳酸脫氫酶(LDH)活性和HIF等指標(biāo),衡量離體腸細(xì)胞缺氧模型建立的情況[8,44-45]。

表2 離體腸細(xì)胞缺氧模型

2.1 物理法誘導(dǎo)腸細(xì)胞缺氧模型

三氣培養(yǎng)箱法:此法的構(gòu)建方法是將腸組織細(xì)胞置于密閉缺氧環(huán)境(如1% O2、94% N2和5% CO2)的三氣培養(yǎng)箱中,模擬不同程度的缺氧環(huán)境,以制造離體腸細(xì)胞缺氧模型。此法能較好地模擬體內(nèi)腸缺氧環(huán)境,操作簡便,是目前最常用的物理法誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧的方法。將腸上皮細(xì)胞置于三氣培養(yǎng)箱低氧環(huán)境(O2含量1%或者5%)中培養(yǎng)6 h即可造成細(xì)胞缺氧性反應(yīng)[46-47]。如Gao等[48]采用腸上皮細(xì)胞IEC-6誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞缺氧損傷模型(5% CO2,95% N2環(huán)境中培養(yǎng)12 h/24 h),探究了耗牛乳源性外泌體miRNA緩解腸屏障應(yīng)激的機(jī)制。張秀楊等[49]采用結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞缺氧模型(1% O2,5% CO2,94% N2環(huán)境中培養(yǎng)12 h;復(fù)氧2 h),研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α蛋白誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1的表達(dá),介導(dǎo)了短鏈脂肪酸對(duì)腸屏障的保護(hù)。如今,隨著培養(yǎng)箱制造工藝的不斷進(jìn)步,可做到實(shí)時(shí)監(jiān)控三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)液溶解氧濃度變化,并及時(shí)反饋和調(diào)節(jié)特定試驗(yàn)條件下培養(yǎng)箱的氧氣供給,以維持培養(yǎng)液溶解氧的恒定濃度,能更好地模擬體內(nèi)腸缺氧狀態(tài)。但此改進(jìn)方案成本較高,且不能保證脫離培養(yǎng)箱后的試驗(yàn)環(huán)境保持在持續(xù)的低氧/無氧狀態(tài),細(xì)胞培養(yǎng)瓶一旦離開培養(yǎng)箱后細(xì)胞容易造成復(fù)氧,導(dǎo)致造模失敗。目前還有一種選擇是使用更大的配備手套箱的缺氧培養(yǎng)箱,可在持續(xù)的缺氧環(huán)境中完成細(xì)胞缺氧誘導(dǎo),然而相應(yīng)設(shè)備購置和維護(hù)費(fèi)用也更加高昂。如果研究涉及對(duì)氧依賴性蛋白HIF-1的檢測,需嚴(yán)格做到檢測流程的快速和高效。

安寧包法:通過安寧包缺氧系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)物理誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧,該系統(tǒng)由安寧包和密閉培養(yǎng)盒組成,通過安寧包氧化降解吸收O2生成CO2,達(dá)到降低密閉環(huán)境中O2含量的目的。Fachi等[52]采用分離的腸先天淋巴樣細(xì)胞(ILC3)誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧模型(安寧包缺氧環(huán)境中培養(yǎng)3 h),發(fā)現(xiàn)缺氧環(huán)境促進(jìn)了ILC3的增殖和激活。此法較三氣培養(yǎng)箱法的設(shè)備要求低,操作簡便,但其不足之處在于無法精確監(jiān)測氧氣含量。可以根據(jù)不同試驗(yàn)需求,選擇不同厭氧規(guī)格的安寧包。安寧包在使用1 h后可將密閉培養(yǎng)罐中的氧氣含量降低至0.1%,且不改變培養(yǎng)基pH[65]。通過密閉培養(yǎng)盒內(nèi)氧氣指示劑的顏色變化,來判斷培養(yǎng)環(huán)境缺氧程度。

2.2 化學(xué)法誘導(dǎo)腸細(xì)胞缺氧模型

氯化鈷法:此法目前公認(rèn)的作用原理是氯化鈷(CoCl2)中氧親和力較低的Co2+可以取代脯氨酸羥化酶(PHDs)中的Fe2+,導(dǎo)致常氧狀態(tài)下HIF降解被抑制,并激活了下游一系列缺氧相關(guān)信號(hào)通路[66]。在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加一定濃度的氯化鈷,就可以導(dǎo)致細(xì)胞缺氧。此法作用機(jī)制與氧濃度無關(guān),造模效果較物理法更穩(wěn)定,且操作簡便,成本低廉,重復(fù)性良好,常用于腸細(xì)胞缺氧模型的構(gòu)建。但需要注意的是,CoCl2對(duì)人體或細(xì)胞有潛在危害,在操作過程中需注意安全防護(hù)。羅紅敏[54]的研究采用Caco-2細(xì)胞系構(gòu)建體外腸上皮細(xì)胞缺氧模型(1 mmol·L-1CoCl2作用24 h),檢測到細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)顯著升高,并證實(shí)了丙戊酸鈉通過抑制HIF-1表達(dá)以及下調(diào)下游靶蛋白肌球蛋白輕鏈激酶和血管內(nèi)皮生長因子表達(dá),延長失血、燒傷及膿毒性休克動(dòng)物生存時(shí)間。Xie和Collins[53]采用大鼠腸上皮細(xì)胞IEC-6誘導(dǎo)了細(xì)胞缺氧模型(200 μmol·L-1CoCl2作用60 h),揭示了缺氧條件下腸上皮細(xì)胞銅轉(zhuǎn)運(yùn)atp酶(Atp7a)的調(diào)控機(jī)制。

連二亞硫酸鈉法:連二亞硫酸鈉是一種氧清除劑,能迅速清除培養(yǎng)液中的溶解氧[45,67]。2 mmol·L-1連二亞硫酸鈉培養(yǎng)液可維持培養(yǎng)液的無氧狀態(tài)1 h左右[67]。其主要機(jī)制與激活興奮性氨基酸N-甲基-D-天冬氨酸受體有關(guān),促使氧自由基大量蓄積,使細(xì)胞存活率、酶性自由基清除劑超氧化物歧化酶活性下降,引起細(xì)胞氧化功能障礙導(dǎo)致缺氧[3]。此法有著操作簡便、成本低廉的優(yōu)點(diǎn),但連二亞硫酸鈉對(duì)人體或細(xì)胞有潛在危害,在試驗(yàn)操作過程中需注意安全防護(hù)。Dong等[59]研發(fā)了一種可靠的活細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)連二亞硫酸鈉可視化熒光成像技術(shù),可用于細(xì)胞內(nèi)缺氧情況的實(shí)時(shí)監(jiān)測。同時(shí),Tian等[60]設(shè)計(jì)并合成了針對(duì)二亞硫酸鈉造成的缺氧具有高靈敏度和選擇性的熒光探針,并采用連二亞硫酸鈉誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116缺氧模型,熒光成像監(jiān)測細(xì)胞缺氧情況,為“腸-肝軸”相關(guān)疾病病理機(jī)制及其治療研究提供支持。

HIF調(diào)節(jié)劑法:HIF是介導(dǎo)細(xì)胞缺氧的核心轉(zhuǎn)錄因子,其蛋白表達(dá)和基因轉(zhuǎn)錄水平的上升是細(xì)胞缺氧模型構(gòu)建成功與否的核心指標(biāo)。HIF的化學(xué)調(diào)節(jié)劑如二甲基草酰甘氨酸(DMOG)或去鐵胺可通過抑制以HIF為靶點(diǎn)的脯氨酰羥化酶(PHDs)降解,穩(wěn)定HIF并促進(jìn)其在胞漿中不斷蓄積,向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移并激活下游基因的轉(zhuǎn)錄,模擬細(xì)胞缺氧過程中的一系列信號(hào)通路激活[66,68-69]。如在Muenchau等[50]的研究中,采用DMOG作用6 h誘導(dǎo)了人結(jié)腸腺癌肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞T84缺氧模型,細(xì)胞能穩(wěn)定表達(dá)HIF-1α/2α。Zeitouni等[64]采用腸上皮細(xì)胞Caco-2誘導(dǎo)腸細(xì)胞缺氧模型(450 μmol·L-1DMOG作用7 h),研究了缺氧對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌侵襲腸上皮細(xì)胞的影響,發(fā)現(xiàn)DMOG處理與缺氧環(huán)境(1% O2)對(duì)耶爾森氏菌侵襲的影響類似,都減少了耶爾森氏菌侵襲并降低了β整合素蛋白表達(dá)。此法操作簡單,但在試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)需要充分考慮HIF調(diào)節(jié)劑對(duì)細(xì)胞有無毒性作用,是否會(huì)存在非氧依賴性途徑參與細(xì)胞調(diào)控,影響造模效果。

3 離體腸道類器官缺氧模型

腸道類器官作為新興實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?是干細(xì)胞或含有干細(xì)胞的隱窩在體外不斷增殖分化形成的三維細(xì)胞復(fù)合體[70],能高度模擬腸上皮組織,較好地保留了與腸上皮組織相似的形態(tài)表型、組織細(xì)胞功能和生物學(xué)行為[71-72]。近年來,腸道類器官在腸道營養(yǎng)學(xué)、病理生理學(xué)、毒理學(xué)和藥理學(xué)等領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用前景,其引入可以極大地減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用,具有積極的倫理意義[70-71,73]。近年來,研究者在腸缺氧研究領(lǐng)域也有采用腸道類器官的嘗試(表3)。建立離體腸道類器官缺氧模型過程中,可通過腸道類器官形態(tài)學(xué)觀察、活力檢測、LDH活性、E-cadherin(上皮細(xì)胞標(biāo)記物)、富含亮氨酸重復(fù)序列G蛋白偶聯(lián)受體5(LGR5,干細(xì)胞標(biāo)記物)、嗜鉻粒蛋白A(CGA,神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞標(biāo)記物)、溶菌酶(LYZ,潘氏細(xì)胞標(biāo)記物)和黏蛋白(MUC,杯狀細(xì)胞標(biāo)記物)、緊密連接蛋白(如Occludin、ZO-l)、Ki67(增殖標(biāo)記物)以及HIF-1等指標(biāo),來衡量離體腸道類器官缺氧模型建立的情況[71,74]。如Hill等[75]建立人類多能干細(xì)胞來源的人腸道類器官缺氧模型(1% O2環(huán)境中培養(yǎng)24 h),研究了人腸道類器官與人類腸道的相似性。在Deng等[16]的研究中,以小腸類器官和Ⅱ型先天淋巴樣細(xì)胞(ILC2)共培養(yǎng)模型為材料,建立腸道類器官缺氧/復(fù)氧模型(缺氧12 h;復(fù)氧4 h),證實(shí)了腸道微生物代謝產(chǎn)物普伐他汀介導(dǎo)IL-33/ST2信號(hào)通路促進(jìn)ILC2釋放IL-13從而減輕腸道缺血再灌注損傷的機(jī)制。Kip等[76-77]建立人腸道類器官缺氧模型(小于1% O2環(huán)境中培養(yǎng)12 h;復(fù)氧30/120 min),基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了缺氧對(duì)人腸道類器官的影響,及未折疊蛋白反應(yīng)在其中發(fā)揮的作用。De Lange等[78]建立人腸道類器官缺氧模型(1% O2環(huán)境中培養(yǎng)24/48 h),研究了缺氧驅(qū)動(dòng)的腸道類器官模型變化及水解乳清的保護(hù)作用。Koike等[79]建立小鼠腸道類器官缺氧損傷模型(5% O2環(huán)境中培養(yǎng)48 h),研究了羊水干細(xì)胞對(duì)腸道缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。Walaas等[80]建立人結(jié)腸類器官缺氧模型(2% O2環(huán)境中培養(yǎng)14 d),研究了生理性缺氧對(duì)人腸道上皮類器官的生長和功能分化的影響。結(jié)合腸道類器官技術(shù),基于離體腸細(xì)胞缺氧模型的多種建立方法,可以穩(wěn)定誘導(dǎo)離體腸道類器官缺氧模型。

表3 動(dòng)物腸道類器官缺氧模型

4 展 望

目前,國內(nèi)外對(duì)于腸缺氧模型的研究較少,此模型仍有研究和發(fā)展的空間。當(dāng)下對(duì)具體缺氧程度的評(píng)定還沒有一個(gè)公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”,臨床上往往僅區(qū)分開輕度和中度缺氧[81],這對(duì)結(jié)構(gòu)和功能都相對(duì)復(fù)雜的腸道來說,無疑增加了一定的造模難度和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。而且腸缺氧不是一個(gè)單獨(dú)的病理現(xiàn)象,現(xiàn)有的腸缺氧模型構(gòu)建條件大多比較單一,不足以充分反映真實(shí)的腸缺氧病理特征。理想并可靠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛻?yīng)具備重復(fù)性好、可操作性強(qiáng),以及病變發(fā)展盡可能與動(dòng)物疾病過程相似等特點(diǎn)。研究人員需要根據(jù)自己的研究目的擇優(yōu)選擇,采用適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)指標(biāo)來確定缺氧模型是否構(gòu)建成功。動(dòng)物缺氧模型中,除了文中提及的三種模型,常壓缺氧模型也較為常用。與低壓缺氧模型相比,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)常壓缺氧的耐受時(shí)間更長,但這類模型往往以腦缺氧和心肌缺氧為關(guān)鍵觀察指標(biāo),缺少腸缺氧相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐[82-83]。同時(shí),創(chuàng)傷(如燒傷)亦可使全身血流重新分配,導(dǎo)致腸道缺血缺氧。有研究發(fā)現(xiàn),用酒精灌胃小鼠4 h后并誘導(dǎo)Ⅲ級(jí)燒傷,能觀察到小鼠缺氧誘導(dǎo)因子表達(dá)的增加和腸屏障功能的損傷[84-85],但此類方法有著較大的動(dòng)物福利相關(guān)爭議。此外,利用造血系統(tǒng)尚未成熟的新生小鼠多次采血也能間接誘導(dǎo)腸道屏障破壞和腸缺氧,此法對(duì)幼齡小鼠的多次放血亦不符合動(dòng)物福利的要求[86-87],故皆不多做討論。試驗(yàn)方案的可選擇性往往比研究者想象的大,研究者應(yīng)該利用這種多樣性,并充分考慮試驗(yàn)的人道性和可行性,選擇合適的試驗(yàn)方案[88]。在過去十年中,畜禽腸道類器官的培養(yǎng)方法已在豬、牛、兔、馬、羊和雞中開發(fā)出來[89],但目前關(guān)于畜禽動(dòng)物腸道類器官缺氧模型領(lǐng)域的研究相對(duì)空白,未來可基于高度還原腸道功能的畜禽動(dòng)物腸道類器官構(gòu)建腸缺氧模型。相信隨著相關(guān)領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展,腸缺氧模型會(huì)突破當(dāng)前研究所面臨的困難和限制,在動(dòng)物腸道病生理機(jī)制研究和動(dòng)物腸道健康保障中發(fā)揮重要作用。