鵝骨骼肌衛星細胞的分離培養與鑒定

張 力,許加龍,黃錦鈺,許子月,雷昕諾,盧會鵬,朱 睿,孫偉翔,曹海月,王安平,朱善元*

(1.江蘇農牧科技職業學院 江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室 江蘇現代畜牧與新獸藥工程技術中心,泰州 225300;2.江蘇農牧科技職業學院,泰州 225300;3.南京大學醫學院,南京 210093)

隨著生活水平的提高,人們對家畜肉品質的要求也日益提高。鵝肉是理想的高蛋白、低脂肪和低膽固醇的營養食品,早在2002年,聯合國糧農組織就將鵝肉列為21世紀重點發展的健康產品之一[1]。中國是肉鵝最大的消費國和出口國,鵝肉深受消費者青睞,因而開展鵝產肉性能品種改良,發掘影響鵝肌肉生長的功能基因,探究鵝骨骼肌生長發育調控的分子機理,具有重大的經濟效應。

獲得具有高分化潛能的鵝骨骼肌衛星細胞是開展鵝肌肉組織生長發育調控機制研究的前提和基礎。骨骼肌衛星細胞來源于肌肉中的一部分成肌祖細胞,這些細胞在出生后個體的肌肉組織中保留未分化狀態,位于肌膜和基底膜之間,具有很強的分化潛能[2-3]。早在1961年,科學家就通過電子顯微鏡觀察青蛙骨骼肌肌纖維外圍區域發現了肌源性衛星細胞[4]。1974年,首次從成年大鼠骨骼肌中分離出衛星細胞[5]。之后,人們通過不斷優化分離方法,逐漸分離出人類[6-7]、牛[8-10]、羊[11]、雞[12]、豬[13-15]等不同物種的衛星細胞。然而到目前為止,有關鵝骨骼肌衛星細胞分離培養方法的研究很少,且現有方法分離得到的細胞分化能力有限[16]。

經過多年的發展,目前常用于分離衛星細胞的方法有單根肌纖維分離法和酶消化法。單根肌纖維法是利用I型膠原酶消化肌肉組織并溫和研磨,從肌肉組織中分離出單根肌纖維[17-18]。單根肌纖維法分離培養得到的衛星細胞能夠達到95%以上的純度。但是,解剖單根肌纖維非常耗時,因而此方法有較大局限性。為了能夠獲得大量衛星細胞,研究人員開發了酶消化法。酶消化法利用單酶或者多種酶組合消化肌肉組織將衛星細胞徹底釋放到消化液中。不同酶組合的消化效果不同,與其他方法相比,酶消化法耗時短,獲得衛星細胞的產量高,但是通常分離得到細胞是衛星細胞、脂肪細胞、成纖維細胞等的混合細胞,如果想要得到較高純度的衛星細胞,則需要進一步純化。常用的純化方法有差速貼壁法、Percoll梯度離心法和流式細胞分選(FACS)等[19-21]。但是,已有分離方法分離得到的細胞普遍存在耗時長、細胞純度低和存活率低等問題,因此,建立一種簡便、高效的體外分離培養骨骼肌衛星細胞的方法尤為重要。鑒于此,本研究對傳統分離細胞使用的酶和細胞生長培養基進行了優化,以期獲得具有高度分化潛能的鵝骨骼肌衛星細胞,為研究鵝骨骼肌生長和發育調控機制提供細胞模型和材料支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

健康10周齡溆浦鵝仔鵝來自江蘇現代畜牧科技示范園(江蘇畜禽遺傳資源研究所)。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM/F12高糖培養基(Hyclone);DMEM高糖培養基(Gibco);胎牛血清(FBS,Gemini);馬血清(HS,Gibco);青霉素鏈霉素混合液(索萊寶);磷酸鹽緩沖液(Gibco);分散酶Dispase II(Roche);膠原酶II(Sigma-Aldrich);0.25%胰蛋白酶(索萊寶);重組人堿性成纖維生長因子bFGF(PeproTech);基質膠(BD Biosciences);4%多聚甲醛(索萊寶);鼠抗Pax7抗體(DSHB);鼠抗MyHC/MF20抗體(DSHB);鼠抗GAPDH抗體(翌圣);羊抗鼠594標記二抗(索萊寶);總RNA抽提試劑(碧云天);反轉錄試劑(諾唯贊);定量試劑2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq plus(聚合美);RIPA蛋白裂解液(碧云天)。其它試劑均為國產優質分析純。所有PCR產物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

凈化工作實驗臺(上海智城分析儀器制造有限公司),CO2恒溫細胞培養箱(Thermo Fisher),DYY-10C 型電泳儀(北京市六一儀器廠);Tanon 5200全自動化學發光圖像分析系統(上海天能科技有限公司);QuantStudio 3 實時熒光定量PCR儀器(Applied Biosystems);Axio Vert A1倒置熒光顯微鏡(Zeiss)。

1.3 鵝骨骼肌衛星細胞分離和培養

將10周齡溆浦鵝仔鵝麻醉后處死,75%酒精消毒腿部肌肉組織附近皮膚;剪下肌肉組織,用PBS緩沖液沖洗;用無菌剪刀將肌肉組織剪碎成肉糜狀;加入消化工作液(消化工作液是含有終濃度為2 mg·mL-1分散酶Dispase II和4 mg·mL-1膠原酶II的高糖DMEM培養基溶液,一般1 cm3的肌肉組織需要5～10 mL消化工作液),吹打混勻,并在37 ℃搖床上震蕩消化1 h;消化完成后,加入10 mL含有3% FBS的高糖DMEM培養基終止消化;消化液依次用100 μm和40 μm的細胞篩進行過濾;細胞懸液1 500 r·min-1離心10 min,棄上層溶液;用3 mL紅細胞裂解液處理2 min,再加入5 mL DPBS,1 500 r·min-1離心5 min;棄上清,此時沉淀中包含大量分離得到的鵝骨骼肌衛星細胞,用5 mL骨骼肌衛星細胞生長完全培養基(骨骼肌衛星細胞生長完全培養基為含20% FBS,1%青霉素鏈霉素混合液,5 ng·mL-1bFGF的DMEM/F12培養基溶液)重懸細胞,輕柔吹打均勻,接種于25 cm2培養瓶中,放入37 ℃,5% CO2細胞培養箱中培養。

1.4 鵝骨骼肌衛星細胞純化與傳代培養

用生長完全培養基培養衛星細胞。原代細胞培養時,為促進衛星細胞貼壁,培養過程中使用的培養瓶或培養皿均需使用基質膠進行包被處理(基質膠包被液為基質膠和DMEM按照1∶24比例混合的溶液)。同時,為減少細胞損失,最初培養過程中不需要換液,每2 d需添加部分新的生長完全培養基。原代衛星細胞在經基質膠包被后的培養皿中3～7 d匯合度達到80%～90%,此時可進行傳代。首次傳代時,通過差速貼壁法對衛星細胞進行純化。消化后,收集細胞到15 mL離心管中,1 500 r·min-1離心5 min。用生長完全培養基重懸細胞,轉移至未經基質膠包被處理的10 cm皿中,放入培養箱中靜置。1 h后,此時成纖維細胞已經貼壁,衛星細胞沒有貼壁,吸取10 cm皿中上層培養基到新的經基質膠包被好的10 cm皿中,以此除去成纖維細胞。

1.5 鵝骨骼肌衛星細胞誘導分化

取正常培養的細胞,待細胞匯合度達到90%以上時,更換分化培養基(分化培養基為含2%馬血清的高糖DMEM培養基溶液),誘導分化1～7 d,觀察衛星細胞的分化情況。

1.6 鵝骨骼肌衛星細胞免疫熒光鑒定

從培養箱中取出原代鵝衛星細胞或誘導分化后的鵝肌管細胞,吸棄原培養基,加入PBS洗滌2次后用4%的多聚甲醛固定20 min;固定完成后,用PBS洗滌3次;向培養孔中加入免疫熒光封閉液,室溫封閉1 h;吸凈封閉液,加入Pax7、MyHC/MF20一抗(1∶100稀釋抗體),4 ℃孵育過夜;孵育完成后,用PBS洗滌3次。按照試驗需求配制所需二抗;加入羊抗鼠594標記二抗,避光室溫孵育1 h;PBS避光洗滌3次;避光將含DAPI抗淬滅封片液加入培養孔中,覆蓋細胞;避光4 ℃保存以待顯微鏡鏡檢。

1.7 鵝骨骼肌衛星細胞RT-PCR鑒定

分別收集誘導分化前(生長培養基,GM)和誘導分化后(分化培養基,DM)的細胞樣品,分化前、后每組均3個重復。采用Trizol法進行總RNA的提取,用試劑盒反轉錄為cDNA,以cDNA為模板,加入Pax7、MyoD1、MyoG、Gapdh基因上、下游引物進行qRT-PCR,引物信息詳見表1;qRT-PCR 15 μL反應體系:2.9 μL 2×SYBR Green Mix,上、下游引物各0.3 μL,4 μL稀釋后的cDNA,無酶水補齊至15 μL。反應條件:95 ℃ 60 s;(95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s)40個循環。

表1 本研究所用的引物序列

1.8 鵝骨骼肌衛星細胞Western blotting驗證

分別收集誘導分化前后的細胞樣品,利用添加1%PMSF的RIPA蛋白裂解液提取總蛋白。對蛋白進行變性后,利用Western blotting分別檢測鵝骨骼肌衛星細胞增殖期和分化期Pax7、MyHC的表達情況。

1.9 統計分析

qRT-PCR結果參照2-ΔΔCt方法來評估Pax7、MyoD1、MyoG的相對表達量,以Gapdh作為內參基因進行待測基因表達差異的檢測。結果以“平均數±標準差(Mean±SD)”表示,采用SPSS軟件分析,組間差異性采用獨立樣本t檢驗的方法進行比較,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 鵝骨骼肌衛星細胞的分離和鑒定

采集健康10周齡溆浦鵝仔鵝骨骼肌,利用分散酶Dispase Ⅱ和膠原酶Ⅱ消化處理,分離并通過差速貼壁法純化獲得骨骼肌衛星細胞。分離得到的原代衛星細胞呈球形,體積較小,折光性強(圖1A,紅色箭頭)。用生長完全培養基培養衛星細胞,經12 h培養后細胞開始緩慢貼壁,呈中間彭起兩端針狀的梭形結構(圖1A,黃色箭頭)。培養24 h后絕大多數衛星細胞完全貼壁,呈紡錘形,貼壁后的衛星細胞開始大量快速增殖(圖1B)。

A. 鵝骨骼肌衛星細胞培養12 h后形態,比例尺=20 μm (20×);B. 衛星細胞培養不同時間后顯微鏡下形態,比例尺=200 μm (10×);C. Pax7免疫熒光染色鑒定,比例尺=200 μm (20×)A. Morphology of goose skeletal muscle satellite cells after 12 h culture, scale bar=20 μm (20×); B. Morphology of satellite cells under microscope after different time of culture, scale bar=200 μm (10×); C. Pax7 immunofluorescence staining identification, scale bar=200 μm (20×)圖1 鵝骨骼肌衛星細胞分離、培養及鑒定Fig.1 Isolation, culture and identification of goose skeletal muscle satellite cells

Pax7是衛星細胞特異性標志基因,經免疫熒光鑒定,原代衛星細胞高表達Pax7(圖1C)。另外,經生長完全培養基培養后,分別提取其RNA和蛋白質,利用qRT-PCR和Western bloting檢測Pax7 mRNA和蛋白表達水平,結果顯示培養的衛星細胞依舊高表達Pax7。因此,本分離方法能夠獲得較高純度的鵝骨骼肌衛星細胞,以及該培養體系能夠維持衛星細胞處于較高的未分化狀態。

2.2 鵝骨骼肌衛星細胞的體外誘導分化

在細胞匯合度達到80%～90%時,進行體外誘導分化。發現細胞在誘導第2天開始拉長、變大,且初顯小肌管。誘導第4天,開始有明顯的肌管形成。之后,這些肌管繼續融合形成成熟較大的肌管(圖2A)。此時,結晶紫染色也顯示有大量成熟肌管生成(圖2B)。成熟的肌管能夠維持0.5～1 d,由于培養條件限制,之后逐漸脫落。

A. 衛星細胞誘導分化過程中形態變化,比例尺=200 μm (10×);B. 衛星細胞誘導分化后結晶紫染色,比例尺=200 μm(4×)A. Morphological changes of satellite cells during induced differentiation, scale bar=200 μm (10×); B. Crystal violet staining after differentiation of satellite cells, scale bar=200 μm (4×)圖2 鵝骨骼肌衛星細胞在誘導分化過程中的形態變化Fig.2 Morphological changes of goose skeletal muscle satellite cells after induced differentiation

肌球蛋白重鏈MyHC是肌纖維的組成型蛋白。利用MyHC標記成熟肌管,免疫熒光染色結果顯示,分化后期,肌管與肌管融合形成縱橫的更大肌管,肌管中可能包含近百個細胞核(圖3)。此時,細胞的分化指數(含有2個及以上細胞核的肌管中的細胞核數量/細胞核總數)高達78% (圖4,P<0.01),說明分離得到的衛星細胞體外具有高度分化的能力,保持較高的分化潛能。

圖3 鵝骨骼肌衛星細胞誘導分化第6天MyHC免疫熒光染色鑒定Fig.3 MyHC immunofluorescence staining identification of goose skeletal muscle satellite cells after 6 days induced differentiation

**. P<0.01,下同**. P<0.01, the same as below圖4 鵝骨骼肌衛星細胞誘導分化前后分化指數統計Fig.4 Statistics of differentiation index of goose skeletal muscle satellite cells before and after differentiation

2.3 鵝骨骼肌衛星細胞誘導分化前后分子水平變化

分別收集誘導分化前(GM)和誘導分化后(DM)的細胞樣品,提取RNA,反轉后通過qRT-PCR檢測其標志基因Pax7、MyoD1、MyoG的相對表達水平。結果顯示,分化標志基因MyoD1、MyoG的表達均在誘導分化后明顯升高,并且分化后MyoD1、MyoG的相對表達量分別是分化前的1.90和44.22倍,而分化前衛星細胞標志基因Pax7的相對表達量是分化后的2.22倍(圖5A,P<0.01)。另外,Western blotting檢測結果也顯示,經誘導分化后,Pax7蛋白表達水平降低,而MyHC蛋白表達水平明顯升高(圖5B)。從分子水平上說明分離的衛星細胞具有較強的分化潛力,可以作為后續試驗的體外分化細胞模型。

A. 分化前后Pax7、MyoD1、MyoG的相對表達量;B. 分化前后Pax7和MyHC蛋白表達水平A. The relative expression of Pax7, MyoD1 and MyoG before and after differentiation; B. The proteins expression level of PAX7 and MyHC before and after differentiation圖5 鵝骨骼肌衛星細胞誘導分化前后基因表達變化情況Fig.5 Changes of gene expression in goose skeletal muscle satellite cells before and after differentiation

3 討 論

成體中骨骼肌衛星細胞位于肌肉組織的肌膜和基底膜之間,保留未分化狀態,具有很強的分化潛能。衛星細胞的分化潛能也使其成為成體骨骼肌研究的重要細胞模型,用于肌肉組織形成和發育機制[22-25]、分子育種病理、損傷修復[2,26]、衰老及再生[27-28]等多方面的研究。

目前,人們已經從小鼠[29]、牛[8-9]、豬[13-14]等哺乳動物中分離出骨骼肌衛星細胞。由于年幼個體的衛星細胞含量更豐富,所以對于哺乳動物而言,通常選用低日齡動物肌肉組織作為分離材料。而對于家禽而言,通常選用發育到一定胚齡的胚胎作為材料分選骨骼肌衛星細胞。例如,雞一般選用12胚齡左右的雞胚作為生物材料[30-31],鴨一般選用13胚齡左右的鴨胚作為生物材料[32],家鴿一般選用16胚齡左右的鴿胚作為生物材料[33]。但是對于鵝而言,目前關于鵝骨骼肌衛星細胞的報道很少,沈龍仙等[16,34]選用10～15日齡鵝胚分離培養衛星細胞。鵝胚取材繁瑣,而且相關研究甚少涉及對衛星細胞分化能力的評估。在鵝衛星細胞分離中,本研究未選用胚胎,而選用10周齡仔鵝的肌肉組織為試驗材料,分離得到大量具有高度分化潛能的衛星細胞,且細胞分化指數高達78%。與一定胚齡的鵝胚胎相比,仔鵝更易獲得且個體肌肉組織甚多,從而大大拓寬了鵝衛星細胞分離的取材范圍。

大量的文獻報道顯示,目前實驗室多采用多酶混合的方法分離骨骼肌衛星細胞。常用于分離衛星細胞的酶包括膠原蛋白酶、鏈酶蛋白酶、胰蛋白酶、膠原酶等,不同酶聯合消化的時間不同,分離效果也存在較大差異,一些研究比較了不同酶的消化分離效果[35]。目前,比較成熟的衛星細胞的分離以人、小鼠、豬為主,在禽類中尚無很好的衛星細胞分離方法。本研究選擇膠原酶Ⅱ和分散酶Dispase II的混合液消化剪碎的骨骼肌組織1 h,以徹底將衛星細胞釋放出來。膠原酶Ⅱ可以降解具有三股螺旋的膠原纖維,消化組織; Dispase Ⅱ作用溫和,對細胞損傷小。試驗證實,膠原酶Ⅱ (終濃度為4 mg·mL-1)和Dispase Ⅱ (終濃度為2 mg·mL-1)的組合及濃度的選擇能夠獲得大量具有活力的衛星細胞。

與其他方法相比,酶消化法耗時短,獲得衛星細胞的產量高,但是通常分離得到的細胞是衛星細胞、脂肪細胞、成纖維細胞等的混合細胞,如果想要得到較高純度的衛星細胞,則需要進一步純化。常用的純化方法有Percoll梯度離心法、流式細胞分選(FACS)和差速貼壁法等。Percoll不連續密度梯度離心法能獲得較純的衛星細胞,但是由于多次離心造成細胞損失,因此所需初始細胞總量較大。流式細胞分選法操作復雜,成本高。尤其對于禽類來說,由于可用抗體缺乏,導致此方法很難實施。本研究選用差速貼壁法純化衛星細胞,即在傳代時通過差速貼壁1 h對鵝骨骼肌衛星細胞進行純化,試驗證明此方法能夠去除成纖維細胞的干擾,獲得高純度衛星細胞。

生長培養基的選擇對于衛星細胞分化能力的維持尤為重要。本研究選用含有20%FBS和添加bFGF (終濃度為5 ng·mL-1)的DMEM/F12培養基培養鵝骨骼肌衛星細胞。高血清濃度能夠促進衛星細胞的增殖而抑制其分化。另外,研究證實bFGF在干細胞的體外培養過程中有利于維持干細胞的未分化狀態,促進細胞增殖[36]。體外誘導分化試驗顯示可以形成多核的成熟大肌管,因而說明該生長培養基可以維持鵝骨骼肌衛星細胞保持較高的分化潛能,滿足后續的試驗需求。

目前,通常采用免疫熒光標記特異基因的方法鑒定衛星細胞。正常生理狀態下,衛星細胞處于靜止態,此時細胞高表達標志蛋白Pax7,在肌肉損傷或受到生長因子的刺激后,衛星細胞被激活[37-38],激活后的衛星細胞開始表達成肌調節因子MyoD和MyoG[39],分化為成肌細胞和肌細胞[40],進而融合形成肌管,此時細胞高表達肌管標志蛋白MyHC。如果在體內,肌管進一步融合、成熟形成新的肌纖維。因此,本研究采用Pax7鑒定初步衛星細胞的分離及純度,在后續的試驗中,通過檢測MyoD、MyoG和MyHC等的表達變化,評估衛星細胞的分化潛能,進一步證實本研究分離的細胞是具有多潛能分化生物學特性的骨骼肌衛星細胞。

4 結 論

本研究建立了膠原酶Ⅱ和分散酶Dispase II組合的混合酶分離鵝骨骼肌衛星細胞的方法,并對細胞的生長完全培養基進行了優化,實現在體外培養過程中維持衛星細胞的高未分化狀態,保持其巨大的分化潛能,為鵝肌肉組織生長發育、肉質改良、藥理毒理試驗、損傷修復等提供了良好的細胞模型及研究基礎。