復方板藍根顆粒物質基礎研究及其整體質量評價

胡 青，程益清，曹 帥，孫 健，季 申*

（1.中國醫藥工業研究總院，上海 201203； 2.上海市食品藥品檢驗研究院，國家藥品監督管理局中藥質量控制重點實驗室，上海 201203）

復方板藍根顆粒收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準》 中藥成方制劑第十二冊 （編號WS3-B-2377-97），由板藍根、大青葉經水提醇沉工藝制得，用于治療風熱感冒、咽喉腫痛，可能通過多途徑、多靶點干預來COVID-19［1］。查詢國家藥監局網站發現，現有復方板藍根顆粒生產企業147家，批準文號151 個，質量標準17 個，其中1 個部頒標準僅收載了2 項理化鑒別項，無薄層鑒別、含量測定項目，而其余16 個國家標準增加了靛玉紅等成分的TLC 鑒別或含量測定項目，故存在較嚴重的“不同標準” 情況，導致質量控制水平落后，市售產品質量參差不齊。

目前，關于復方板藍根顆粒物質基礎的文獻較少［2-3］，而涉及質量標準的也集中于中靛玉紅、尿苷等1～4 種成分的控制［4-6］，無法全面反映該制劑整體質量。因此，本實驗采用UPLC-Q-TOF-MS 法對復方板藍根顆粒進行物質基礎研究、整體質量評價，以期為進一步提高其質量標準提供方向。

1 材料

Waters VION IMS Q-TOF 型液相質譜聯用儀（美國Waters 公司）； Milli-Q Gradient A10 型純水儀（美國Millipore 公司）； 電子分析天平（德國Sartorius 公司）； 超聲儀； 離心機。板藍根（批號121177-201608）、大青葉 （批號121367-200401）對照藥材及靛玉紅（批號110717-201805）、（R，S） -告依春（批號111753-202007）、鳥苷（批號111977-201501）、腺苷（批號110879-201703）、尿苷（批號110887-201803）、酪氨酸（批號140624-201506）、苯丙氨酸（批號140624-201506）、牡荊苷（批號111687-200501）、檸檬酸（批號111679-200401）、紫丁香苷（批號111574-200201） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院； 靛苷（批號M06A11K120647 ）、3-吲哚甲醛（批號H24A9Z59589）、落葉松樹脂醇 B （ 批號T06A11Z120554 ）、異金雀花素（批號P07A11S120560）、異落葉松樹脂醇 （ 批號Y28J11H116890） 對照品均購自上海源葉生物科技有限公司； 2，4-喹唑啉二酮對照品 （批號20191130） 購自上海沃凱生物技術有限公司。復方板藍根顆粒共112 批，來自50 家企業（Q1 ～Q50）。乙腈、甲酸為色譜純（德國Merck 公司）；水為超純水。

2 方法

2.1 UPLC-Q-TOF-MS 分析條件

2.1.1 色譜 Waters HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）； 流動相乙腈（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0 ～1 min，100% B； 1 ～6 min，100% ～80%B； 6～18 min，80% ～35%B； 18 ～18.5 min，35% B ～0； 18.5 ～19.5 min，0； 19.5 ～23 min，0 ～100% B）； 體積流量0.5 mL/min； 柱溫40 ℃； 進樣量2 μL。

2.1.2 質譜 電噴霧離子源（ESI）； 負離子掃描； 毛細管電壓2.5 kV； 錐孔電壓40 V； 除溶劑氣氮氣，體積流量800 L/h； 除溶劑溫度550 ℃；離子源溫度120 ℃； 掃描范圍m/z50 ～1 000； 掃描時間0.2 s； 碰撞氣氮氣，低能量掃描時碰撞能量4 eV，高能量掃描時碰撞能量25 ～60 eV。以50 pg/μL 亮氨酸-腦啡肽溶液為校正標準液。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，甲醇制成質量濃度均為20 μg/mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取112 批樣品，每批各約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入10 mL甲醇，密塞，稱定質量，超聲 （功率250 W，頻率40 kHz，40 ℃以下） 處理1 h，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，4 000 r/min 離心5 min，取上清液，即得。

2.3 數據處理與分析 采用UNIFI 軟件采集數據，對于有對照品的成分，通過比對兩者保留時間、質譜碎片特征進行鑒定； 對于沒有對照品的成分，查閱中英文相關文獻，收集已報道組方藥材中的成分信息，包括名稱、分子式、CAS 號、化學結構等，建立初步化學成分數據庫，將UNIFI 軟件與其進行自動匹配，質量數偏差設置為±5×10-6，并根據化合物二級質譜信息進行人工確認。

3 結果

3.1 成分鑒定 基峰離子流色譜圖見圖1，共檢測到37 種主要成分［7-15］，包括8 種生物堿、7 種苯丙素、3 種核苷、2 種氨基酸、6 種有機酸、4 種黃酮、1 種含硫成分、6 種其他成分，具體見表1。以峰5、7、15、19、20、24 為例，對其鑒定過程進行分析。

表1 復方板藍根顆粒化學成分鑒定結果Tab.1 Results of chemical constituent identification in Compound Banlangen Granules

圖1 復方板藍根顆粒基峰離子流色譜圖Fig.1 Base peak ion current chromatogram of Compound Banlangen Granules

峰5 準分子離子峰m/z282.084 0 ［M-H］-，保留時間3.66 min，分子式C10H13N5O5； 二級質譜圖中碎片離子為脫去一分子核糖后生成的m/z150.042 4 ［M-H-rib］-，通過比對對照品、查閱文獻［7］、匹配數據庫，推測該化合物為鳥苷，屬于核苷類成分。

峰7 準分子離子峰m/z164.071 7 ［M-H］-，保留時間4.27 min，分子式C9H11NO2； 二級質譜圖中碎片離子主要有m/z147.044 4 ［M-H-NH3］-、103.054 1 ［M-H-CO2-NH3］-，通過比對對照品、查閱文獻［7］、匹配數據庫，推測該化合物為苯丙氨酸，屬于氨基酸類成分。

峰15 準分子離子峰m/z294.098 1 ［M-H］-，保留時間6.09 min，分子式C14H17NO6； 二級質譜圖中碎片離子為脫去一分子葡萄糖后生成的m/z131.037 2 ［M-H-Glc-H］-，通過比對對照品、查閱文獻［7］、匹配數據庫，推測該化合物為靛苷，屬于生物堿類成分。

峰19 準分子離子峰m/z729.261 0 ［M ＋COOH］-，保留時間6.26 min，分子式C32H44O16；二級質譜圖中主要是糖苷鍵斷裂，先丟失一分子或兩分子葡萄糖，再丟失CH2O 形成的碎片離子m/z521.202 5 ［M-H-Glc］-、359.152 3 ［M-H-2Glc］-、329.142 4 ［M-H-2Glc-CH2O］-，通過比對對照品、查閱文獻［12］、匹配數據庫，推測該化合物為落葉松樹脂醇B，屬于苯丙素類成分。

峰20 準分子離子峰m/z181.014 5 ［M-H］-，保留時間6.65 min，分子式C8H6O5； 二級質譜圖中主要是連續脫去中性分子CO2后形成的碎片離子m/z137.022 4 ［M-H-CO2］-、m/z93.034 4 ［MH-2CO2］-，通過查閱文獻［7］、匹配數據庫，推測該化合物為2-羥基-1，4-苯二甲酸，為有機酸成分。

峰24 準分子離子峰m/z431.097 9 ［M-H］-，保留時間7.75 min，分子式C21H20O10； 二級質譜圖碎片離子主要有m/z341.068 9 ［M-HC3H6O3］-、311.056 5 ［M-H-C4H8O4］-、283.060 0［M-H-C5H10O5］-，通過比對對照品、查閱文獻［13］、匹配數據庫，推測該化合物為牡荊苷，屬于黃酮類成分。

3.2 整體質量評價 選擇3 個主要生產企業Q1、Q5、Q9 （收集批次最多） 的33 批樣品（Q1 13批，Q5 11 批，Q9 9 批） 作為研究對象，采用SPSS 19.0 軟件，以平均Euclidean 距離為度量標準，通過組間連接法，以37 個共有峰峰面積為變量進行系統聚類分析，結果見圖2。由此可知，組間距為10 時各批樣品聚為3 類，Q1 的3、19、2、43、33、1、18、30、32、5、53，Q5 的31、71、34、37、41、8、105、29 為一類； Q1 的10、61，Q5 的17、107，Q9 的44、106、20、27、35、26、72、21、13 為一類； Q5 的49 為一類，表明其總體聚類區分較明顯，同一生產企業樣品質量一致性較好，而不同生產企業的較差。

圖2 33 批復方板藍根顆粒聚類分析圖Fig.2 Cluster analysis plot for thirty-three batches of samples

采用SIMCA-P 13.0 軟件，以37 個共有峰峰面積為自變量，各批樣品為應變量，采用偏最小二乘法-判別分析 （PLS-DA） 依次提取3 個主成分，模型解釋率R2X為0.653，預測能力參數Q2為0.784，均高于0.5，說明擬合程度較好。將模型建立時分類Y矩陣變量定義為隨機排列20 次，并進行置換檢驗，得到R2為0.279，Q2為-0.322，表明模型未出現過擬合。經PLS-DA 模型擬合分析得到散點圖、置換檢驗圖、VIP 圖，分別見圖3 ～5，可知不同生產企業樣品分別聚類，區分較明顯，與聚類分析結果一致，表明其質量存在一定差異，但同一生產企業不同批次樣品質量差異較小。再對模型各投影VIP 參數進行分析，其數值大于1 表明有顯著影響，可作為質量差異標志物，其中尿苷、鳥苷、腺苷、檸檬酸、酪氨酸是對分類起到最重要作用的5 個變量，即為區分不同生產企業樣品的重要指標，提示在生產過程中應重點監控其質量變化以減少批次間差異，保證整體質量穩定。

圖3 PLS-DA 得分散點圖（3 家生產企業）Fig.3 Score scatter plot for PLS-DA （ three production enterprises）

圖4 模型置換檢驗圖Fig.4 Permutation test plot for model

圖5 PLS-DA VIP 值Fig.5 VIP values for PLS-DA

采用SIMCA-P 13.0 軟件，以37 個共有峰峰面積為自變量，112 批樣品為應變量進行PLS-DA 分析，結果見圖6。由此可知，Q30 樣品65、66 與Q19 樣品42 明顯離群，與其他生產企業樣品差異較大，并且 （R，S） -告依春、腺苷、鳥苷、尿苷、靛玉紅色譜峰峰面積明顯小于其他樣品，提示其投料的板藍根、大青葉質量較差。

圖6 PLS-DA 得分散點圖（所有生產企業）Fig.6 Score scatter plot for PLS-DA （ all production enterprises）

尿苷、鳥苷、腺苷為板藍根、大青葉共有核苷類成分，是區分不同生產企業樣品的重要指標，而（R，S） -告依春為2020 年版《中國藥典》 規定的板藍根指標成分。為了更好地評價復方板藍根顆粒質量，本實驗采用HPLC 法測定上述4 種成分的含量，結果見表2。由此可知，不同生產企業樣品中各成分含量存在顯著差異； 3 家生產企業樣品中其平均含量依次為Q5＞Q1＞Q9，并且Q9 樣品中各成分總含量僅為Q5 的21.4%，表明其質量不佳；Q19、Q30 的3 批樣品中各成分含量偏低，與PLSDA 分析結果一致，可能存在藥材質量較差或不足量投料生產的情況。

4 討論

復方板藍根顆粒具有較強的抗菌、抗病毒、增強免疫力等功效［16］，但其現行標準質量控制項目不足，缺乏專屬性，是導致企業間產品質量參差不齊的重要原因。另外，水提醇沉工藝不利于靛玉紅溶出； 部分企業所用板藍根、大青葉質量較差，使得指標成分［如靛玉紅、（R，S） -告依春等］ 含量較低； 可能存在不足量投料生產的情況。

本實驗采用UPLC-Q-TOF-MS 法對復方板藍根顆粒物質基礎進行研究，參考文獻、數據庫匹配、二級質譜分析，共鑒定出37 個化合物，主要為生物堿、苯丙素、核苷、有機酸、黃酮等，其中板藍根中的生物堿類成分具有多種藥理活性，如抗病毒、抗炎、抗菌、抗腫瘤等［17-19］，有機酸、核苷類成分具有顯著的抗內毒素活性［20-21］，結合氨基酸具有抗病毒、抗炎等作用［22］。再通過聚類分析、PLS-DA 等化學計量學方法評價了復方板藍根顆粒整體質量，可為該制劑后續相關研究提供科學依據和數據支撐。