兔斯氏艾美耳球蟲、腸艾美耳球蟲和大型艾美耳球蟲PCR檢測靶標(biāo)的篩選與單一、多重直接PCR檢測方法的建立

肖 潔,羅躍軍,陳 浩,蒲家艷,何 維,熊常明,郝 哥,任永軍,楊光友*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,成都 611130;2.四川省畜牧科學(xué)研究院,成都 610066;3.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610066;4.四川省岳池縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,岳池 638300)

兔球蟲病是由艾美耳科、艾美耳屬(Eimeriaspp.)球蟲寄生于家兔的腸道或者肝膽管上皮細(xì)胞內(nèi)所引起的一種寄生蟲病。該病流行于世界各地,各品種和各年齡階段的兔均易感,尤其對(duì)斷奶后至3月齡的幼兔危害最嚴(yán)重,可導(dǎo)致家兔生長速度和飼料轉(zhuǎn)化率降低,甚至引起死亡,給兔業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。兔球蟲的11種有效種中,斯氏艾美耳球蟲(Eimeriastiedae)和腸艾美耳球蟲(Eimeriaintestinalis)是分別寄生于兔肝和腸道的強(qiáng)致病性蟲種,同時(shí)也是我國流行的優(yōu)勢蟲種,常引起嚴(yán)重的兔球蟲病[1-3];而大型艾美耳球蟲(Eimeriamagna)具有中等致病力,在密集飼養(yǎng)兔群中最常見,也是感染我國各地兔群的優(yōu)勢蟲種[4-6]。

兔球蟲病的診斷主要根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和病理剖檢,結(jié)合糞便卵囊檢查進(jìn)行綜合判斷。準(zhǔn)確的鑒別兔球蟲種類尤其是強(qiáng)致病力蟲種是防治兔球蟲病的關(guān)鍵,但兔球蟲卵囊在蟲種間形態(tài)學(xué)差異不明顯,難以進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒別。近年來,國內(nèi)外學(xué)者已建立了用于檢測糞便中球蟲卵囊[7-10]和組織中蟲體[11]的PCR方法,然而這些方法都需進(jìn)行費(fèi)時(shí)昂貴的DNA抽提,且存在DNA丟失現(xiàn)象,對(duì)低強(qiáng)度感染或感染早期可能出現(xiàn)漏檢。直接PCR技術(shù)是一種新開發(fā)的檢測技術(shù),無需進(jìn)行DNA抽提,具有快速簡便的優(yōu)點(diǎn),已用于寄生蠕蟲[12-13]、原蟲[14]和媒介生物[15]的檢測。本研究通過測定斯氏艾美耳球蟲線粒體基因組全序列和3種兔球蟲頂質(zhì)體基因rpoB序列,對(duì)3種兔球蟲靶基因序列相似性分析篩選出特異和靈敏的靶基因,旨在建立能單獨(dú)或同時(shí)檢測兔斯氏艾美耳球蟲、腸艾美耳球蟲和大型艾美耳球蟲的直接PCR方法,以期為3種兔球蟲的流行病學(xué)調(diào)查、診斷和防控等提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和球蟲卵囊

試驗(yàn)動(dòng)物為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物寄生蟲病研究中心自繁自養(yǎng)的無球蟲新西蘭幼兔。

斯氏艾美耳球蟲卵囊從陽性兔的膽汁中分離獲得并由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物寄生蟲病研究中心傳代、保存。大型艾美耳球蟲卵囊、腸艾美耳球蟲卵囊均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)劉賢勇老師饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑、儀器

動(dòng)物組織直接PCR試劑盒購自成都福際生物有限公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、2×TaqPCR Master Mix、多重PCR擴(kuò)增試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;pMD19-T載體、DNA Marker購自大連寶生物工程有限公司。

PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀購自美國Bio Rad公司,DF-C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購自北京市六一儀器廠。KZ-II高速組織研磨儀購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 樣品采集和DNA裂解

用腸艾美耳球蟲(100個(gè)·只-1)和大型艾美耳球蟲(200個(gè)·只-1)孢子化卵囊分別感染3只30日齡的無球蟲幼兔,感染后收集卵囊孢子化培養(yǎng)后于4 ℃保存。取4 ℃保存的斯氏艾美耳球蟲、大型艾美耳球蟲和腸艾美耳球蟲卵囊各1×105個(gè),3 000 r·min-1離心10 min洗去重鉻酸鉀,保留沉淀備用。

為確保充分破碎,蟲體先經(jīng)液氮反復(fù)凍融5次后進(jìn)行研磨,根據(jù)動(dòng)物組織直接PCR試劑盒操作說明加入Buffer AL 100 μL、Foregene Protease 4 μL,65 ℃裂解30 min,緊接著95 ℃孵育5 min。孵育后,12 000 r·min-1離心5 min,收集上清液直接作為PCR反應(yīng)的模板。

120只30日齡健康無球蟲新西蘭兔隨機(jī)分為3組(n=40),分別人工感染斯氏艾美耳球蟲、大型艾美耳球蟲和腸艾美耳球蟲。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道分別在特定時(shí)間取3種球蟲裂殖體階段(n=7)和配子體階段(n=7)的肝和腸道組織樣品[11,16-17],于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｃ拷M余下26只兔達(dá)到排蟲期時(shí),對(duì)其進(jìn)行安樂死并收集腸道組織(n=13)與糞樣(n=13)保存?zhèn)溆谩＜S樣參照汪運(yùn)舟等[18-19]報(bào)道的方法,進(jìn)行飽和食鹽水濃集法富集糞樣中的卵囊。

1.4 檢測靶標(biāo)的篩選

艾美耳球蟲PCR檢測候選靶標(biāo)主要包括內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS1、ITS2)、線粒體基因(cytb、cox1、cox3)和頂質(zhì)體基因(rpoB)。從GenBank數(shù)據(jù)庫下載斯氏艾美耳球蟲(登錄號(hào):JQ328190)、腸艾美耳球蟲(登錄號(hào):JX406874)和大型艾美耳球蟲(登錄號(hào):JX406876)的ITS序列。

通過PCR方法測定斯氏艾美耳球蟲mtDNA,腸艾美耳球蟲、大型艾美耳球蟲和斯氏艾美耳球蟲的頂質(zhì)體基因(rpoB)。

1.4.1 斯氏艾美耳球蟲mtDNA全序列測定與分析 根據(jù)GenBank公布的6種兔艾美耳球蟲線粒體基因組全序列的保守片段設(shè)計(jì)5對(duì)引物P1、P2、P3、P4、P5(表1),采用分段克隆測序再拼接的方法對(duì)斯氏艾美耳球蟲線粒體基因組全序列進(jìn)行測定。反應(yīng)體系:2×TaqPCR Master Mix 25 μL、ddH2O 17.5 μL、DNA裂解液 2.5 μL、上、下游引物各2.5 μL,共計(jì)50 μL ;梯度PCR反應(yīng)條件:在94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,50～55 ℃退火30 s,72 ℃延伸80 s,共35個(gè)循環(huán),終延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,對(duì)檢測正確的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收純化,并將其連接到pMD19-T載體上,轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞,將菌液PCR鑒定陽性克隆送上海生工生物股份有限公司測序。

用軟件SeqMan7.1將測序結(jié)果和6種兔球蟲線粒體基因組全序列(腸艾美球蟲KP009592、無殘艾美耳球蟲KP025690、中型艾美耳球蟲KP025691、維氏艾美耳球蟲KP025692、黃艾美耳球蟲KP025693、大型艾美耳球蟲KF419217)進(jìn)行序列比對(duì)和拼接,得到斯氏艾美耳球蟲mtDNA全序列,利用DNAMAN6.0軟件和在線多序列比對(duì)工具Clustal(https:∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)分析。

1.4.2 3種兔球蟲頂質(zhì)體基因rpoB的測定與分析 參考田思勤等[20]報(bào)道的艾美耳球蟲rpoB擴(kuò)增引物(上游:5′-GCCCATATTTCCATTTCTCC-3′,下游:5′-GTGGTCGTTATGGAAATAAAGG-3′)和方法擴(kuò)增3種球蟲的rpoB基因。將檢測正確的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接到pMD19-T載體上,轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞,將菌液PCR鑒定陽性克隆送上海生工生物股份有限公司測序,測序結(jié)果用DNAMAN6.0軟件和在線多序列比對(duì)工具Clustal(https:∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)分析。

1.5 單一、多重直接PCR檢測方法的建立

根據(jù)3種兔球蟲篩選出的靶標(biāo)序列各設(shè)計(jì)兩對(duì)引物(表2)。每對(duì)引物經(jīng)單一直接PCR,選擇具有良好的特異性和敏感性引物進(jìn)行多重PCR檢測。同時(shí),對(duì)引物濃度、退火溫度以及反應(yīng)體系等進(jìn)行優(yōu)化。

表2 三種兔球蟲直接PCR檢測引物

由于組織樣本中含有大量宿主核酸,對(duì)多重直接PCR檢測結(jié)果的影響較大,因此本研究建立主要針對(duì)兔糞樣中球蟲卵囊的多重直接PCR檢測方法。按優(yōu)化后的反應(yīng)條件,以斯氏艾美耳球蟲卵囊、腸艾美耳球蟲卵囊、大型艾美耳球蟲卵囊DNA裂解液單獨(dú)或混合作為模板驗(yàn)證多重直接PCR的特異性;同時(shí)將含斯氏艾美耳球蟲、腸艾美耳球蟲、大型艾美耳球蟲卵囊各1×105個(gè)的DNA裂解液(共100 μL)進(jìn)行倍比稀釋,得到每1.5 μL中分別對(duì)應(yīng)3種球蟲各含50、5、0.5和0.25個(gè)卵囊DNA量的稀釋液,對(duì)多重直接PCR的敏感性進(jìn)行檢測。反應(yīng)體系:10×Multi HotStart Buffer 2.5 μL、Super Pure dNTPs 2 μL、Multi HotStart DNA Polymerase 0.5 μL、MgCl22 μL、混合引物 6 μL、DNA裂解液各0.5 μL、ddH2O 10.5 μL,共計(jì)25 μL;反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性15 min,94 ℃變性30 s,58 ℃退火90 s,72 ℃延伸90 s,共計(jì)40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié) 果

2.1 三種兔球蟲mtDNA、rpoB和ITS序列分析

2.1.1 斯氏艾美耳球蟲mtDNA序列分析 斯氏艾美耳球蟲mtDNA呈線性重復(fù)排列,全長6 277 bp(登錄號(hào):OQ427352),包括3個(gè)蛋白質(zhì)基因(cytb、cox1、cox3)和23個(gè)rRNA基因(圖1、圖2)。與腸艾美球蟲、無殘艾美耳球蟲、中型艾美耳球蟲、維氏艾美耳球蟲、黃艾美耳球蟲、大型艾美耳球蟲mtDNA序列相比,序列總體相似性為93.90%～97.45%;cytb位于128—1 207位,與上述其他6種球蟲cytb序列相似性為93.43%～97.78%,與此前上傳的斯氏艾美耳球蟲cytb序列(登錄號(hào):HQ173890)相似性100%;cox1位于1 241—2 683位,與其他6種球蟲相應(yīng)序列相似性為93.47%～98.87%;cox3位于4 298—5 053位,與其他6種球蟲相應(yīng)序列相似性為92.23%～96.98%。

2.1.2 3種兔球蟲頂質(zhì)體基因rpoB的測定與分析 斯氏艾美耳球蟲(登錄號(hào):OQ421116)、腸艾美耳球蟲(登錄號(hào):OQ421118)和大型艾美耳球蟲(登錄號(hào):OQ421117)頂質(zhì)體基因rpoB大小均為500 bp左右(圖略),經(jīng)測序分析三者序列相似性達(dá)93.93%～95.30%。

2.1.3 3種兔球蟲ITS序列分析 斯氏艾美耳球蟲(登錄號(hào):JQ328190)、腸艾美耳球蟲(登錄號(hào):JX406874)和大型艾美耳球蟲(登錄號(hào):JX406876)與其他兔球蟲(微型艾美耳球蟲KT361060、黃艾美耳球蟲JX406873、無殘艾美耳球蟲JX406875、中型艾美耳球蟲JX406877)ITS序列相似性很低,分別為35.10%～65.25%、44.61%～66.09%、44.75%～74.93%。

2.2 單一直接PCR檢測方法的建立

經(jīng)序列分析與篩選,ITS種內(nèi)保守和種間差異大,是良好的分子診斷標(biāo)識(shí)候選。基于3種兔球蟲ITS序列設(shè)計(jì)引物,根據(jù)每對(duì)引物單一直接PCR的結(jié)果,引物Ps1、Pi2、Pm2具有良好的特異性(圖3)和敏感性(圖4),引物Ps1、Pi2能檢測出相當(dāng)于1個(gè)卵囊DNA量的稀釋液,引物Pm2能檢測出相當(dāng)于0.5個(gè)卵囊DNA量的稀釋液,且三者的最佳退火溫度均為58 ℃。同時(shí),分別用上述建立的三種直接PCR方法對(duì)人工感染的組織和糞便樣本(三種兔球蟲樣品分別包括裂殖體階段樣本7份,配子體階段樣本7份,排蟲期組織和糞便樣本各13份)進(jìn)行檢測,可達(dá)到100%的檢出率(圖5～7)。因此,建立的三種單一直接PCR方法可用于患病死亡兔組織中球蟲核酸及糞樣中球蟲卵囊的檢測。

A. 基于斯氏艾美耳球蟲ITS的單一PCR(引物Ps1;M. D2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.模板為Eimeria stiedae DNA;2.模板為E. intestinalis DNA;3.模板為E. magna DNA);B. 基于大型艾美耳球蟲ITS的單一PCR(引物Pm2;M. D2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.模板為E. magna DNA;2.模板為E. stiedae DNA;3.模板為E. intestinalis DNA);C. 基于腸艾美耳球蟲ITS的單一PCR(引物Pi2;M. D2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.模板為E. intestinalis DNA;2.模板為E. stiedae DNA;3.模板為E. magna DNA)A. Direct PCR amplification based on Eimeria stiedae (primer Ps1; M. DNA marker D2000; 1. Template is Eimeria stiedae DNA; 2. Template is E. intestinalis DNA; 3. Template is E. magna DNA); B. Direct PCR amplification based on E. magna (primer Pm2; M. DNA marker D2000; 1. Template is E. magna DNA; 2. Template is E. stiedae DNA; 3. Template is E. intestinalis DNA); C. Direct PCR amplification based on E. intestinalis (primer Pi2; M. DNA marker D2000; 1. Template is E. intestinalis DNA; 2. Template is E. stiedae DNA; 3. Template is E. magna DNA)圖3 引物Ps1、Pm2、Pi2直接PCR特異性試驗(yàn)Fig.3 Primer (Ps1, Pm2, and Pi2) specificity was validated by direct PCR

M. D2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～6. 對(duì)應(yīng)DNA模板稀釋倍數(shù)分別相當(dāng)于500、100、10、1、0.5和0.25個(gè)卵囊M. DNA marker D2000; 1-6. Dilutions of the corresponding DNA template were equivalent to 500, 100, 10, 1, 0.5, and 0.25 oocysts, respectively圖4 引物Ps1 (A)、Pm2 (B)、Pi2 (C)單一直接PCR敏感性試驗(yàn)Fig.4 The sensitivity of Ps1 (A), Pm2 (B), and Pi2 (C) were validated by direct PCR

M. D2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～7. 取自7只不同兔裂殖體階段的組織樣本M. DNA marker D2000; 1-7. Tissue samples were collected from 7 rabbits at schizont stage, respectively圖5 引物Ps1 (A)、Pm2 (B)、Pi2 (C)直接PCR方法檢測人工感染組織樣本(裂殖體階段)Fig.5 Detection of experimentally infected samples by direct PCR methods based on Ps1 (A), Pm2 (B), and Pi2 (C) (schizont stage)

M. D2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～7.取自7只不同兔配子體階段的組織樣本M. DNA marker D2000; 1-7. Tissue samples were collected from 7 rabbits at gametophytic stage, respectively圖6 引物Ps1 (A)、Pm2 (B)、Pi2 (C)單一直接PCR方法檢測人工感染組織樣本(配子體階段)Fig.6 Detection of experimentally infected samples by direct PCR methods based on Ps1 (A), Pm2 (B), and Pi2 (C) (gametophytic stage)

M. D2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～13. 取自13只不同兔排蟲期的組織樣本;14～26. 取自13只不同兔排蟲期的直腸糞便樣本M. DNA marker D2000; 1-13. Tissue samples were collected from 13 rabbits at patent period, respectively; 14-26. Stool samples were collected from 13 rabbits at patent period, respectively圖7 引物Ps1 (A)、Pm2 (B)、Pi2 (C)單一直接PCR方法檢測人工感染組織和糞便樣本(排蟲期)Fig.7 Detection of experimentally infected tissue and stool samples by direct PCR methods based on Ps1 (A), Pm2 (B), and Pi2 (C) (patent period)

2.3 多重直接PCR檢測方法的建立

以3種兔球蟲卵囊DNA裂解液單獨(dú)或混合后作為模板,按優(yōu)化后的多重PCR條件擴(kuò)增,產(chǎn)物中195 bp代表腸艾美耳球蟲、384 bp代表斯氏艾美耳球蟲、712 bp條帶代表大型艾美耳球蟲。反應(yīng)體系為:10×Multi HotStart Buffer 2.5 μL、Super Pure dNTPs 2 μL、Multi HotStart DNA Polymerase 0.5 μL、MgCl22 μL、混合引物 6 μL、DNA裂解液各0.5 μL、ddH2O 10.5 μL,共計(jì)25 μL;反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性15 min,94 ℃變性30 s,58 ℃退火90 s,72 ℃延伸90 s,共計(jì)40個(gè)循環(huán)。結(jié)果顯示,單一模板或混合模板均能成功擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶(圖8A)。含斯氏艾美耳球蟲卵囊、腸艾美耳球蟲卵囊、大型艾美耳球蟲卵囊各1×105個(gè)的DNA裂解液倍比稀釋后,使用多重PCR試劑盒最低能檢測出相當(dāng)于3種兔球蟲卵囊各5個(gè)的稀釋液(圖8B)。

M. D2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.模板Eimeria stiedae、Eimeria magna、Eimeria intestinalis混合DNA;2.模板Eimeria magna DNA;3. 模板Eimeria intestinalis DNA;4.模板Eimeria stiedae DNA;5～8.模板為三種球蟲混合DNA,分別對(duì)應(yīng)三種球蟲各含50、5、0.5和0.25個(gè)卵囊DNA量的稀釋液。均以Ps1、Pi2、Pm2為引物M. DNA marker D2000; 1. Template is the mixed DNA of Eimeria stiedae, E. magna and E. intestinalis; 2. Template is E. magna DNA; 3. Template is E. intestinalis DNA; 4. Template is E. stiedae DNA; 5-8. template is the mixed DNA of Eimeria stiedae, E. magna and E. intestinalis, dilutions of the corresponding DNA template were equivalent to 50, 5, 0.5, and 0.25 oocysts of each coccidia, respectively. Using Ps1, Pi2, and Pm2 as primers圖8 多重直接PCR特異性(A)和敏感性(B)檢測Fig.8 The specificity (A) and sensitivity (B) of the multiplex direct PCR method

3 討 論

3.1隨著養(yǎng)兔業(yè)的規(guī)模化、集約化程度不斷提高,兔球蟲病對(duì)生產(chǎn)的危害愈發(fā)凸顯。大型艾美耳球蟲、斯氏艾美耳球蟲和腸艾美耳球蟲是我國主要養(yǎng)兔區(qū)的優(yōu)勢蟲種,同時(shí)也是致病性較強(qiáng)的兔球蟲,給養(yǎng)兔業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。在生產(chǎn)中,兔球蟲一般呈混合感染,準(zhǔn)確地鑒定蟲種可以為兔球蟲病流行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及兔球蟲病防治對(duì)策的制定提供參考。僅依據(jù)卵囊的形態(tài)很難準(zhǔn)確地鑒定出兔球蟲種類,而PCR檢測敏感性高,特異性強(qiáng),能批量檢測,已被應(yīng)用于各類畜禽球蟲病的檢測和流行病學(xué)調(diào)查[21-23]。然而,這些方法都需要進(jìn)行費(fèi)時(shí)而昂貴的DNA抽提步驟,而在直接PCR中,裂解緩沖液在65 ℃條件下10～30 min內(nèi)檢測樣品釋放基因組DNA,釋放出的微量DNA可直接作為模板進(jìn)行PCR。不僅節(jié)省了樣品和檢測時(shí)間(能在3 h內(nèi)完成整個(gè)檢測過程),而且最大限度地減少了人為錯(cuò)誤和污染,具有良好的應(yīng)用前景[24]。

3.2基于不同靶基因的PCR診斷方法,其敏感性、特異性存在差異,因此有必要對(duì)艾美耳球蟲PCR檢測靶標(biāo)進(jìn)行篩選[25-26]。ITS進(jìn)化快,是常見的艾美耳球蟲鑒別標(biāo)識(shí);而頂質(zhì)體和線粒體相似,進(jìn)行母性遺傳,其產(chǎn)生的變異能準(zhǔn)確地反映出蟲種差異[20,27]。本研究分析了大型艾美耳球蟲、斯氏艾美耳球蟲和腸艾美耳球蟲內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS1、ITS2)、線粒體基因(cytb、cox1、cox3)、頂質(zhì)體基因(rpoB)等靶標(biāo)的序列相似性,發(fā)現(xiàn)三種兔球蟲線粒體基因和頂質(zhì)體基因rpoB較保守,而ITS序列種間差異明顯,是良好的分子檢測靶標(biāo),這與Yan等[28]和許家園等[29]的研究一致。引物設(shè)計(jì)是多重PCR的關(guān)鍵環(huán)節(jié),引物的Tm值應(yīng)基本一致且目的片段的大小需適宜。在本研究中,基于3種兔球蟲的ITS序列各設(shè)計(jì)了2對(duì)引物,通過單一PCR篩選后的3對(duì)引物Ps1、Pi2、Pm2單一或混合檢測時(shí)均具有良好的特異性和敏感性。

3.3在生產(chǎn)上兔球蟲病雖流行普遍,但亞臨床感染病例較多,尤其是健康帶蟲者的兔群糞樣中卵囊數(shù)量較低,需要靈敏的檢測方法。而1～3月齡幼兔感染球蟲后易繼發(fā)其他疾病導(dǎo)致急性死亡,此時(shí)蟲體主要存在于寄生組織中,還未形成大量卵囊隨糞便排出,尤其是斯氏艾美耳球蟲寄生于肝,具有較長的潛隱期[30]。因此對(duì)于死亡病例進(jìn)行組織的PCR檢測,準(zhǔn)確判斷致病蟲種對(duì)兔球蟲病的防治有十分重要的意義。本研究建立的斯氏艾美耳球蟲、腸艾美耳球蟲和大型艾美耳球蟲單一直接PCR檢測方法特異且敏感,其中斯氏艾美耳球蟲和腸艾美耳球蟲最低能檢測出相當(dāng)于1個(gè)卵囊DNA的稀釋液,大型艾美耳球蟲最低能檢測出相當(dāng)于0.5個(gè)卵囊DNA量的稀釋液,和普通PCR的敏感性相當(dāng)[7,31],同時(shí)建立的3種兔球蟲單一直接PCR方法對(duì)于不同發(fā)育階段組織樣本以及排蟲期糞便樣本均可達(dá)到100%的檢出率,說明本研究建立的3種單一直接PCR方法可用于患病死亡兔組織樣本中球蟲核酸和糞樣中球蟲卵囊的檢測,為3種兔球蟲病流行病學(xué)調(diào)查及診斷提供便捷、可靠的技術(shù)支持。

基于單一蟲種檢測直接PCR方法基礎(chǔ)上建立的三重直接PCR也具有良好的特異性,其敏感性雖不及單一蟲種檢測的直接PCR,但最低仍能檢測出相當(dāng)于3種兔球蟲各5個(gè)卵囊DNA的混合液。由于組織樣本中含有大量的宿主核酸,容易影響多重直接PCR檢測結(jié)果,因此該方法主要用于兔糞樣中球蟲卵囊的檢測,通過飽和食鹽水濃集法富集糞樣中的卵囊后,可大大減少糞便中雜質(zhì)對(duì)PCR反應(yīng)的抑制作用,從而達(dá)到對(duì)糞樣中3種兔球蟲卵囊的快速臨床檢測。

4 結(jié) 論

本研究首次測定了兔斯氏艾美耳球蟲、腸艾美耳球蟲和大型艾美耳球蟲頂質(zhì)體基因rpoB序列以及斯氏艾美耳球蟲線粒體基因組全序列,并在此基礎(chǔ)上對(duì)PCR檢測靶基因進(jìn)行篩選。

3種兔球蟲ITS具有種內(nèi)保守和種間差異大的特點(diǎn),更適合用于分子診斷。篩選出的引物Ps1、Pi2、Pm2單一直接PCR能檢測出相當(dāng)于1、1和0.5個(gè)卵囊DNA量的稀釋液,且對(duì)組織和糞便樣本均達(dá)到100%的檢出率,該方法除可應(yīng)用于兔糞樣中球蟲卵囊的檢測外,還可用于患病死亡兔組織樣本中球蟲核酸的檢測。多重直接PCR能檢測出相當(dāng)于3種兔球蟲各5個(gè)卵囊DNA量的稀釋液,且兩種方法均具有良好的特異性,可對(duì)兔糞樣中3種兔球蟲卵囊進(jìn)行快速檢測。本研究建立的單一和多重直接PCR檢測方法為兔球蟲病的病原檢測與診斷提供了便捷、可靠的技術(shù)支持。