非洲豬瘟病毒P30蛋白的表達及抗體液相芯片檢測方法的建立

張芳源,楊大為,仇德洋,姜國騫,李桂梅,2,3*,單 虎,2,3

(1.青島農業大學動物醫學院,青島 266109;2.山東省新獸藥創制協同創新中心,青島 266109;3.山東省獸藥診斷試劑工程技術研究中心,青島 266109)

非洲豬瘟 (African swine fever, ASF) 又稱疣豬疫,是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一種急性、出血性且具有嚴重危害的傳染病,其臨床癥狀和病理變化與急性豬瘟相類似,病程短,死亡率高達100%[1-2],世界動物衛生組織將其列為必須報告的動物疫病,我國將該病列為一類動物疫病。1921年,在非洲地區首次發現非洲豬瘟病毒,一直僅限于非洲地區流行;到1957年,在歐洲的葡萄牙被發現,開始了在歐洲地區的流行;2007年該病在高加索地區暴發,并很快侵入俄羅斯[2-4]。直至2018年,我國首例非洲豬瘟在遼寧省出現[5-6],隨后在全國多個省份蔓延,給我國養豬業乃至整個社會經濟造成了巨大的損失。非洲豬瘟病毒傳播迅速,傳播途徑廣,目前尚沒有研制出對應的疫苗,只有及時的診斷,才能遏制此病毒的傳播。

ASFV是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員,是一種以雙鏈DNA為遺傳物質的蟲媒病毒[7]。非洲豬瘟病毒粒子直徑為250～300 nm,基因組長為170～194 kb,病毒粒子基因組和核蛋白形成病毒核心部分[8-9]。成熟的病毒粒子能夠表達50種以上的結構蛋白,P30蛋白是ASFV的內囊膜蛋白之一,也是最具抗原性的蛋白之一,由CP204L基因編碼,常在感染后的2～4 h表達,12 h后合成減少,能誘導中和抗體的產生,在整個感染期都能檢測到,是ASFV重要的結構蛋白[10]。

為更好地防控非洲豬瘟,開展非洲豬瘟相關檢測技術尤為重要。目前針對非洲豬瘟病毒最常用的血清學檢測手段是酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA),如張錦等[11]、徐黎暉等[12]和于學祥等[13]用P30蛋白作為抗原建立了間接ELISA檢測方法,但ELISA不能同時大量檢測多種病原, 難以滿足高通量檢疫的要求。液相芯片技術[multi-analyte profiling solve for unknown x (xMAP) technology]作為一種新型的檢測技術,具有高通量、多靶標、靈敏度高、特異性好等諸多優勢,該技術操作簡單、應用靈活,可以同時對不同的指標進行檢測,迄今為止,全球已有數百套液相芯片技術用于蛋白質、核酸等檢測[14-15]。

本研究將P30蛋白作為抗原,建立并優化了ASFV液相芯片檢測方法,以期用于ASFV的血清學檢測及評估機體感染后體內的抗體水平。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體和血清

大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞,購自天根生化科技有限公司;大腸桿菌DH5α感受態細胞,購自TaKaRa生物技術有限公司;原核表達載體pET-28a由本實驗室保存并提供;非洲豬瘟標準陽性血清購自中國獸醫微生物菌種保藏中心;32份無特定病原體(specific pathogen free,SPF)豬血清由哈爾濱獸醫研究所饋贈;塞內卡病毒(Seneca virus A,SVA)陽性血清、口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)陽性血清、20份非洲豬瘟陰性血清由本實驗室保存;92份未知豬血清來自山東各養殖場送檢樣本;豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)陽性血清、豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)陽性血清、水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)陽性血清和豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)陽性血清由云南海關饋贈。

1.2 主要試劑和試劑盒

質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司;IPTG購自上海藍季科技發展有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒和His標簽蛋白純化試劑盒(包涵體)購自北京康為世紀生物科技有限公司;T4 DNA連接酶、BamHⅠ限制性內切酶、XhoⅠ限制性內切酶均購自TaKaRa生物技術有限公司;綠色熒光核酸染料、尿素和生物素標記的羊抗豬IgG均購自北京索萊寶科技有限公司;Omni-EasyTM一步法 PAGE凝膠快速制備試劑盒(12.5%)購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司;Goat Anti-Pig IgG H&L(HRP)購自艾博抗(上海)貿易有限公司;生物素化的抗His的抗體(6X-His Tag Monoclonal Antibody, Biotin)購自美國Invitrogen公司;Bio-Plex偶聯試劑盒、Bio-Plex羧基磁珠、Bio-Plex檢測反應試劑盒、多肽氨基偶聯試劑盒均購自伯樂生命醫學產品(上海)有限公司;非洲豬瘟病毒ELISA抗體檢測試劑盒(P30)購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司。

1.3 目的基因的篩選和設計

根據GenBank發表的African swine fever virus isolate Pig/HLJ/2018(MK333 180.1)基因中的CP204L基因序列,進行序列分析和密碼子優化,由中美泰和生物有限公司合成和測序,構建pCold-TF-p30重組載體。

1.4 P30基因克隆及重組質粒的構建與鑒定

根據所合成的基因序列用SnapGene軟件設計引物進行PCR擴增,上游引物:5′-ATGGGTCGCG-GATCCGACTTTATCCT-3′(劃線部分為BamHⅠ酶切位點);下游引物:5′-GTGGTGCTCGAGTT-TCTTCTTCAGCAG-3′(劃線部分為XhoⅠ酶切位點),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

取上、下游引物各2 μL、p30基因模板4 μL、ddH2O 17 μL、Taq酶25 μL,充分混勻,按以下程序進行PCR反應:94 ℃預變性2 min;94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min,共30個循環;72 ℃延伸2 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后用膠回收試劑盒回收p30基因片段。

用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ對回收的p30基因片段和pET-28a載體進行雙酶切,經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后用膠回收試劑盒回收。用T4連接酶對回收的酶切產物連接過夜,連接產物轉化到DH5α大腸桿菌感受態細胞中,經菌液PCR和雙酶切鑒定后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序鑒定。

1.5 重組蛋白的誘導表達

將鑒定正確的pET-28a-p30重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中,涂板過夜培養,取生長良好的單菌落接種于含有卡那霉素的LB液體培養基中,過夜培養,待OD600 nm值達0.6～0.8之間加入IPTG至終濃度為1 mmol·L-1,并設置不加誘導劑的空白對照,繼續培養8 h后,4 ℃、12 000 r·min-1離心8 min,棄去上清,用1 mL PBS重懸菌體沉淀,離心、棄上清,1 mL PBS重懸菌體后再離心,最后用1 mL PBS重懸菌體沉淀。取一管重組載體誘導后的菌液在冰浴條件下進行超聲破碎,離心10 min取上清和沉淀,對所有樣品進行SDS-PAGE分析。

1.6 重組蛋白誘導表達的條件優化

1.6.1 IPTG誘導濃度的優化 將空載體菌液和重組菌液37 ℃、220 r·min-1培養至OD600 nm值達到0.6～0.8之間,不同搖菌管中加入IPTG的終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol·L-1,在37 ℃條件下,誘導表達8 h后,將樣品進行離心和重懸,進行SDS-PAGE鑒定分析。

1.6.2 誘導表達時間優化 將空載體菌液和重組菌液37 ℃、220 r·min-1培養至OD600 nm值達到0.6～0.8之間,在37 ℃條件下,加入相同終濃度的IPTG(1.0 mmol·L-1),在誘導表達3、6、9、12、22及24 h時間段分別拿出一管進行離心和重懸,將樣品進行SDS-PAGE鑒定分析。

1.7 重組蛋白的大量表達、純化及復性

取保種的菌液按1%的比例接入含有卡那霉素的液體培養基進行過夜復蘇,復蘇后按3%比例接入含有卡那霉素的液體培養基,培養至OD600 nm值達到0.6～0.8之間,在最佳誘導條件下進行大量表達,對表達后的菌液進行離心、重懸和超聲破碎,破碎后離心15 min,收集沉淀。將沉淀重懸于Binding Buffer(按照His蛋白純化試劑盒中的說明書配制)中,盡量混勻使包涵體充分溶解,4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min收集上清。按照BCA蛋白濃度測定試劑盒中的說明書測定濃度,以梯度洗脫的方式按照His標簽蛋白純化試劑盒中的說明書純化P30蛋白。收集流穿液、洗雜液和洗脫液,取樣并進行SDS-PAGE鑒定分析。

配制濃度分別為6、5、4、3、2、1、0 mol·L-1的尿素溶液,調pH至7.5并加入10%的甘油。將純化后的蛋白裝入透析袋,并將透析袋放入裝有尿素溶液的燒杯中,置于磁力攪拌器上,在4 ℃條件下從6 mol·L-1的濃度進行梯度透析,每隔2 h進行一次換液。透析結束后,將蛋白溶液取出4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min收集上清并進行SDS-PAGE鑒定分析和蛋白濃度測定。

1.8 重組蛋白Western blot分析

將透析后的重組P30蛋白和空載體誘導后的樣品經SDS-PAGE后轉移到PVDF膜上,轉膜后用1×TBST洗膜,泡入5%脫脂奶粉中封閉過夜;洗膜,用ASFV標準陽性血清作為一抗,按1∶1 000比例稀釋,4 ℃孵育過夜;洗膜,以Goat Anti-Pig IgG H&L(HRP)抗體作為二抗,按1∶10 000比例稀釋,室溫孵育1 h;洗膜,用ECL發光液進行顯色,用凝膠掃描成像系統觀察結果。

1.9 微球的活化及偶聯

將Bio-Plex偶聯試劑盒取出恢復室溫,將多肽氨基偶聯試劑盒取出室溫干燥1 h。取100 μL 54號微球(約1.25×106個)于包裹錫箔紙的偶聯反應管中。將裝有微球的偶聯反應管漩渦混勻,置于磁力架上靜置1 min,棄掉上清;加入100 μL微球清洗液,漩渦混勻30 s,置于磁力架上靜置1 min,棄掉上清;加入80 μL微球活化液,加入10 μL 50 mg·mL-1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC),然后迅速加入10 μL 50 mg·mL-1的N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS),室溫旋轉混合20 min。孵育完用PBS清洗兩遍微球,加入適量P30蛋白,用PBS定容至500 μL,4 ℃過夜孵育。次日,用PBS清洗一遍,加入100 μL微球封閉液,室溫旋轉混合30 min,將微球重懸于150 μL微球儲存液中,用細胞計數板計數,置于4 ℃保存。

1.10 偶聯效率驗證

取兩個包裹好錫箔紙的離心管分別加入10 000個上一步活化并偶聯后的微球,待測管加入50 μL稀釋好的生物素化抗His的抗體,陰性對照管加入50 μL抗體稀釋液,室溫旋轉混合30 min;置于磁力架上靜置1 min,棄掉上清,測試管加入50 μL稀釋好的藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)標記的鏈霉親和素(streptavidin-PE,SA-PE),陰性管加入50 μL的分析緩沖液,室溫避光孵育10 min。置于磁力架上靜置1 min,棄掉上清,用125 μL的儲存緩沖液重懸,加入96孔板上,上機檢測。

1.11 ASFV液相芯片檢測方法的建立

每孔加入5 000個偶聯成功的微球,用微球清洗液清洗后每孔加入50 μL稀釋好的陰、陽性血清,設置空白對照孔并做3組重復孔,室溫避光振蕩孵育1 h。將96孔板置于磁力架上靜置1 min棄掉上清,清洗微球后每孔加入50 μL稀釋好的生物素標記的羊抗豬IgG抗體,振蕩孵育30 min。棄掉上清、清洗微球,每孔加入50 μL稀釋好的SA-PE,振蕩孵育10 min。棄掉上清、清洗微球,每孔加入125 μL分析緩沖液,上機檢測。

1.12 最佳檢測條件優化

1.12.1 蛋白最佳偶聯濃度的確定 按照“1.9”的方法,每孔分別加入6、8、10、12 μg的蛋白與微球偶聯。按照“1.10”的方法,對偶聯的微球進行效率驗證,按照平均中值熒光強度(median fluorescence intensity,MFI)值高低確定蛋白最佳偶聯濃度。

1.12.2 最佳血清稀釋度和最佳二抗稀釋度的確定 按照1.10的方法,加入最佳蛋白濃度偶聯的微球,利用棋盤法檢測在不同血清稀釋度(1∶100、1∶200、1∶400和1∶800)和不同二抗濃度(0.5、1.0、2.0、4.0 μg·mL-1)下的MFI值,每孔做三組重復,用陽性孔平均MFI值(P)/陰性孔平均MFI值(N)的計算方法得出最佳血清稀釋度和最佳二抗稀釋度。

1.13 閾值的確定

閾值也稱為截止值,定義為陰性平均值加3倍的方差(SD)。為了確定ASFV抗體液相芯片檢測方法的閾值,對32份SPF豬血清和20份ASFV陰性血清按照最佳檢測條件進行測定,每孔做3組重復。

1.14 靈敏性試驗

對ASFV陽性血清和陰性血清,從1∶100到1∶25 600進行倍比稀釋,用已建立的ASFV抗體液相芯片檢測方法進行檢測,每孔做3組重復,通過測定的MFI值與閾值比較,判斷該方法的靈敏性。

1.15 特異性試驗

用已建立起來的ASFV抗體液相芯片檢測方法分別檢測ASFV陽性血清、SVA陽性血清、FMDV陽性血清、TGEV陽性血清、CSFV陽性血清、VSV陽性血清以及PRRSV陽性血清,判斷該方法的特異性。

1.16 重復性試驗

為確定該方法的可重復性,用已建立起來的ASFV抗體液相芯片檢測方法分別檢測兩份ASFV陽性血清和3份ASFV陰性血清,分別做3次批間和3次批內試驗。

1.17 符合率試驗

利用本試驗建立的ASFV抗體液相芯片檢測方法和購買的ASFV酶聯免疫分析試劑盒對實驗室保存的92份未知血清進行檢測,進行對比,計算符合率。

2 結 果

2.1 重組質粒的構建和鑒定

用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ對回收的p30基因片段和pET-28a載體進行雙酶切,用T4連接酶對回收的酶切產物連接過夜,連接產物轉化到DH5α大腸桿菌感受態細胞中,經菌液PCR和雙酶切鑒定后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序鑒定。雙酶切結果顯示,載體片段為5 335 bp、目的片段大小為579 bp(圖1),符合預期結果,證明重組質粒pET-28a-p30構建成功。

M. DL10000 DNA相對分子質量標準; 1. pET-28a空載體; 2. pET-28a-p30M. DL10000 DNA marker; 1. pET-28a empty vector; 2. pET-28a-p30圖1 重組質粒pET-28a-p30的雙酶切鑒定結果Fig.1 Restriction digestion of recombinant plasmid pET-28a-p30

2.2 ASFV 重組P30蛋白的誘導表達及可溶性分析

將鑒定正確的pET-28a-p30重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中,經IPTG誘導表達之后,對誘導前后的空載體菌液、重組載體菌液以及超聲破碎后的上清和沉淀取樣進行SDS-PAGE鑒定分析。結果顯示,重組載體菌液泳道約在30 ku處有一條差異性條帶(圖2),與ASFV 重組P30蛋白大小相符,證明ASFV P30蛋白初步表達成功;目的蛋白在沉淀中大量表達,說明蛋白為包涵體表達。

M. 蛋白質分子質量標準;1. 未誘導表達的空載體;2. 誘導表達的空載體;3. 未誘導表達的重組菌;4. 誘導表達的重組菌;5. 誘導表達的重組菌超聲上清;6. 誘導表達的重組菌超聲沉淀M. Protein molecular weight standard; 1. Empty vector without induced expression; 2. Empty vector with induced expression; 3. Recombinant bacteria without induced expression; 4. Induced expressed recombinant bacteria supernatant; 5. Induced expressed recombinant bacteria with ultrasonic supernatant; 6. Induced expressed recombinant bacteria with ultrasonic precipitation圖2 重組菌誘導表達及可溶性分析Fig.2 Recombinant bacteria expression and solubility

2.3 ASFV 重組P30蛋白最佳誘導表達條件的優化

將空載體菌液和重組菌液培養至對數生長期,不同搖菌管中加入IPTG的終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol·L-1,誘導表達8 h。結果顯示,IPTG濃度在1.0 mmol·L-1時表達量最高。

將空載體菌液和重組菌液培養至對數生長期,加入相同終濃度的IPTG(1.0 mmol·L-1),誘導表達3、6、9、12、22及24 h。結果顯示,誘導表達12、22和24 h蛋白表達量較高,選擇22 h作為最佳誘導時間。

2.4 ASFV 重組P30蛋白的純化及復性

以梯度洗脫的方式,按照His標簽蛋白純化試劑盒中的說明書純化P30蛋白,收集流穿液、洗雜液和洗脫液,取樣并進行SDS-PAGE鑒定分析。結果顯示,蛋白在流穿液里損失較少,在洗脫液里大量收集,并有較好的純化效果(圖3A、B)。將蛋白用透析袋按梯度復性后,取樣進行SDS-PAGE鑒定分析。結果顯示,蛋白成功復性(圖4)。

M. 蛋白質相對分子質量標準;1.流穿液1;2. 流穿液2;3. 洗雜液;4～5. 咪唑濃度為50 mmol·L-1的洗脫液1和2;6～7. 咪唑濃度為100 mmol·L-1的洗脫液1和2;8～9. 咪唑濃度為150 mmol·L-1的洗脫液1和2;10～11. 咪唑濃度為200 mmol·L-1的洗脫液1和2;12～13. 咪唑濃度為250 mmol·L-1的洗脫液1和2;14～15. 咪唑濃度為400 mmol·L-1的洗脫液1和2;16. 純化前的蛋白溶液M. Protein molecular weight standard; 1. Flow through liquid 1; 2. Flow through liquid 2; 3. Wash fluid; 4-5. Eluents 1 and 2 with imidazole concentration of 50 mmol·L-1; 6-7. Eluents 1 and 2 with imidazole concentration of 100 mmol·L-1; 8-9. Eluent 1 and 2 with imidazole concentration of 150 mmol·L-1; 10-11. Eluent 1 and 2 with imidazole concentration of 200 mmol·L-1; 12-13. Eluent 1 and 2 with imidazole concentration of 250 mmol·L-1; 14-15. Eluents 1 and 2 with imidazole concentration of 400 mmol·L-1; 16. Protein solution before purification圖3 重組P30蛋白的純化Fig.3 Purification of recombinant P30 protein

M. 蛋白質相對分子質量標準;1.復性前;2. 透析液;3. 復性后M. Protein molecular weight standard; 1. Before renaturation; 2. Dialysate; 3. After renaturation圖4 重組P30蛋白復性Fig.4 Renaturation of recombinant P30 protein

2.5 ASFV 重組P30蛋白免疫反應性鑒定

用透析后的重組P30蛋白和空載體誘導表達后的樣品進行Western blot試驗,ASFV標準陽性血清作為一抗,Goat Anti-Pig IgG H&L(HRP)抗體作為二抗,判定透析后的重組P30蛋白的反應原性。結果顯示,透析后的重組P30蛋白與ASFV標準陽性血清特異性結合,空載體誘導表達后未出現特異性條帶(圖5),證明純化后的重組P30蛋白有良好的反應原性。

M. 蛋白質相對分子質量標準;1. 透析后的重組P30蛋白;2. 誘導表達后的空載體M. Protein molecular weight standard; 1. Dialyzed recombinant P30 protein; 2. Empty vector with induced expression圖5 重組P30蛋白的Western blot鑒定Fig.5 Western blot analysis of recombinant P30 protein

2.6 偶聯效率驗證

對重組P30蛋白和54號微球的偶聯進行驗證。結果顯示,偶聯微球的MFI值為4 968,陰性對照孔的MFI值為36(根據說明書上所述,偶聯MFI值大于2 000、陰性孔小于100判定為成功),證明重組P30蛋白與54號微球偶聯成功。

2.7 ASFV液相芯片檢測方法的建立

用偶聯成功的微球檢測ASFV標準陰、陽性血清,每孔做三組重復,上機檢測。結果顯示,陽性孔平均MFI值為11 381.3,陰性孔平均MFI值為84.7(圖6),證明ASFV液相芯片檢測方法建立成功。

ASFV. 稀釋的ASFV陽性血清;NC. 稀釋的ASFV陰性血清ASFV. Diluted ASFV positive serum; NC. Diluted ASFV negative serum圖6 陽性血清和陰性血清中值熒光強度檢測Fig.6 Detection of the median fluorescence intensity (MFI) of positive and negative sera

2.8 最佳檢測條件優化

分別用6、8、10、12 μg的蛋白與微球偶聯。對偶聯的微球進行效率驗證,結果顯示,偶聯蛋白濃度為每1.25×106個微球6 μg偶聯效果最佳(圖7)。利用棋盤法檢測在不同血清稀釋度和不同二抗濃度下的MFI值,用陽性孔平均MFI值(P)/陰性孔平均MFI值(N)的計算方法得出最佳血清稀釋度和最佳二抗濃度。結果顯示,血清稀釋度在1∶600、二抗稀釋度至1 μg·mL-1時為最佳(表1)。

表1 不同血清稀釋度和二抗濃度下P/N的值

PC. 陽性對照孔;NC. 陰性對照孔PC. Positive control hole; NC. Negative control hole 圖7 不同偶聯蛋白濃度的MFI值Fig.7 MFI values of different coupling protein concentrations

2.9 閾值的確定

為了確定ASFV抗體液相芯片檢測方法的閾值,對32份SPF豬血清和20份ASFV陰性血清按照最佳檢測條件進行測定(圖8)。通過計算得出,平均MFI值為418.9,方差為385.6,則ASFV檢測的閾值為1 575.7,大于此值為陽性,小于此值為陰性。

圖8 32份SPF豬血清和20份ASFV陰性血清的MFI值Fig.8 MFI values of 32 SPF pig sera and 20 ASFV negative sera

2.10 靈敏性試驗

對ASFV陽性血清和陰性血清倍比稀釋,用已建立的ASFV抗體液相芯片檢測方法進行檢測,通過測定的MFI值與閾值比較。結果顯示,當陽性樣品稀釋度為1∶25 600時檢測仍為陽性(圖9),證明該方法具有良好的靈敏性。

2.11 特異性試驗

用已建立起來的ASFV抗體液相芯片檢測方法分別檢測ASFV陽性血清、SVA陽性血清、FMDV陽性血清、TGEV陽性血清、CSFV陽性血清、VSV陽性血清以及PRRSV陽性血清。結果顯示,ASFV血清檢測為陽性,其他血清檢測均為陰性,且熒光值差異較大(圖10),證明該方法具有良好的特異性。

圖10 特異性試驗Fig.10 Specificity test

2.12 重復性試驗

為確定該方法的可重復性,用已建立起來的ASFV抗體液相芯片檢測方法分別檢測兩份ASFV陽性血清和三份ASFV陰性血清,分別做3次批間和3次批內試驗。結果顯示,批內和批間的變異系數均小于10%(表2),證明該方法具有良好的重復性。

PC. 陽性對照;NC. 陰性對照PC. Positive control; NC. Negative control 圖9 血清不同稀釋度下的檢測結果Fig.9 Detection results of sera at different dilutions

2.13 符合率試驗

利用本試驗建立的ASFV抗體液相芯片檢測方法和購買的ASFV酶聯免疫分析試劑盒對實驗室保存的92份未知血清進行檢測。兩種方法的相對靈敏度為100%(15/15),相對特異性為90.9%(70/77),總符合率為92.39%[(15+70)/92](表3)。

表3 符合率試驗

3 討 論

非洲豬瘟自1921年被發現以來,對全世界養豬業造成了嚴重的經濟損失,雖然近年來對于ASFV的防控已經有所成效,但在商品化的疫苗研制出之前,對于ASFV的防控大多都是增強機體免疫力、加強飼養管理、強化豬場生物安全建設以及早期發現及時屠宰等措施[16],所以對ASFV及時診斷的研究顯得尤為重要。

液相芯片技術又稱懸浮芯片技術,是將熒光編碼微球技術、激光分析技術、流式細胞技術、高速數字信號處理技術及計算機運算法則等多項最新科技成果有機整合到一起的高通量檢測技術[17]。區別于常用的固相載體反應方法,液相芯片技術采用更接近生物系統的液相反應體系,并且利用不同熒光編碼的微球,達到對一個樣品的多重檢測和分析,具有高通量、反應快、靈敏度高、特異性強、樣本用量少、費用較低等優點[17-19]。在醫學領域,液相芯片受到廣泛使用,Kuriakose等[20]建立了可同時快速檢測所有禽流感病毒(AIV)以及H5、H7、N1和N2亞型的液相芯片檢測技術;Akhras等[21]設計了區分10種人乳頭瘤病毒基因型的模型試驗,結果顯示與擴增子焦磷酸檢序對比,所建立的方法敏感性更強,可以檢測兩個附加的共感染;在腫瘤標志物的科學研究和臨床診斷方面也有應用[22]。現如今,在動物疫病的診斷與研究方面,液相芯片技的應用也愈加成熟[23-24]。Karanikola等[25]建立了牛糞桿菌和肝片吸蟲的抗體液相芯片檢測技術,顯示了較高的靈敏性和特異性;Wang等[26]對藍舌病病毒(bluetongue virus,BTV)、流行性出血熱病毒(epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)、西尼羅病毒(West Nile virus,WNV)等十種蟲媒病原體建立了液相芯片檢測技術;李云峰等[27]針對基孔肯雅熱(Chikungunya fever,CHIKF)、克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimea Congo hemorrhagic fever virus,CCHFV)和裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus,RVFV)建立多重液相芯片檢測技術,其靈敏度是傳統RT-PCR技術的十倍以上。

本研究利用大腸桿菌原核表達系統成功表達得到ASFV 重組P30蛋白,大腸桿菌原核表達系統有操作簡單、表達量高等優點,盡管本試驗中重組P30蛋白以包涵體的形式表達,但經過純化、復性等步驟,使得雜蛋白含量大大減少,得到純度較好的重組P30蛋白。將P30蛋白與微球偶聯,成功構建了ASFV抗體液相芯片檢測方法,并針對蛋白偶聯濃度、血清稀釋度和二抗濃度等條件進行優化,更加完善了該方法。本研究建立的方法在標準陽性血清稀釋25 600倍下,仍能檢測出陽性,具有極高的靈敏性,遠遠高于建立的ASFV抗體ELISA檢測方法[11-12]。在與商品化ELISA試劑盒的符合率對比試驗中,總符合率可以達到92.39%,檢出的陽性樣本數高于商品化ELISA試劑盒所檢出的數目,這可能與該方法極高的靈敏性有關。目前,針對ASFV疫情的防控主要依賴于及時的診斷和無害化處理,本研究建立的ASFV抗體液相芯片檢測方法,利用P30蛋白作為抗原,能夠在感染早期作出及時診斷,有利于ASFV的及時防控;并且,液相芯片具有高通量的特點,能夠一次檢測出單一樣本中的多種病原體,這使得動物體疾病的檢測更加高效、便捷。

4 結 論

本研究利用原核表達系統成功表達重組P30蛋白,基于Luminex 200液相芯片檢測平臺,建立了ASFV抗體液相芯片檢測方法,具有良好的靈敏性、特異性和重復性,與商品化試劑盒對比,具有較高的符合率,可用于ASFV臨床樣品的檢測,為非洲豬瘟的防控技術提供了借鑒,也為今后多種豬病的液相芯片檢測技術的研究奠定了基礎。