一株豬圓環病毒2d基因型毒株的全基因組序列及其衣殼蛋白的小鼠免疫原性分析

李 暢,周 平,溫 平,4,楊克禮,劉 威,郭 銳,劉澤文,袁芳艷,高 婷,宋浩菲,田永祥,周丹娜*

(1.湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所農業農村部畜禽細菌病防治制劑創制重點實驗室,武漢 430064;2.湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所畜禽病原微生物學湖北省重點實驗室,武漢 430064;3.湖北省獸藥監察所,武漢430070;4.華中農業大學生豬健康養殖協同創新中心,武漢 430070)

豬圓環病毒(porcine circovirus, PCV)為圓環病毒屬成員,是目前已知最小的動物病毒,病毒粒子直徑為15～20 nm,基因組為1 759～2 000 bp的單股環狀DNA[1]。目前已知的PCV共有4種,其中PCV1被認為是細胞污染物,對豬和人類無致病性;PCV3首次發現于2016年美國某皮炎和腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS)豬的組織樣品中;PCV4首次發現于我國湖南省某豬場的斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)樣品中,但PCV3和PCV4的致病性仍有待進一步確定[2-3]。自20世紀90年代,PCV2就被公認是導致4～16周齡豬發生PMWS、PDNS、先天性震顫、繁殖障礙、間質性肺炎和肉芽腫型腸炎等疾病的主要病原,能破壞豬的淋巴系統,導致豬免疫功能抑制和炎癥反應紊亂,從而易引起繼發感染[4],給全球養豬業帶來巨大的經濟損失。

PCV2的基因組長度為1 766～1 768 nt,目前已知含有11個開放閱讀框(ORF)[5],其中ORF1長度為945 bp,編碼病毒的復制相關蛋白rep(35.7 ku)和rep′(20 ku)[6];ORF2長度為702～705 bp,編碼病毒的衣殼蛋白(Cap)(27.8 ku)。Cap是PCV2的免疫原性蛋白,可誘導豬產生中和抗體[7]。ORF3編碼一種非結構蛋白(11.9 ku),在誘導細胞凋亡和調控病毒毒力方面發揮作用[8]。根據目前可信度最高的PCV2基因分型標準[1],即:基因型內p值最大為13%(根據ORF2基因計算)、相應內部節點的bootstrap值高于70%、具有至少15個可用序列,可將其分成PCV2a～PCV2i等9個基因亞型,其中2a、2b、2d在世界范圍內均流行,2c僅在巴西和丹麥出現,2e主要在亞洲和美國發生,2f和2g主要在亞洲和歐洲流行,2h僅在亞洲流行[9],2i在美國流行[10]。PCV2基因型在我國的流行變化趨勢與世界范圍內變化趨勢基本一致,2002年之前為PCV2a,2002—2008年為PCV2b,2009年之后為PCV2d[1,11]。由于PCV2易發生基因突變,因此,持續監測PCV2流行情況對于疫病防控和疫苗更新具有重要指導意義。

對于PCV2在我國豬場中的廣泛感染,接種疫苗能有效降低其流行率,并預防相關疾病發生。針對不同基因型疫苗株保護效果的研究發現,多數情況下,PCV2a和PCV2b為基礎的疫苗仍能針對其他基因型毒株的感染產生保護力[11-12]。但是,PCV2d毒株感染可導致比其他基因型毒株更嚴重的淋巴系統損傷和病毒血癥,更易造成繼發感染和豬群發病[13-14]。持續分離流行毒株,研究其致病力和Cap蛋白的免疫原性,對于指導臨床用苗和研究PCV2致病機理具有重要參考價值。

本研究從湖北省某規模化豬場采集發病仔豬組織樣品,經PCR檢測證明為PCV2陽性;利用組織勻漿液接種PK-15細胞分離病毒,使用間接免疫熒光測定其生長特性;通過全基因組克隆、測序和序列分析,研究其遺傳進化特點;使用生物信息比對、蛋白表達和免疫血清中和病毒試驗,分析和評價其Cap蛋白的抗原表位差異和免疫原性,評價Cap蛋白免疫血清的抗PCV2感染效果,為研究湖北省的PCV2流行特點提供參考,為研究PCV2致病機制提供材料和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣品、細胞和動物 淋巴結、肺和腎樣品采自湖北省某規模化豬場疑似PMWS仔豬;BL21(DE3)化學感受態細胞購自南京諾唯贊生物科技有限公司;DH5α化學感受態細胞、PK-15細胞由湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所獸醫室保存;SPF級別BALB/c小鼠購自湖北省實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑和儀器 DNA提取試劑盒購自愛思進生物技術有限公司;2×Phanta Max Master Mix、Taq Pro HS Universal Probe Master Mix、FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit等購自諾唯贊生物科技有限公司;pMD-18 T載體和pET-28a載體購自寶日醫生物技術有限公司;S1000TM Thermal Cycler(PCR儀)購自Bio-Rad公司;ViiATM7實時熒光定量PCR儀購自ABI公司;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、TSA、TSB、瓊脂糖等購自國藥集團化學制藥有限公司;胎牛血清(FBS)、DMEM培養基、胰酶購自Gibco公司;HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF(His標簽蛋白瓊脂糖高速純化樹脂)購自翌圣生物科技股份有限公司;PCV2豬多克隆抗體(貨號:210-70-PCRV)購自VMRD公司;6×His tag抗體(貨號:GTX115045)、HRP標記山羊抗兔IgG抗體(貨號:GTX213110-01)和FITC標記兔抗豬IgG抗體(貨號:GTX26773)購自GeneTex公司。

1.1.3 引物設計和合成 參考PCV2基因組序列和限制性內切酶位點,設計全基因組擴增引物和檢測引物;根據PCV2 Cap的核定位序列和抗原表位,設計Cap蛋白的擴增引物;參考GB/T 35901—2018設計PCV2定量PCR引物和探針,由武漢擎科生物有限公司合成,引物序列見表1。

表1 本研究所用的引物和探針

1.2 方法

1.2.1 臨床樣品的處理 淋巴結、肺和腎樣品各200 mg,在冰上剪碎,按照體積比1∶3加入磷酸鹽緩沖液(PBS),用組織破碎儀破碎10 min,-80 ℃反復凍融3次,4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min,取上清用于病原檢測和分離培養,其余于-80 ℃保存。

1.2.2 PCR 根據DNA提取試劑盒說明書提取樣品DNA,使用表1中相應引物和高保真DNA聚合酶擴增PCV2全基因組、檢測區域和Cap蛋白抗原表位區域。PCR反應體系:DNA 100 ng、引物F/R各2 μL、2×Phanta Max Master Mix (Dye Plus) 25 μL,加無酶ddH2O至50 μL。PCR反應條件:95 ℃ 3 min;(95 ℃ 15 s、Tm值溫度 15 s、72 ℃ 30 s·kb-1)35個循環;72 ℃ 5 min。

定量PCR(qPCR):使用表1中PCV2定量檢測引物和Taq Pro HS Universal Probe Master Mix,依據說明書推薦反應體系定量檢測PCV2,反應條件:95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s,45個循環。

1.2.3 全基因組測序 使用瓊脂糖凝膠電泳分離PCV2全基因組擴增產物,回收相應條帶,經加尾反應后連接pMD-18 T載體,轉化到DH5α化學感受態細胞,經抗生素篩選和PCR鑒定后挑選陽性菌落,送至武漢擎科生物有限公司測序,使用SnapGene進行基因注釋。

1.2.4 序列分析 根據文獻報道[15],從GenBank下載PCV2各基因型毒株的全基因組參考序列;使用MEGAX Clustal W算法比對測序結果和參考序列;使用MEGAX neighbor-joiningmethod算法繪制基于全基因組和ORF2序列的系統發育樹[16];使用RDP5.0分析基因重組事件[17];使用DNASTAR MegAlign分析序列相似性;使用TMHMM預測Cap跨膜區域;使用SignalP 5.0預測Cap信號肽;獲取Cap抗原表位信息[18],使用在線工具(www.novopro.cn/tools/color_align_prop.html)比對Cap抗原表位差異。

1.2.5 病毒分離和毒價測定 病毒分離:取“1.2.1”的上清液,經孔徑0.22 μm的濾器過濾后,按體積比1∶4同步接種PK-15細胞懸液,培養至細胞長成單層;使用300 mmol·L-1D-氨基葡萄糖孵育30 min,換2% FBS DMEM,繼續培養48～72 h,-80 ℃反復凍融3次后,4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min,取上清即為病毒液。

毒價測定:將病毒液作連續10倍稀釋(10-1～10-10);按照每孔100 μL加到96孔細胞培養板,每個稀釋度作一縱列;每孔加100 μL PK-15細胞懸液,使細胞量達到2×105～3×105個·mL-1;正常細胞對照作兩縱列(100 μL 10% FBS DMEM+100 μL細胞懸液);37 ℃ 5% CO2培養至細胞長成單層,使用300 mmol·L-1D-氨基葡萄糖溶液孵育30 min,換用2% FBS DMEM繼續培養48～72 h,使用間接免疫熒光試驗(IFA)確定陽性孔(未保護)和陰性孔的數量(保護);按Reed-Muench法計算50%細胞感染量(TCID50)。lgTCID50=高于50%感染率的血清稀釋度的對數+距離比例×稀釋度對數的差,距離比例=(高于50%的感染率-50%)/(高于50%的感染率-低于50%的感染率)。

1.2.6 間接免疫熒光試驗(IFA) 取病毒液同步接種PK-15細胞,培養至細胞長至單層,使用300 mmol·L-1D-氨基葡萄糖孵育30 min,換用2% FBS DMEM繼續培養48 h;吸棄培養基,用PBS洗2次;加入100 μL·孔-1的預冷無水乙醇,-20 ℃靜置30 min,棄去固定液,PBS洗3次,5 min·次-1;加入100 μL·孔-11∶500稀釋的PCV2豬多克隆抗體,37 ℃孵育1 h,PBS洗3次,5 min·次-1;加入100 μL·孔-11∶200稀釋的FITC標記兔抗豬IgG抗體,37 ℃孵育1 h,PBS洗3次,5 min·次-1;加入50～100 μL·孔-1PBS,使用倒置熒光顯微鏡觀察熒光信號。

1.2.7 Cap蛋白表達 回收BamHⅠ-2Cap127/HindⅢ-2Cap663Cap引物的擴增產物,連接pMD-18 T載體,轉化到DH5α化學感受態細胞,經抗生素篩選和PCR鑒定挑選陽性菌落;擴大培養后,提取質粒pMD-18 T-2Cap;使用BamHⅠ和HindⅢ酶切質粒pMD-18 T-2Cap和pET-28a;使用T4 DNA連接酶連接2Cap和pET-28a;轉化到BL21(DE3)化學感受態細胞,經抗生素篩選、PCR鑒定和基因測序挑選陽性菌落。將陽性菌接種于LB液體培養基,培養至OD值0.5左右,加入1.0 mmol·L-1IPTG,37 ℃誘導4 h,10 000 r·min-130 min收集菌體,經高壓破碎,收集包涵體和破碎上清,使用His標簽蛋白瓊脂糖高速純化樹脂純化Cap蛋白,使用SDS-PAGE和Western blot檢測Cap蛋白表達情況。

1.2.8 小鼠免疫試驗 將100 μg Cap和弗氏完全佐劑等體積乳化混勻,經皮下注射到小鼠頸背部;3周后,將100 μg Cap和弗氏不完全佐劑等體積混勻乳化后,經皮下注射到小鼠頸背部;每周通過尾靜脈采集小鼠的血液并分離血清。

1.2.9 血清中和病毒試驗 固定病毒-稀釋血清法(使用IFA評價):將病毒原液稀釋成含200 TCID50·0.1 mL-1;將血清56 ℃滅活30 min,在96孔板中作連續2倍稀釋(50 μL血清+50 μL 10% FBS DMEM),每個稀釋度作4孔;再加50 μL病毒液,混勻,37 ℃孵育60 min;同時設待檢血清毒性對照,陰、陽性血清對照,病毒對照和正常細胞對照;每孔加入100 μL PK-15細胞懸液,培養至細胞長成單層,使用300 mmol·L-1D-氨基葡萄糖溶液孵育30 min,換用2% FBS DMEM,繼續培養48 h,使用IFA確定陽性孔(未保護)和陰性孔的數量(保護);按Reed-Muench兩氏法計算中和效價(PD50)。lgPD50=高于50%保護率的血清稀釋度的對數+距離比例×稀釋度對數的差,距離比例=(高于50%的保護率-50%)/(高于50%的保護率-低于50%的保護率)。

血清抑制PCV2試驗(使用qPCR評價):將100 μL 1/8稀釋的血清與100 μL PCV2(200 TCID50)混合,37 ℃孵育60 min;同時設待陰性血清對照,病毒對照和正常細胞對照;每孔加入100 μL PK-15細胞懸液,培養至細胞長成單層,使用300 mmol·L-1D-氨基葡萄糖溶液孵育30 min,換用2%FBS DMEM,繼續培養48 h,使用qPCR檢測各組細胞中的PCV2載量。

2 結 果

2.1 臨床樣品中PCV2的PCR檢測

以病豬的淋巴結、肺和腎DNA為模板,使用基因片段檢測引物494-F/494-R和全基因組檢測引物SacⅡ-PCV2-F/SacⅡ-PCV2-R進行PCR擴增,結果表明,在約494處和1 767 bp處均出現特異性條帶,證明病豬組織存在PCV2感染。將該柱PCV2命名為PCV2 XY2022,GenBank登錄號為OM249 965.1。

2.2 PCV2 XY2022毒株的分離和鑒定

將陽性組織混合、勻漿、凍融、離心和過濾除菌后,取上清液接種PK-15細胞,并連續傳代培養。提取傳代培養物DNA,使用引物SacⅡ-PCV2-F/SacⅡ-PCV2-R進行PCR擴增,均能擴增到1 767 bp左右的特異性條帶(圖1a),說明XY2022毒株能在PK-15細胞上穩定傳代。

a. PCV2 XY2022傳代的PCR鑒定[M.DL2000 DNA相對分子質量標準;N1～N3. 陰性對照(PBS、DMEM、未感染的PK-15細胞);P. 陽性對照-PCV2WH;1～6. 第3、6、9、12、15、18代XY2022病毒液];b. PCV2 XY2022的間接免疫熒光檢測a. PCR results of PCV2 XY2022 strain in different generations (M. DL2000 DNA marker; N1-N3. Negative control (PBS, DMEM, non-infected PK-15 cells); P. Positive control-PCV2WH; 1-6. The 3rd, 6th, 9th, 12th, 15th and 18th generations of PCV2XY2022); b. IFA results of PK-15 cells infected with PCV2 XY2022 strain圖1 PCV2 XY2022毒株的PCR和IFA鑒定Fig.1 PCR and IFA detection of PCV2 XY2022 strain

將第12代病毒液接種PK-15細胞,在第60小時使用IFA檢測感染情況,發現XY2022和陽性對照毒株PCV2WH均產生特異性熒光,而未接種病毒的細胞無特異性熒光,說明XY2022毒株在PK-15細胞上有效增殖(圖1b)。經IFA測定,XY2022的毒價為105.70TCID50·mL-1。

2.3 XY2022的基因組序列比對和遺傳進化分析

全基因組測序結果顯示,XY2022全基因組長度為1 767 nt,ORF2基因長度為705 nt。基于全基因組和ORF2的進化分析結果均表明,XY2022屬于PCV2d基因亞型毒株,與廣西毒株(GenBank號:FJ426398.1)的親緣關系最近(圖2)。

圖2 PCV2 XY2022毒株的進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of PCV2 XY2022 strain

基于全基因組的核苷酸序列同源性分析顯示,XY2022和參考毒株的相似性為94.3%～99.8%,與廣西毒株(GenBank號:FJ426 398.1)的相似性最高,達到99.8%。基于ORF2的核苷酸序列同源性分析顯示,XY2022和參考毒株的相似性為89.2%～99.6%,與廣西毒株(GenBank號:FJ426398.1)和黑龍江毒株(GenBank號:HM038031.1)的相似性最高,均為99.6%。

基于RDP5.0多種算法(RDP、P≤1.121×10-27;GENECONV,P≤2.441×10-25;Maxchi,P≤1.125×10-13;Chimaera,P≤5.111×10-15;SiSscan,P≤2.409×10-16;3Seq,P≤1.374×10-35)的基因重組分析結果顯示,XY2022與參考毒株不存在基因重組事件。

2.4 XY2022 Cap氨基酸序列比對和抗原表位分析

根據文獻報道[18],Cap蛋白的第65-77、113-139、169-183和193-207位aa是其線性免疫優勢區,第47-63、165-200和230-233位aa是其構象中和表位,第156-162、175-192、195-202和231-233位aa是其線性中和表位,第110、191位aa是PCV2毒力調節關鍵位點。XY2022 Cap和參考毒株Cap的氨基酸序列比對結果表明,XY2022 Cap氨基酸序列存在多個變異度較高的區域,分別是47-78、130-136和185-210位aa;線性免疫優勢區的68位aa由A突變為N、134位aa由T突變為N,構象中和表位的63位aa由S突變為R。此外,相比于PCV2a和PCV2b,PCV2d、PCV2c和部分PCV2e的Cap羧基端多1個K殘基(圖3)。

2.5 XY2022 Cap蛋白的表達和純化

表達XY2022 Cap和PCV2b(WH)Cap的高變區和抗原表位突變位點所在區域,SDS-PAGE結果表明,該蛋白大小約26 ku,在細菌包涵體和破碎上清中均可穩定表達(圖4a)。使用His標簽蛋白瓊脂糖高速純化樹脂純化Cap蛋白,獲得單一條帶的XY2022 Cap(圖4b)和WH Cap(圖4c)。進一步Western blot檢測發現,純化的蛋白與His抗體以及PCV2 Cap蛋白抗體均可特異性結合,表明純化的蛋白具有良好的生物學活性(圖4d)。

a. SDS-PAGE檢測Cap蛋白的表達(M. 蛋白質相對分子質量標準;1. 包涵體中的XY2022 Cap蛋白;2. 細菌破碎上清中的XY2022 Cap蛋白;3. 包涵體中的WH Cap蛋白;4. 細菌破碎上清中的WH Cap蛋白);b. SDS-PAGE檢測純化的XY2022 Cap蛋白(M. 蛋白質相對分子質量標準;1～3. Ni填料結合后洗脫的XY2022 Cap蛋白);c. SDS-PAGE檢測純化的WH Cap蛋白(M. 蛋白質相對分子質量標準;1～3. Ni填料結合后洗脫的WH Cap蛋白);d. Western blot檢測純化的XY2022 Cap蛋白和WH Cap蛋白(1. XY2022 Cap蛋白;2. WH Cap蛋白)a. Detection of Cap protein expression by SDS-PAGE (M. Protein marker; 1. XY2022 Cap protein in inclusion bodies; 2. XY2022 Cap protein in bacterial lysis supernatant; 3. WH Cap protein in inclusion bodies; 4. WH Cap protein in bacterial lysis supernatant); b. Detection of the purified XY2022 Cap by SDS-PAGE (M. Protein marker; 1-3. XY2022 Cap protein elution after Ni-NTA binding); c. Detection of the purified WH Cap by SDS-PAGE (M. Protein marker; 1-3. WH Cap protein elution after Ni-NTA binding); d. Detection of the purified XY2022 Cap and purified WH Cap by Western blot (1. Purified XY2022 Cap; 2. Purified WH Cap)圖4 XY2022 Cap和WH Cap的表達和純化Fig.4 expression and purification of XY2022 Cap and WH Cap

2.6 XY2022 Cap的小鼠免疫原性評價

為了評價抗原表位差異對PCV2 Cap免疫原性的影響,分別使用PCV2b(WH)Cap和PCV2d(XY2022)Cap免疫小鼠,使用IFA測定小鼠血清中和效價。結果表明,中和抗體最早在免疫后第3周可被檢測到,并逐周升高,在免疫后第6周達到最高,其中WH Cap和XY2022 Cap誘導的針對XY2022毒株的中和效價最高達到26.66和25.66(圖5a),即:1/26.66稀釋的WH Cap免疫血清可通過中和作用殺滅或抑制XY2022,保護50%的細胞免于被感染;1/25.66稀釋的XY2022 Cap免疫血清可通過中和作用殺滅或抑制XY2022,保護50%細胞免于被感染。WH Cap和XY2022 Cap誘導的針對WH毒株的中和效價最高達到26.33和26.17(圖5b)。免疫后第7周,WH Cap誘導的中和效價水平均顯著降低,而XY2022 Cap誘導的中和抗體水平仍保持穩定,說明WH Cap和XY2022 Cap均能誘導動物機體產生中和抗體,但是XY2022 Cap誘導的中和抗體水平相對穩定。

a. XY2022 Cap和WH Cap免疫小鼠血清針對XY2022的中和抗體水平;b. XY2022 Cap和WH Cap免疫小鼠血清針對PCV2WH的中和抗體水平;c. XY2022 Cap和WH Cap免疫小鼠血清抑制PCV2感染活性的qPCR檢測結果,ns.P>0.05a. Levels of neutralizing antibodies against XY2022 strains in sera from XY2022 Cap immunized mice and WH Cap immunized mice; b. Levels of neutralizing antibodies against PCV2WH strains in sera from XY2022 Cap immunized mice and WH Cap immunized mice; c. qPCR results of anti-PCV2 activity in sera from XY2022 Cap immunized mice and WH Cap immunized mice,ns.P>0.05,***圖5 PCV2b Cap和PCV2d Cap免疫小鼠血清的抗PCV2活性Fig.5 Anti-PCV2 activity in sera of mice immunized with PCV2b Cap and PCV2d Cap

另一方面,通過qPCR評價血清抑制PCV2感染的效果發現,相比于非處理組和PBS免疫小鼠血清組,WH Cap和XY2022 Cap免疫小鼠血清和PCV2共孵育再感染PK-15細胞,可顯著降低細胞中PCV2的載量(圖5c),表明兩種血清中和抗體均能有效殺滅PCV2,抑制PCV2感染PK-15細胞。后續將繼續分離新型PCV2毒株,評估其Cap蛋白的免疫原性,測定其中和抗體抑制不同基因型PCV2的效果。

3 討 論

自1998年首次被報道以來[19],PCV2快速成為養豬業最流行的病原之一,造成巨大經濟損失并持續威脅生豬產業健康發展[20]。作者團隊以及其他相關研究表明,湖北省規模化豬場的PCV2檢出率高居不下,近年來一直維持在38%以上[21-22]。本研究中,作者在湖北省某規模化豬場發現疑似PMWS的仔豬,通過PCR等技術檢測其PCV2感染情況,結合豬場后續的用藥治療情況,證明導致該場仔豬發病的病原為PCV2。

PCV2基因組突變頻率高,導致我國PCV2流行毒株經歷了PCV2a向PCV2b,2009年后向PCV2d轉變的快速過程[1,11,21]。因此,持續監測各個省份的PCV2流行情況并分離新型毒株對于相關疾病的防控具有重要意義。本研究中,作者發現引起湖北省某規模場仔豬發病的病原為PCV2,并通過基于全基因組和ORF2的進化分析證明其屬于PCV2d基因亞型,這與國內近年來的流行病學報道以及作者團隊監測結果[1,11]是相符的。該PCV2與各基因型參考毒株的全基因組相似性為94.3%～99.8%,ORF2基因相似性為89.2%～99.6%,與廣西毒株(GenBank號:FJ426 398.1)和黑龍江毒株(GenBank號:HM038 031.1)的相似性最高,推測其可能源于各省之間的生豬流通和豬肉產品交易。作者進一步使用豬腎上皮細胞系PK-15分離出該PCV2d毒株,將其命名為XY2022,并將其序列上傳GenBank獲得登錄號OM249965.1。PCR和IFA檢測結果均證明,XY2022在PK-15細胞上具有穩定的增殖性能,毒價可達到105.70TCID50·mL-1,為后續的PCV2致病性研究和疫苗開發提供關鍵材料。

現階段基于PCV2a和PCV2b的商品化疫苗以及基于Cap蛋白的亞單位疫苗仍能為豬群提供抗PCV2a、PCV2b和PCV2d毒株的保護力[11,23-25]。但是,不同基因型之間的保護力并不完全,PCV2d感染仔豬可導致更重的臨床癥狀和更早的排毒現象[13-14]。本研究中,作者比較了XY2022和其他基因型毒株的Cap蛋白差異,發現不同基因型毒株的Cap蛋白氨基酸殘基數目有所差異,其中PCV2a、PCV2b和PCV2c的氨基酸殘基數量為233,PCV2d的氨基酸殘基數為234,這與已報道結果一致[14]。另一方面,Cap蛋白有4個優勢抗原表位,分別是65—87aa、113—139aa、169—183aa和少量的羧基端氨基酸殘基,其中169—183位表位為誘餌表位,導致動物機體產生針對PCV2的非中和抗體[26-27]。PCV2d Cap相比于PCV2a Cap,有23個氨基酸殘基突變,造成抗原表位構象改變,可能導致PCV2病毒粒子逃避宿主的免疫清除[28],但其并未通過體內試驗證明該假設。在本研究中,作者比對了XY2022 Cap和PCV2b Cap之間的抗原表位差異,發現XY2022 Cap存在多個高變異度區域,分別是47—78、130—136和185—210位aa,并且線性免疫優勢區的68位aa由A突變為N、134位aa由T突變為N,構象中和表位的63位aa由S突變為R,這些可能是造成不同基因型PCV2之間保護力差異的關鍵位點。因此,作者通過原核表達系統表達了含有差異位點的XY2022(2 d)Cap和WH(2b)Cap,并通過免疫小鼠制備相應陽性血清。通過IFA和qPCR試驗評估血清的中和效價和抗病毒感染效果,發現2b和2d亞型PCV2的Cap均能有效刺激小鼠機體產生抗PCV2感染的中和抗體,但兩者誘導中和抗體的水平稍有差異,XY2022 Cap誘導的中和抗體水平相對穩定,說明2b Cap和2 d Cap抗原表位的氨基酸差異并不能顯著改變血清中和抗體水平,提示現有基于PCV2a和2b亞型的疫苗仍能有效抵抗PCV2流行毒株感染,但PCV2d疫苗具有更好的臨床應用效果。持續分離流行毒株,研究其致病力和免疫原性,仍舊是未來防控PCV2相關疾病的關鍵。

4 結 論

本研究發現PCV2是導致湖北省某規模豬場PMWS的病原,并成功分離該毒株,將其命名為XY2022(GenBank登錄號:OM249965.1);XY2022屬于PCV2d,相較于其他基因型毒株,其Cap的線性免疫優勢區、線性中和表位和構象中和表位均存在差異位點;XY2022 Cap和WH(2b) Cap均能誘導小鼠產生抗PCV2感染的中和抗體,且XY2022 Cap誘導的中和抗體水平更穩定。