CYP19A1對兔卵巢顆粒細胞增殖和凋亡的影響

楊安琪,李嘉誠,宋 穎,陳 欣,靳榮帥,趙博昊,吳信生,陳 陽

(揚州大學動物科學與技術學院,揚州 225009)

顆粒細胞(granulosa cells,GCs)對卵母細胞的生長與成熟起著重要的調節作用,GCs參與維持成熟分裂的阻斷和誘導排卵,調節卵母細胞成熟分裂[1-3]。在所有哺乳動物中,GCs的增殖率會隨著卵泡大小的變化而改變[3]。在原始卵泡中,GCs增殖率低,但隨著卵泡腔的生長和卵泡的增大,細胞由分裂逐步向分化轉變,限制了正在分化的GCs增殖[3]。GCs的增殖和凋亡受到許多基因的控制。SMAD7基因抑制山羊卵巢顆粒細胞的增殖,促進其凋亡[4]。IGF1R基因表達下調,使AKT /mTOR信號通路下調,進而抑制卵巢GCs增殖及促進其凋亡[5]。抑制WNT5a基因的表達,使BAX/BCL-2的比值上調,從而調控Wnt/β-Catenin通路來抑制卵巢GCs的增殖及促進凋亡[6]。外源BMP6對雞卵泡GCs體外增殖有顯著影響[7]。在母兔卵巢卵泡發育過程中,哪些因子發揮了重要作用,還有待進一步挖掘。

芳香化酶(aromatase, CYP19)是細胞色素P450酶系中的一種,P450芳香化酶(cytochrome P450, family 19, subfamily A, polypeptide 1,CYP19A1)是芳香化酶的編碼基因。研究發現,CYP19A1是豬卵巢GCs中的抗凋亡因子,也是豬卵巢GCs中雌二醇(E2)合成必需的[8]。牦牛卵丘卵母細胞復合體(COCs)成熟過程中CYP19A1上調內源性E2水平,使早期卵母細胞的發育水平得到提升[9]。GCs中CYP19A1 mRNA水平與E2水平呈正比例關系,在一定范圍內,CYP19A1 mRNA表達量越高,分泌的E2越多,說明CYP19A1可以通過調控激素水平間接影響卵泡的發育,CYP19A1 mRNA表達量的變化與卵泡發育的數量密切相關[10]。而CYP19A1基因對兔卵巢GCs增殖和凋亡的調控功能尚不明確。

課題組前期通過轉錄組測序篩選了多個參與母兔繁殖周期調控的基因,其中關鍵差異表達基因CYP19A1在甾類激素生物合成、卵巢類固醇生成等信號通路中都有所富集,由此推測CYP19A1可能對母兔繁殖周期的調控也起著重要的作用[11-13]。本研究計劃克隆CYP19A1基因,利用生物信息學預測分析其蛋白質結構和理化性能。進一步分離并鑒定兔卵巢GCs,構建pcDNA3.1-CYP19A1過表達載體和siRNA,分別轉染卵巢GCs,以探究CYP19A1對GCs增殖和凋亡的影響,以及對類固醇激素合成相關基因表達的影響,為進一步了解母兔卵泡發育和繁殖周期調控的分子機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 卵巢GCs的分離和培養

采集8月齡健康新西蘭白兔母兔的卵巢,置于含有DMEM培養基的無菌培養皿中,刺破卵泡,使GCs釋放到培養基中。將GCs混合液過濾、低速離心后棄上清液。加入2 mL紅細胞裂解液,輕吹混勻后裂解5 min,再次放入離心機低速離心后棄去上清液。加入含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM-F12,制成細胞懸液后接種到6孔板中,在5% CO2,37 ℃的條件下培養。

1.2 卵巢GCs的鑒定

原代GCs培養24 h后,用4%多聚甲醛固定液在室溫下固定30 min,再用0.3% TritonX-100處理60 min,每步完成后都需要用PBS洗3次。1% BSA室溫封閉60 min,棄去封閉液后向其中加入一抗(anti-FSHR,1∶250),在4 ℃環境下培養過夜。過夜后用PBST漂洗3次,加入1∶2 000稀釋過后的山羊抗兔IgG(FITC)二抗,在37 ℃孵育60 min。PBST漂洗3次,滴加DAPI,在室溫下染色10 min后,用熒光顯微鏡觀察顯色,拍照保存。

1.3 pcDNA3.1-CYP19A1質粒構建

以pcDNA3.1(+)質粒作為載體,使用CE Design軟件設計一步克隆引物,構建CYP19A1的真核表達載體。在上游引物中加入XbaⅠ酶切位點和上游載體末端同源序列,在下游引物中加入EcoR Ⅴ酶切位點和下游載體末端同源序列(表1)。使用XbaⅠ酶和EcoR Ⅴ酶對pcDNA3.1(+)載體進行雙酶切,瓊脂糖凝膠回收。使用重組酶Exane?Ⅱ把CYP19A1 CDS擴增產物和雙酶切后的pcDNA3.1(+)載體連接。轉化后,測序,進行無內毒素質粒小提。

表1 兔CYP11A1克隆的引物序列

1.4 siRNA的設計與合成

根據兔CYP19A1序列設計出siRNA序列(表2),用于兔卵巢GCs的轉染。

表2 兔CYP19A1 siRNA序列信息

1.5 細胞轉染

在24孔板中用DMEM-F12培養基對卵巢GCs進行培養,當細胞長到70%左右時利用LipofectamineTM2000進行轉染,每組3個重復。8 h后棄去培養上清,在每個孔中加入500 μL DMEM-F12培養基,繼續在培養箱中培養。48 h后,提取并保存細胞總RNA,用于后續試驗。

1.6 細胞增殖檢測

將轉染后的卵巢GCs接種到96孔板中,隨后每24 h檢測一次細胞的增殖水平。每次測定先加入10 μL CCK-8 Solution,混合均勻后放入培養箱共同培育,2 h后使用酶標儀檢測450 nm處的吸光值,并做好相應記錄。

1.7 細胞凋亡檢測

用Annexin V-FITC-PI試劑盒檢測細胞的凋亡水平。轉染后的GCs培養48 h后用胰酶消化并收集,1 000 r·min-14 ℃離心5 min,棄去上清液;使用預冷過的PBS洗滌細胞2次,1 000 r·min-1、4 ℃離心5 min,棄上清液;加入100 μL Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI Staining Solution,每加入一種試劑都要吹打均勻后再加入下一種試劑;全部加入并混勻后在避光、室溫的環境下孵育10 min;加入400 μL Binding Buffer,輕輕混勻;染色完成后在1 h內用流式細胞儀對樣品進行檢測,并使用軟件進行分析,計算出細胞凋亡率。

1.8 細胞總RNA提取

收獲1×107～5×107GCs,加入1 mL Trizol,反復抽取混勻后室溫靜置5 min。加入200 μL 氯仿,劇烈振蕩25 s左右,靜置2 min。12 000 g 4 ℃離心15 min,小心吸取上清,加入500 μL異丙醇,搖勻后在室溫條件下靜置10 min。12 000 g 4 ℃離心10 min,棄去上清液,加入75%乙醇(冰冷)1 mL,振搖,充分洗滌沉淀。12 000 g 4 ℃離心5 min,棄上清,短暫離心,小心吸取棄上清。加入適量(20 μL)無酶水溶解,測定RNA濃度及純度,置-80 ℃保存。

1.9 熒光定量PCR

用NCBI Blast(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)網頁設計熒光定量引物,檢測與CYP19A1以及類固醇激素合成相關基因CYP1B1、CYP1A1、IGF1R、BMP6、CYP17A1的表達量,內參基因選用GAPDH,引物詳細信息見表3。反應體系20 μL:2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL,上游引物0.4 μL,下游引物0.4 μL,50×ROX Reference Dye2 0.4 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 7.8 μL。反應程序為預變性:95 ℃ 30 s;循環反應:95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s(循環40次);熔解曲線采集:95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。

表3 熒光定量引物信息

1.10 數據統計與處理

采用Excel對數據進行統計,用2-ΔΔct法處理熒光定量結果,用SPSS 25.0成對T檢驗對數據進行顯著性分析,最后使用GraphPad prism 8繪圖。*為差異顯著(P<0.05),**為差異極顯著(P<0.01)。

2 結 果

2.1 CYP19A1基因克隆和過表達載體的構建

提取GCs總RNA,以cDNA為模板,擴增出CYP19A1基因1 500 bp左右的片段(圖1A)。經比對,CYP19A1基因序列全長1 512 bp,序列同源性高達99%。進一步構建了pcDNA3.1-CYP19A1質粒,載體經XbaⅠ酶和EcoR Ⅴ雙酶切后的載體片段與插入片段大小符合預期(圖1B)。

A.CYP19A1擴增電泳圖;B.雙酶切電泳圖A. CYP19A1 amplification electrophoresis figure; B. Double enzyme digestion electrophoresis figure圖1 CYP19A1擴增及雙酶切電泳結果圖Fig.1 Plots of CYP19A1 amplification and double enzyme digestion electrophoresis

2.2 CYP19A1氨基酸序列的預測分析

經ExPASy ProtParam預測,CYP19A1為穩定的親水性蛋白(圖2A),其蛋白分子式為C2599H4114N672O711S39,不穩定系數為37.24,親水性平均值為0.088。使用SOPMA和SWISS-MODEL預測發現,CYP19A1二級結構主要由α螺旋和無規卷曲構成(圖2B),三級結構預測表現為彎曲螺旋狀(圖2C)。STRING預測其互作蛋白質主要有HSD17B1、HSD17B2、HSD17B3、CYP1A1、SULT1E1、SRD5A2和SRD5A1等蛋白(圖2D)。

利用NetPhos預測,CYP11A1蛋白有31個潛在磷酸化位點(圖2E)。經過PSORT Ⅱ Prediction亞細胞定位預測分析,發現CYP19A1蛋白主要存在于內質網和高爾基體上(圖2F)。共編碼503個氨基酸,其中亮氨酸(Leu)含量最多,占比10.1%,色氨酸(Trp)含量最少,所占比例為1.2%(表4)。CDD database預測發現,CYP19A1蛋白含有一個結構域,屬于P450家族(圖2H)。

表4 兔CYP19A1蛋白氨基酸組成

通過MEGA11軟件將人(Homosapiens)、北美鼠兔(Ochotonaprinceps)、牛(Bostaurus)等9個物種的CYP19A1蛋白序列與兔進行同源性對比,發現兔與北美鼠兔聚類為一支(圖2G)。

2.3 兔卵巢GCs分離培養和鑒定

卵巢GCs為貼壁細胞,細胞培養8～12 h后即可貼壁生長,形態為不規則的多邊形或梭形。利用FSHR在GCs細胞膜特異性表達的特點,對分離的細胞進行免疫熒光染色。本試驗中細胞膜呈綠色熒光(圖略),證實獲得的細胞為GCs。

2.4 CYP19A1基因過表達和干擾對類固醇激素合成相關基因的影響

在GCs中,對CYP19A1進行過表達和干擾,通過實時熒光定量檢測IGF1R、CYP1B1、CYP1A1、BMP6、CYP17A1基因的表達量。發現CYP19A1過表達極顯著提高了IGF1R、CYP1B1、CYP1A1的表達量,BMP6、CYP17A1表達量極顯著降低(P<0.01)(圖3A和3B)。與siRNA-NC相比,3個siRNA均抑制了CYP19A1的表達,以siRNA-2效果最顯著(圖3C)。進一步進行干擾試驗,發現IGF1R、CYP1B1、CYP1A1基因的表達量均顯著下降(P<0.05或P<0.01),BMP6和CYP17A1的表達量均極顯著增加(P<0.01)(圖3D)。結果說明CYP19A1可調控類固醇激素合成相關基因的表達。

A.CYP19A1過表達效果分析;B.CYP19A1過表達對類固醇激素合成相關基因表達的影響;C.CYP19A1干擾效果分析;D.CYP19A1干擾對類固醇激素合成相關基因表達的影響。*.P<0.05;**.P<0.01,下同A.Analysis of CYP19A1 overexpression effect;B.Effects of CYP19A1 overexpression on the expression of genes related to steroid hormone synthesis;C.Analysis of interference effect of CYP19A1;D.Effects of CYP19A1 interference on the expression of genes related to steroid hormone synthesis. *. P<0.05; ** .P<0.01, the figure below is the same圖3 過表達和干擾CYP19A1對類固醇激素合成相關基因表達的影響Fig.3 Effects of overexpression and interference with CYP19A1 on the expression of genes related to steroid hormone synthesis

2.5 CYP19A1基因過表達和干擾對卵巢GCs增殖和凋亡的影響

過表達和干擾CYP19A1基因,利用CCK8法和FITC/PI法檢測GCs的增殖和凋亡情況。結果顯示,過表達CYP19A1基因24 h后顯著提高了GCs的增殖水平,相反,干擾CYP19A1基因24 h后顯著降低了GCs的增殖水平(P<0.01)(圖4A)。進一步過表達CYP19A1基因顯著抑制了GCs的凋亡,反之干擾CYP19A1基因則顯著加快了GCs的凋亡(P<0.01)(圖4B)。由此可得CYP19A1基因可以促進GCs增殖,抑制GCs凋亡。

A.CYP19A1表達量變化對GCs增殖的影響;B.CYP19A1表達量變化對GCs凋亡的影響A. Effects of CYP19A1 expression changes on the proliferation of GCs; B. Effect of CYP19A1 expression changes on apoptosis of GCs圖4 過表達和干擾CYP19A1對卵巢GCs增殖和凋亡的影響Fig.4 Effects of overexpression and interference with CYP19A1 on proliferation and apoptosis of ovarian GCs

3 討 論

CYP19A1屬于細胞色素P450超家族,在正常發育的卵泡GCs中表達量較高,是催化睪酮轉化為雌二醇的關鍵酶[14-15]。雌激素能夠促進有腔卵泡的快速發育和成熟,在卵泡發育過程中起重要作用,是調控哺乳動物進入發情期的主要激素[16-17]。課題組前期研究結果證實了CYP19A1參與母兔發情周期調控。本研究克隆了兔的CYP19A1基因,經生物信息學預測,發現CYP19A1蛋白為穩定親水性蛋白,進化樹分析確定其是一個十分保守的基因。

進一步為探究CYP19A1基因調控母兔發情周期的分子機制,構建了CYP19A1的過表達載體和干擾序列。經轉染后發現,過表達CYP19A1可使IGF1R、CYP1B1和CYP1A1的表達量增加,BMP6和CYP17A1的表達量減少,經干擾后,上述基因表達量的變化趨勢與過表達結果均相反,符合預期。已知雌激素是影響動物發情的重要因素[18],CYP1B1、CYP1A1與CYP19A1一樣,同為細胞色素P450家族成員,可影響雌激素的氧化代謝[19-20]。CYP1A1有4個位點具有多態性,其基因多態性可影響酶的表達量和活性,從而調控雌激素的體內代謝[21-22]。在發情前期CYP1B1的表達水平明顯上升[23]。推測CYP19A1與CYP1A1、CYP1B1可能存在協同作用,通過共同調控體內雌激素水平,間接影響動物的發情周期。雌激素受體(ER)是介導雌激素發揮生物學效應的重要受體,與CYP19A1的表達量呈正相關,ER與IGF1受體(IGF1R)的表達量也呈正相關,由此推測CYP19A1能夠通過影響ER的表達進而調控IGF1R的表達量[24-25]。CYP17A1為雄激素合成限速酶,其不僅能夠調控雄激素的合成,也有調控GCs合成孕酮的功能,影響著卵泡生長發育直至排卵的全過程[26-27]。CYP19A1的主要功能是促進雌激素合成,推斷CYP19A1是通過降低CYP17A1的表達量來抑制雄激素和孕酮的合成,從而促進雌激素的合成。BMP6屬于BMPs(骨形態發生蛋白)家族的一員,BMP屬于轉化生長因子TGF-β(transforming growth factor-β)超家族[28-29],BMPs家族在卵泡發生的各階段均發揮著重要作用[30-32]。在哺乳動物中,BMP-15、BMP7在原始卵泡的激活及卵泡的發育過程中發揮重要作用,而BMP6的表達缺失對優勢卵泡的選擇具有較大影響[33-35]。BMP6和BMP7的共同作用會降低GCs的E2合成量[36]。BMP6還可以促進母雞前卵泡顆粒細胞中的促卵泡生成素(FSH)受體mRNA的表達[37]。此外,BMP6能夠通過上調限速酶CYP19A1的表達來促進E2和P4的分泌[38]。本研究中,CYP19A1過表達后,極顯著抑制了BMP6表達,推測可能存在負反饋機制,但仍需要進一步探索。綜上,提示CYP19A1可能通過調控類固醇激素合成相關基因的表達,參與母兔卵泡的發育。

本研究發現,過表達CYP19A1可促進GCs增殖、抑制GCs凋亡,而干擾其表達則會抑制GCs增殖,促進GCs凋亡。有研究證實,CYP19A1可催化雄激素轉化為雌激素,而雌激素中E2最具生物活性,可促進卵巢GCs增殖和卵泡分化[39-40]。為后期深入探究CYP19A1調控GCs增殖和凋亡的途徑提供了思路。綜上所述,CYP19A1在兔卵泡發育過程中發揮著至關重要的作用,并可能通過調控類固醇激素合成相關基因的表達,影響GCs增殖和凋亡,參與母兔的發情周期。

4 結 論

CYP19A1蛋白是一種穩定的親水性蛋白,與其它物種同源性較高。CYP19A1基因可以促進GCs增殖,抑制GCs凋亡,調控類固醇激素合成相關基因的表達,進而參與母兔卵巢卵泡發育。