絲氨酸對宮內發育遲緩哺乳仔豬生長性能、腸道形態結構和免疫相關指標的影響

周 輝,關 鵬,王晨昱,侯若鑫,李鐵軍,印遇龍,何流琴*

(1.湖南師范大學生命科學學院 動物腸道功能與調控湖南省重點實驗室,長沙 410081;2.中國科學院亞熱帶農業生態研究所 畜禽養殖污染控制與資源化技術國家工程實驗室 動物營養生理與代謝過程湖南省重點實驗室,長沙 410125)

宮內發育遲緩(IUGR)是指哺乳動物妊娠期胚胎/胎兒器官生長發育緩慢。養豬生產中,通常將出生體重低于新生仔豬平均體重標準差的1.5或2倍作為判定IUGR的標準,國家統計局數據顯示,IUGR在仔豬中的發生率可達15%～20%[1]。由于IUGR新生仔豬初乳攝入少,體脂貯存少,機體免疫系統發育不良等因素將損害機體健康,導致死亡率高[1-3]。特別是IUGR仔豬因其腸道免疫系統發育不良,更容易受內外源應激因素的影響,使腸道免疫功能損傷,從而進一步損害養分的利用和阻礙生長發育[1]。因此,在集約化養殖生產中尋找相關營養調控技術改善IUGR腸道功能進而提高存活率對提高豬的生產效益具有重要的實踐價值[1]。日糧氨基酸是飼糧中重要的營養組成成分,其中絲氨酸(Ser)作為功能性氨基酸參與糖酵解、核苷酸生物合成、碳代謝和谷胱甘肽合成等生物過程,并有助于促進免疫血球素和抗體的產生,對維持免疫系統的正常功能至關重要[4-5]。有研究表明,飼糧補充Ser可以緩解早期斷奶仔豬腸道的炎癥反應促進其腸道健康[6],還可以緩解結腸炎導致的小鼠腸道損傷[7-8]。然而,Ser是否可以改善IUGR仔豬的腸道功能進而促進其生長發育目前尚未可知。因此,本研究擬通過灌服適量濃度的Ser,探討其對IUGR仔豬生長性能、血清生理生化指標、血清游離氨基酸含量以及腸道形態功能的影響,為改善IUGR仔豬生長性能和免疫力提供理論依據,同時為畜禽氨基酸營養需要與IUGR仔豬飼養管理提供新策略。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用哺乳仔豬來自湖南龍華農牧發展有限公司,飼料級Ser購自張家港市思普生化有限生產,純度≥99.0%。

1.2 試驗設計

按照出生體重低于平均體重標準差的2倍為標準判定IUGR,從胎次和體況相近、健康狀況良好的長白×約克夏二元雜交母豬中選取剛分娩的16頭平均體重為(1.27±0.01)kg的新生正常仔豬作為對照組,同時選取16頭平均體重為(0.98±0.01)kg的IUGR新生仔豬作為處理組,所有仔豬正常哺乳。其中處理組8頭IUGR仔豬在第1、4、7、11、15、19、22、26天灌服0.8% 3 mL Ser[5](IUGR+SER組),對照組8頭正常仔豬則在相同時間灌服3 mL的生理鹽水(NBW組),在28日齡進行屠宰取樣,其余新生仔豬(每組各8頭)試驗第1天屠宰取樣。試驗期28 d。

1.3 試驗動物飼養與管理

試驗前對豬舍進行徹底消毒,并清洗飲水器,同時對試驗豬進行常規免疫與驅蟲。每天自由哺乳,各組飼養管理條件一致。豬舍溫度控制在25 ℃左右,保持圈舍通風、清潔、干燥、衛生。消毒按常規程序進行。嚴格遵循豬場飼養和管理制度,每日注意觀察其行為表現,發現異常及時記錄并處理。期間不使用任何抗生素以及微生態制劑。

1.4 樣品采集

所有仔豬屠宰前稱重并于前腔靜脈處采血,血液樣品靜置2 h后,4 ℃條件下3 000 r·min-1離心10 min分離血清,血清樣品分裝至1.5 mL離心管后放入-80 ℃冰箱保存。收集空腸、回腸組織,用于后續試驗分析。

1.5 指標檢測

1.5.1 生長性能 于試驗第1和第28天,分別對每頭仔豬進行空腹稱重并記錄;試驗期間每天多次記錄仔豬腹瀉情況,計算腹瀉率和腹瀉評分。

1.5.2 血清生化指標的測定 將待測的血清樣品解凍,取300 μL用CX-4型全自動生化分析儀(美國Backman公司)測定血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素(BUN)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHOL)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C4)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C3)的含量以及堿性磷酸酶(ALP)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)的活性,試驗操作均按相應試劑盒(上海羅氏制藥有限公司)說明書進行。

1.5.3 血清游離氨基酸的測定 稱取2 mL血清樣品于10 mL離心管內,加入0.01 mol·L-1鹽酸進行勻漿(1∶10),再將勻漿液轉移至25 mL比色管,定容。搖勻后過濾,準確吸取2 mL濾液于10 mL離心管中,加入8%磺基水楊酸2 mL,混勻,靜置15 min后10 000 r·min-1離心10 min。取上清液過0.22 μm微孔濾膜,上清液用L-8800型全自動氨基酸分析儀(L-8800,Hitachi,Tokyo,Japan)測定其中游離氨基酸的含量。

1.5.4 細胞流式 在空腹條件下,各組試驗豬前腔靜脈采血2 mL置于10 mL肝素鈉采血管中,振蕩混勻,靜止5～10 min。向每管內加入淋巴細胞分層液2 mL,2 000 r·min-1離心10 min;用注射器取出中間層白細胞,加入另外一支預先加入淋巴細胞分層液的試管中,3 000 r·min-1離心10 min,取白細胞層;重復2次,直到無紅細胞為止。將Anti-CD4+和Anti-CD8+的單抗進行50倍稀釋,然后向每管加入100 μL,37 ℃放置20～30 min,用PBS洗3次;加入鼠抗豬異硫氰酸熒光素-免疫球蛋白G(FITC-IgG)二抗,37 ℃孵育20 min,用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗3次,然后利用流式細胞儀檢測。

1.5.5 腸道形態結構 取遠端回腸3 cm樣品用4%甲醛固定,再經脫水、石蠟包埋、切片,最后進行蘇木精-伊紅(HE)染色,在熒光顯微鏡(BX51,Olympus,日本東京)下測量并記錄視野內回腸的絨毛高度、隱窩深度,計算絨毛高度/隱窩深度。

1.5.6 血清免疫球蛋白酶聯免疫分析 采用ELISA試劑盒(江蘇酶免實業有限公司)測定血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量,所有試驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5.7 Western blot 用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離空腸樣品中提取的總蛋白,并將其印在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,在4 ℃下與抗白細胞介素10(IL-10)和抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體共同孵育過夜,用含Tween 20的Tris緩沖鹽水(TBST)洗滌后,用二抗孵育1 h,使用增強化學發光(ECL)分析試劑盒(中國杭州Biosharp)顯示蛋白質條帶,并使用Image J軟件(美國馬里蘭州貝塞斯達NIH)測量蛋白質條帶。

1.6 統計與分析

先用Excel 2016對試驗數據進行初步整理,采用數據統計軟件SPSS 20.0中T檢驗對新生仔豬和斷奶仔豬數據進行統計分析。所有試驗數據均以“平均值±標準誤差(SEM)”表示。以P<0.01表示差異極顯著,以P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 Ser對IUGR仔豬生長性能的影響

由表1可知,與新生正常仔豬相比,新生IUGR體重極顯著降低(P<0.001),但灌服0.8% Ser到28 d后可以讓IUGR仔豬體重較正常豬無顯著差異(P>0.05),恢復到正常水平。

表1 絲氨酸對IUGR仔豬生長性能的影響(n=8)

2.2 Ser對IUGR仔豬血清生化指標的影響

由表2可知,新生IUGR仔豬血清中TP和AST水平顯著低于新生正常仔豬(P<0.05),血清中ALT水平顯著高于新生正常仔豬(P<0.05),血清中ALB水平無顯著差異(P>0.05),但28 d時,與正常仔豬相比,灌服0.8% Ser的IUGR仔豬血清中TP、AST和ALT水平無顯著差異(P>0.05),血清中ALB水平較正常仔豬顯著升高(P<0.05)。

表2 絲氨酸對IUGR仔豬血清生化指標的影響(n=8)

2.3 Ser對IUGR仔豬血清游離氨基酸的影響

由表3可知,新生IUGR仔豬血清中蘇氨酸(Thr)、甘氨酸(Gly)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和異亮氨酸(Ile)水平顯著高于新生正常仔豬(P<0.05),Ser水平顯著低于新生正常仔豬(P<0.05),但28 d時,灌服0.8% Ser的IUGR仔豬血清中Thr、Gly、Ser、Val和Leu水平較正常仔豬無明顯差異(P>0.05),恢復到正常水平。

表3 絲氨酸對IUGR仔豬血清游離氨基酸的影響(n=8)

2.4 Ser對IUGR仔豬腸道形態的影響

由表4可知,與健康仔豬相比,灌服0.8% Ser后并沒有顯著提高IUGR仔豬空腸的絨毛高度和顯著降低隱窩深度(P>0.05)。由圖1和圖2可知,與新生正常仔豬相比,新生IUGR仔豬空腸和回腸組織的絨毛短小,絨毛表面呈絮狀,固有層內可見大量炎癥細胞浸潤,腺體被破壞,但28 d時,灌服0.8% Ser的IUGR仔豬空腸和回腸組織絨毛排列緊密整齊且表面光滑,各層清晰可見,明顯的炎癥反應消失,達到正常水平。由表5可知,與新生正常仔豬相比,新生IUGR仔豬回腸的絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度等無顯著差異(P>0.05),隱窩深度顯著高于新生正常仔豬27.73%(P<0.05),但28 d時,灌服0.8% Ser的IUGR仔豬回腸的絨毛高度較健康仔豬顯著提高20.21%(P<0.05),隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度等無顯著差異(P>0.05),恢復到正常水平。

圖2 絲氨酸對IUGR仔豬回腸形態結構的影響Fig.2 Effects of Ser on ileum morphology and structure of IUGR pigs

表5 絲氨酸對IUGR仔豬回腸形態結構的影響(n=8)

2.5 Ser對IUGR仔豬免疫性能的影響

由圖3和表6可知,新生IUGR仔豬外周血中CD4+T淋巴細胞含量有低于新生正常仔豬的趨勢(P=0.077),CD8+T淋巴細胞含量顯著高于新生正常仔豬(P<0.05),CD4+/CD8+顯著降低(P<0.05),但28 d時,灌服0.8% Ser的IUGR仔豬外周血中CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞和CD4+/CD8+較正常仔豬無顯著差異(P>0.05),恢復到正常水平。由表7可知,與新生正常豬相比,新生IUGR仔豬血清中IgG、IgM和IgA水平無明顯差異(P>0.05),但28 d時,灌服0.8% Ser的IUGR仔豬血清中IgG、IgM和IgA水平較正常仔豬極顯著降低(P<0.01)。由圖4可知,與新生正常豬相比,新生IUGR仔豬空腸中IL-10蛋白表達量顯著降低(P<0.05),但28 d時,灌服0.8% Ser的IUGR仔豬空腸中IL-10蛋白表達量較正常仔豬顯著升高(P<0.05)。

圖3 絲氨酸對IUGR仔豬外周血中CD4+、CD8+T淋巴細胞含量的影響Fig.3 Effects of Ser on the contents of CD4+and CD8+T lymphocytes in peripheral blood of IUGR pigs

**.差異極顯著(P<0.01)**.The difference is extremely significant (P<0.01)圖4 絲氨酸對第1天(A)和第28天(B)IUGR仔豬空腸組織IL-10蛋白表達量的影響(n=8)Fig.4 Effects of Ser on IL-10 protein expression in jejunum of IUGR pigs at 1st(A) and 28th(B) day(n=8)

表6 絲氨酸對IUGR仔豬外周血中CD4+、CD8+T淋巴細胞含量的影響(n=8)

表7 絲氨酸對IUGR仔豬血清免疫球蛋白含量的影響(n=8)

3 討 論

3.1 Ser對IUGR仔豬生長性能和腸道形態的影響

仔豬初生重對仔豬出生后的生長發育快慢起著重要作用[9],一般情況下IUGR仔豬的生長速度遠慢于正常仔豬[10]。目前已有許多學者提出了改善IUGR仔豬生長發育和健康的多種營養調控措施,比如妊娠期補充精氨酸、新生期補充谷氨酰胺和大豆卵磷脂、生長肥育期補充肉質改良劑等[11-12]。本研究中,IUGR顯著降低了新生仔豬的體重,這與之前的結果一致[13-14],但經灌服0.8% Ser后,28日齡IUGR仔豬的體重可追趕上正常仔豬,表明補充Ser可提高IUGR仔豬生長性能,實現IUGR仔豬的補償生長。其原因可能是灌服Ser提高了IUGR仔豬體內氨基酸的相互轉化和利用,促進更多蛋白質的合成和能量供應,進而滿足仔豬生長需要。同時,灌服Ser可能改善了IUGR仔豬腸道形態結構和完整性,進而提高了營養物質吸收和利用,同時提高了機體免疫力。

動物的生理、新陳代謝和生長直接依賴于小腸的完整性和功能,小腸不僅參與營養物質消化和吸收,而且還參與局部和全身的免疫反應[15]。Meyer和Caton[16]研究發現,IUGR仔豬的腸道功能發育不良并伴有損傷現象。本試驗中,新生IUGR仔豬的空腸和回腸形態結構缺乏完整性,這與先前的研究結果[16]一致。但經灌服0.8% Ser 28 d后,IUGR仔豬的空腸和回腸形態結構明顯得到恢復,炎性浸潤消失,絨毛排列整齊,并與正常哺乳仔豬無差異。但IUGR仔豬的空腸的絨毛高度和隱窩深度在灌服0.8% Ser后并沒有得到顯著改善,這可能是因為Ser對IUGR仔豬空腸的絨毛高度和隱窩深度有一定的改善作用,可是在生長發育過程中空腸受損嚴重,外源添加Ser并不能在斷奶階段就讓其恢復至正常水平,可能需要更長的試驗周期或者更高的Ser添加量。Zhang等[7]和Zhou等[8]研究發現,日糧添加Ser能夠降低小鼠腸道組織中促炎因子的水平,改善結腸炎小鼠的腸道形態結構,有效維持腸道屏障功能和滲透性。Che等[17]研究發現,28日齡不做任何處理的IUGR仔豬的回腸絨毛高度較正常仔豬顯著降低,隱窩深度顯著增加,結合該研究數據表明,Ser在改善IUGR仔豬回腸形態結構過程中發揮至關重要的作用。其原因一方面可能是Ser作為營養調控劑促進了IUGR仔豬體內營養物質的運輸和吸收來緩解腸道應激損傷[18-19];另一方面可能是Ser作為信號分子激活了蛋白質和能量代謝相關信號通路進而改善了腸道屏障結構與功能的完整性[20]。

3.2 Ser對IUGR仔豬血清生化和血清游離氨基酸的影響

血清生化指標是反映機體健康狀況的重要指標。血清中TP能夠反映出機體蛋白質的合成情況,ALB能夠結合內外源性物質,維持血漿膠體滲透壓,清除自由基,提高機體的免疫力,血清中TP和ALB濃度通常被視為蛋白質合成和代謝的指標,與仔豬的生長性能有關[21]。本試驗中,新生IUGR仔豬血清TP含量遠低于正常仔豬,而灌服Ser后,兩者間TP含量無顯著差異,且ALB含量顯著高于正常仔豬,表明新生IUGR仔豬體內蛋白質在體內沉積較少和免疫低,無法給機體的正常生長提供足夠多的蛋白質,但Ser處理后可促進IUGR仔豬體內蛋白質合成和免疫功能提高。ALT和AST是與肝功能相關的酶,所以AST和ALT活性通常被認為是肝功能的敏感標志[22],當肝受到損傷時,血清中ALT和AST活性就會上升。本試驗中,新生IUGR仔豬血清中AST活性顯著低于新生正常仔豬,但這并不能說明IUGR新生仔豬沒有發生肝損傷,這是因為AST參與機體多個組織部位的轉氨反應,轉氨酶活動已被廣泛用作組織損傷和疾病的替代標志物[23],如AST是心肌中蘋果酸轉化為天冬氨酸重要的酶,且AST能參與肝腎的糖異生、脂肪組織的甘油異生等[23],因此,IUGR新生仔豬血清中AST活性顯著低于新生正常仔豬可能是AST用于機體其它代謝途徑。但經灌服0.8% Ser后,IUGR仔豬肝功能已恢復到正常水平。可能的原因是Ser的添加促進肝中硒蛋白的合成,而硒蛋白具有抗氧化,參與免疫細胞的激活、增殖和分化等生理功能[5]。

在新生動物中,Thr完全是通過蘇氨酸脫水酶在體內進行代謝[24],因為新生動物機體對Gly的需求和利用率高[25],其代謝產物部分形成Gly、α-酮丁酸和氨,另一部分以乙酰輔酶A的形式參與三羧酸循環(TCA)來產生能量[26]。其中蘇氨酸脫水酶在肝組織中高表達[26]。Leu、Val和Ile統稱為支鏈氨基酸,支鏈氨基酸不能在體內直接合成,其代謝活動發生在機體多個組織中,均由支鏈氨基酸轉移酶(BCAT)催化生成支鏈酮酸運輸至肝進行代謝[27]。本試驗中,新生IUGR仔豬血清中Thr、支鏈氨基酸、Gly顯著高于新生正常仔豬,說明其對這些氨基酸的利用率低,這可能是IUGR新生仔豬肝中蘇氨酸脫水酶分泌不足所致,也可能是IUGR新生仔豬肝組織損傷,無法為機體生長發育提供充足的能量和維持蛋白質合成能力。但灌服0.8% Ser后,IUGR仔豬血清中Thr、Gly、Val和Leu均與正常仔豬無顯著差異,說明Ser對IUGR仔豬氨基酸的轉運吸收起到一定的促進作用,可能是因為Ser對肝損傷具有改善作用,從而導致肝對氨基酸的轉運吸收和代謝利用增強;另外,Ser在氨基酸轉化中發揮著重要作用,外源添加Ser導致機體內Ser含量增多,可以更多地轉化為其它氨基酸滿足機體氨基酸的缺乏,從而促進蛋白質合成。值得注意的是,本研究發現新生IUGR仔豬血清Ser含量顯著低于正常仔豬,表明IUGR仔豬內源性Ser可能供應不足,不能滿足機體生長發育需要,灌服Ser后,IUGR仔豬血清中Ser含量雖與正常仔豬無顯著差異,但仍有低于正常仔豬的趨勢(P=0.087),進一步表明IUGR的發生可能與母體或子代在哺乳階段對Ser的需要量不斷增加有關,內源性合成的Ser已不能滿足機體需要,只能通過外源補充維持其正常生長發育。

3.3 Ser對IUGR仔豬免疫性能的影響

免疫器官中含有大量的淋巴細胞,其中T淋巴細胞占35%～50%,參與細胞免疫反應[28]。不同的輔助性T淋巴細胞亞群在免疫反應中發揮不同的作用[29-30]。CD4+是輔助性T細胞的主要表面標志,參與殺傷、清除、分泌細胞因子等功能。CD8+是細胞毒性T淋巴細胞的表面標志,這些細胞在抑制其它免疫細胞免疫調節功能的同時,對體液免疫和細胞免疫產生負性調節作用[31]。CD4+/CD8+的比值可以反映機體的免疫狀態,該比值的下調表明機體的免疫功能受到抑制[30]。Dong等[32]研究發現,IUGR會影響仔豬免疫功能,導致其體內CD4+和CD8+T淋巴細胞數量和分布不均衡。在本試驗中,新生IUGR仔豬體內CD4+和CD8+T細胞數量發生異常,其中CD8+T細胞比例增加,表明IUGR仔豬受外源病原體感染嚴重,需要更多的CD8+T細胞去結合被感染的細胞,而且CD4+T細胞比例降低,表明IUGR仔豬的免疫功能降低,需要外來疫苗或藥物來抵御抗原。當灌服0.8% Ser后,IUGR仔豬CD4+和CD8+T細胞數量達到正常水平。Hu等[33]研究發現,28日齡不做任何處理的IUGR仔豬CD4+和CD8+T細胞含量不能達到正常水平,結合本研究的相關數據表明,Ser能夠減少IUGR仔豬機體的炎癥反應,提高其免疫。Sorensen等[34]研究也發現,通過調節手術期癌癥患者CD4+/CD8+的比值可以緩解這些患者的免疫抑制。免疫球蛋白在哺乳動物免疫系統中具有重要作用,能發揮補體激活和抗原結合等作用[35],并且能夠體現機體的免疫力水平,被認為是反映機體健康狀況的重要指標[36]。Tang和Xiong[37]研究發現,IUGR會導致機體內促炎因子分泌增加和免疫球蛋白數量減少。本試驗發現,新生IUGR仔豬血清中IgA、IgG、IgM含量沒有顯著差異,灌服0.8% Ser到28 d后,結合Che等[17]研究發現,雖然灌服Ser的IUGR仔豬血清中IgA、IgG、IgM含量較正常仔豬顯著減少,可是跟不做任何處理的28日齡IUGR仔豬相比,灌服Ser的IUGR仔豬血清中IgA、IgG、IgM含量顯著增加,表明Ser可一定程度提高IUGR仔豬血清中免疫球蛋白含量,未達到正常仔豬水平可能與Ser的添加量與試驗時間有關。IL-10作為一種抗炎因子,能夠調節細胞的增殖與分化,例如抑制巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞的活性,從而參與機體的炎癥和免疫反應[38-39]。本試驗發現,灌服0.8% Ser可以使IUGR仔豬空腸的IL-10蛋白表達量顯著增加,表明外源添加Ser能夠提高IUGR仔豬的免疫性能,降低仔豬腸道炎癥反應。推測其可能的原因:一方面是Ser可為機體提供更多的能量有助于免疫細胞的增殖分化以及抗炎因子的產生;另一方面是Ser可作為抗體和免疫血球素的重要因子,可通過提高免疫因子的產生進而減少促炎因子的分泌,提高免疫細胞活性,從而改善IUGR仔豬免疫功能。

4 結 論

相比于正常仔豬,IUGR仔豬生長性能、腸道形態結構和免疫功能均受到一定影響。外源補充Ser可促進新生IUGR仔豬的生長發育,改善腸道形態結構,促進仔豬免疫系統發育,使IUGR仔豬體重達正常仔豬水平。