檳榔堿細胞毒性及其作用機制研究進展

胡 晨，張昊芃，張曉朦，張爍穎，胡曉艷

（1.西南醫科大學臨床醫學院，四川 瀘州 646000； 2.西南醫科大學病原生物學教研室，四川 瀘州 646000）

隨著我國經濟快速發展，人們生活壓力逐漸增大，咀嚼檳榔已成為一種常用的提神醒腦方式。檳榔為棕櫚科常綠喬木檳榔的種子，可以藥食兩用，原產于馬來西亞，主要分布于南亞、東南亞國家及我國臺灣、福建、廣東、廣西等地。我國已有兩千多年的檳榔用藥史，《本草綱目》記載其“通關節，利九竅，補五勞七傷，健脾調中，除煩，破癥結”。現代藥理學發現，檳榔具有抑菌、驅蟲、促胃腸道消化運動、抗腫瘤等藥理作用［1-5］。如今，由于食用檳榔人數的增加和現象的普遍，其導致的一系列疾病也備受重視。

檳榔化學成分復雜，含有多種生物堿，包括檳榔堿、檳榔次堿、甲基檳榔堿等［6］，其中檳榔堿含量最高，為主要藥理和毒性成分［7］。檳榔堿是一種有機物，化學式C8H13NO2，臨床用于治療青光眼、產后子宮出血等癥。長期咀嚼所釋放出的檳榔堿可以誘發口腔黏膜下纖維化、心血管病變、高血壓、腎臟損傷等，甚至致癌［8-9］，且深入研究發現，檳榔堿具有很強的細胞毒性，內皮、成纖維、上皮等細胞為其主要作用靶點，除表現抑制細胞增殖、促使細胞凋亡的共同影響外，檳榔堿對不同細胞的毒性作用存在一定的差異。本文將檳榔堿主要的細胞毒性及可能的作用機制進行綜述，以期為期深入研究提供依據。

1 對內皮細胞的毒性作用

內皮細胞存在于血液與血管平滑肌之間，具有局部血管調節作用。Tseng 等［10］研究了檳榔堿對人臍靜脈內皮細胞的毒性作用，MTT 結果表明，0.8 mmol/L 檳榔堿作用24 h后能夠抑制細胞增殖，細胞數量減少31%，具有量效和時效依賴關系，隨劑量的增加，細胞收縮程度升高，G0/G1期、S 期占比分別降低14.1%、9.4%，G2/M 期細胞增加19.3% （P＜0.05），推測是由于檳榔堿能夠阻斷細胞分裂間期的物質準備，從而阻礙DNA 的復制和相關蛋白的合成，使細胞無法完成增殖。靳婷［11］將大鼠細胞暴露于高濃度檳榔堿24 h 后，發現細胞活性降低，出現細胞凋亡的典型形態學改變，細胞內半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3） 水平升高，提示檳榔堿可誘導細胞凋亡，且caspase-3 可能在檳榔堿誘導的細胞凋亡中起重要作用。

檳榔堿對內皮細胞的毒性還可能與細胞內谷胱甘肽轉化酶（glutathione S-transferase，GST） 活性有關，GST 是維持細胞氧化還原穩態的重要組成部分。Shakya 等［12］對果蠅體內檳榔堿的毒性評估實驗表明，果蠅體內GST 活性降低，當檳榔堿濃度為0.02、0.04、0.08 mmol/L 時，幼蟲中GSH 活性分別降低1.36、1.60、1.80 倍，氧自由基（oxygen free-radicals，OFR） 水平升高（P＜0.05）。可能是胞內谷胱甘肽損耗，OFR 的產生和清除之間的平衡遭到破壞，使線粒體膜通透性增大，細胞能量代謝活力降低，ATP 生成減少，促使細胞凋亡。Wu 等［13］研究檳榔堿對內皮細胞的作用，發現檳榔堿可引起血管內皮細胞胞內誘導型一氧化氮合酶活性升高，刺激NO 過度分泌導致血管內皮擴張，血管穩態失衡。

綜上所述，檳榔堿作用于內皮細胞后，造成細胞形態學的改變，血管內皮的損傷，細胞內OFR 水平的升高，凋亡相關蛋白的激活，影響凝血、物質轉運等功能障礙。

2 對上皮細胞的毒性作用

上皮細胞位于皮膚或腔道表層，具有保護、吸收、分泌等功能，進入體內的檳榔堿很容易損傷上皮細胞。將濃度為0.15、0.3 mmol/L 的檳榔堿分別作用于上皮細胞48 h后發現，細胞活力分別降低22%、30%，細胞收縮成紡錘形或圓形，細胞間隙變大，大量細胞溶解，并存在量效依賴性（P＜0.05）［14］。這一結果與Ren 等［15］研究結果一致，檳榔堿可促使轉化因子SAA1、IL-6、IL-36G 水平升高，使上皮間充質轉化相關分子表達異常，導致細胞極性喪失，細胞間連接方式被破壞。Shih 等［16］用0.4 mmol/L 檳榔堿染毒正常前列腺上皮細胞48 h 后，發現除細胞形態學改變外，檳榔堿能抑制上皮細胞的活性，G1期和S 期細胞占比降低。口腔黏膜下纖維化的特征之一是上皮細胞的萎縮，Li 等［17］利用口腔角質細胞進行檳榔堿的毒性研究，結果表明，0.16 mmol/L 檳榔堿能抑制細胞生長，細胞骨架蛋白關鍵基因TPM1 表達降低，而敲除TPM1 削弱了檳榔堿對細胞生長的影響，因此可推論TPM1 是導致細胞毒性的原因之一，也是治療口腔黏膜下纖維化的重要靶點。Voigt等［18］發現，檳榔堿可與脯氨酸競爭性的結合人質子偶聯氨基酸轉運蛋白1，從而減少腸上皮細胞對脯氨酸的攝取，抑制細胞生長。而Lin 等［19］進行小鼠體內實驗表明，檳榔堿對細胞活力沒有影響，但劑量依賴性地升高腎皮質纖連蛋白和纖溶酶原激活劑抑制蛋白表達，誘導小鼠腎小管間質纖維化，提示咀嚼檳榔可增加腎纖維化的發生風險。此外，Uehara 等［20］將0.3 mmol/L 檳榔堿作用于人類牙齦上皮細胞30 d 后與同時期陰性對照組比較，發現檳榔堿組細胞活性降低，基質金屬蛋白酶9 （matrix metalloproteinase-9，MMP-9） 活性升高。MMP-9 活性升高可導致牙齦上皮細胞衰老，使上皮細胞獲得侵襲、轉移能力［21］，為檳榔堿致癌的潛在機制提供參考。綜上所述，上皮細胞毒性反應因來源或部位而異，在一定條件下為患者個體化治療提供了可能，但目前缺乏體內的實驗，且不排除其他因素可能的協同作用，仍有待進一步研究。

檳榔堿能夠引起細胞的凋亡，具有潛在的致癌作用。Li 等［17］將濃度為0.16 mmol/L 的檳榔堿作用上皮細胞48 h，結果顯示，細胞出現明顯的凋亡現象，這可能與TPM1 表達降低和caspase 活性升高有關。這在張睿等［22］的研究結果得到了驗證，檳榔堿可誘導凋亡相關蛋白caspase-3、caspase-8 （外源性凋亡途徑的主要蛋白）、caspase-9（內源性凋亡途徑的相關蛋白） 表達升高。但未發現caspase-9 有劑量依賴性［23］，表明檳榔堿主要以外源性途徑誘導細胞凋亡。但目前未見檳榔堿對于上皮細胞安全劑量的探討，這也是深入研究的方向之一。

3 對成纖維細胞的毒性作用

成纖維細胞主要參與膠原的合成、降解、吞噬。體外研究發現，檳榔堿能影響成纖維細胞增殖、合成膠原蛋白等［24］。低劑量檳榔堿（濃度＜0.1 mmol/L） 能升高分泌型糖蛋白Wnt5a 表達來促進人口腔成纖維細胞的增殖［25］，但高劑量檳榔堿（濃度＞0.2 mmol/L） 卻會使細胞活力降低，細胞增殖受到抑制［26］。表明檳榔堿對成纖維細胞增殖的影響可能與使用劑量和細胞耐受程度有關。此外，Ku 等［27］在進行大鼠體內檳榔堿毒性研究時發現，與對照組比較，檳榔堿促使膠原蛋白在上皮組織下過度沉積，致使心臟纖維化，且轉化生長因子-β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1） 表達升高約1.7 倍。推測TGF-β1 的高表達是檳榔堿促使膠原積累、產生細胞的毒性的重要機制。近年來研究證實，TGF-β1 是一種有效的促纖維化細胞因子，檳榔堿通過長鏈非編碼RNA （LINC00974） 介導TGF-β/Smad信號通路刺激成纖維細胞活化［28］，激活膠原基因（COL1A2、COL3A1、COL6A1、COL6A3、COL7A1），誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞分化和膠原沉積［29］。Ho 等［30］和Yang 等［31］同樣利用TGF-β/Smad 信號通路進行檳榔堿的毒性研究，結果表明，檳榔堿可介導TGF-β 使缺氧誘導因子-1 的mRNA、致癌基因miR-21 表達升高，促進纖維化的發生。此外，檳榔堿還可介導HIF-1α/TGF-β/CTG 通路誘導成纖維細胞中纖維相關分子（COL1A2、COL3A） 的表達，降低基質金屬蛋白酶2 活性，促使異常細胞增殖和遷移［32］。綜上所述，檳榔堿能有效調節細胞因子增加細胞內膠原蛋白的合成，這可能是檳榔堿誘發口腔黏膜下纖維化的原因之一。

4 對神經細胞的毒性作用

自噬參與蛋白質和細胞器的分解，在維持細胞內環境穩態中起重要作用，有利于細胞清除外來毒性物質［33］。Gao 等［34］研究發現，2 mmol/L 檳榔堿可升高PC12 細胞自噬相關分子LC3 Ⅱ/LC3I 的比值和p62 蛋白表達，降低PC12 細胞的自噬作用。Jiang 等［35］將檳榔堿暴露于PC12細胞24 h 后發現細胞內Bcl-2 蛋白（抗凋亡蛋白） 表達降低，Bax 蛋白（促凋亡相關蛋白） 表達升高，且Bcl-2、Bax 等進入線粒體后促使線粒體膜釋放細胞色素C，激活caspase 級聯反應，最終導致細胞凋亡。同時小鼠耳蝸組織外植體實驗研究證明，檳榔堿能劑量依賴性地降低超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽水平，抑制細胞抗氧化能力，產生活性氧和活化NADPH 氧化酶等酶類，導致神經元內氧化還原反應失衡及感覺神經性聽力障礙［36］。因此，檳榔堿對于神經細胞的毒性作用多面性大大提高了神經疾病的發生率。

據報道，檳榔堿是世界上第四大最常用的人類精神活性物質（僅次于酒精、尼古丁、咖啡因），對中央和周圍神經系統也有一定的影響，長期食用會導致成癮、出現沮喪、焦慮、注意力不集中、乏力等戒斷反應［37-38］。Liu等［39］初步推測檳榔堿可能具有M 膽堿、擬副交感神經毒性。這在Siregar 等［40］的研究得到證實，檳榔堿能與毒蕈堿、乙酰膽堿受體對接，使斑馬魚運動過度亢進。但兩者廣譜的結合特性［41］使得基于藥理學和分子對接的方法難以獲得清晰的結果，且目前檳榔堿的神經毒性研究相對較少，僅僅初步闡述了其基本毒性機制，故有待進一步研究。

5 對脂肪細胞的毒性作用

檳榔堿染毒脂肪細胞后，能改變細胞周期不同階段的細胞分布，影響前脂肪細胞的生長［42］。Hsieh 等［43］發現前脂肪細胞因子-1 （preadipocyte factor-1，Pref-1） 作為前脂肪細胞標記物和脂肪細胞分化抑制劑，在前脂肪細胞轉化為脂肪細胞的過程中，Pref-1 的mRNA 及蛋白表達降低，暴露于檳榔堿后，表達部分逆轉。表明檳榔堿能在一定程度上干擾前體脂肪細胞向脂肪細胞的分化。除影響前脂肪細胞分化外，檳榔堿還會降低脂肪細胞儲脂能力。凌宏艷等［44］將0.1 mmol/L 檳榔堿作用于3T3-L1 脂肪細胞后發現，細胞內脂質水平明顯降低，細胞儲脂功能異常。此外，絲氨酸307 磷酸化能減弱胰島素信號傳導［45］。濃度為0.1 mmol/L 的檳榔堿染毒脂肪細胞6 h 后，胰島素受體底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1） 絲氨酸307 磷酸化基礎水平升高，阻斷胰島素介導的IRS-1 酪氨酸、脂質激酶蛋白、蛋白激酶磷酸化［44］，表明檳榔堿能通過阻斷胰島素信號傳導產生胰島素抵抗，抑制脂肪細胞的脂質儲存，促進脂肪分解，升高血清中脂類水平。這為檳榔咀嚼者常患有2 型糖尿病、高脂血癥、高甘油三脂血癥、代謝綜合癥作出了合理解釋。有文獻報道檳榔堿可能具有潛在的降糖作用。凌宏艷等［46］將1、5 mg/kg 檳榔堿注射于2 型糖尿病大鼠后，發現大鼠空腹血糖降低，而此處理對于正常大鼠來說無影響。姚起鑫等［47］用同樣的模型進行研究，指出1、5 mg/kg 為檳榔堿的安全降糖劑量，高劑量（質量濃度＞5 mg/kg） 則具有明顯的細胞毒性，引起細胞水樣變性，脂肪空泡，這提示檳榔堿的毒性作用與劑量有關，且可能存在著種屬及機體狀態的差異。但目前檳榔堿對脂肪細胞的毒性研究仍是體外實驗，體內實驗及對糖尿病等相關代謝疾病的影響及其機制還有待明確。

6 對生殖細胞的毒性作用

檳榔堿可損傷男（雄） 性及女（雌） 性的生殖細胞，主要體現在氧化應激反應的產生。Wu 等［48］給予小鼠100 mg/kg 檳榔堿，發現小鼠精子內脂質過氧化，抗氧化酶、唾液酸水平降低，從而損害精子數量和活性，影響精子頂體反應與受精能力。這與Li 等［49］對女（雌） 性生殖細胞毒性機制的研究結果相似，將處于生發囊泡階段小鼠卵母細胞和1、1.15、1.2 mmol/L 檳榔堿溶液共同培養，發現檳榔堿量效依賴性地破壞線粒體完整性，引起ATP 產生的減少和活性氧合成的增加，影響肌動蛋白分布及提高染色體排列異常的發生率，抑制小鼠卵母細胞的減數分裂成熟，導致卵母細胞凋亡。這一作用會降低生殖細胞的質量和數量，影響精卵識別和受精過程，最終可能導致生殖困難甚至不孕不育。而氧化應激的產生進一步誘導炎癥細胞因子（COX-2、TNF-α、IL-6 等） 的釋放。檳榔堿能夠升高COX-2 表達，介導炎癥反應，破壞負責鞭毛運動的結構，進而降低精子運動能力［50］。Kuo 等［51］研究表明，檳榔堿劑量依賴性地誘導TNF-α 高表達，減少或重排細胞連接蛋白，破壞血-睪屏障，進一步導致精子數量與活動力，受精能力降低。且女性長期咀嚼檳榔會減少妊娠早期胚胎的植入，抑制胚泡滋養細胞生長，出現早產、流產等癥狀，并影響胎兒后續生長，所生嬰兒大多表現為體重過輕和發育不良［52-53］。然而，有關檳榔或檳榔堿對生殖細胞的毒性機制目前仍相對缺乏，且檳榔堿對生殖細胞的直接毒性或其他作用機制還有待研究。

7 結語

檳榔堿作為傳統中藥檳榔的有效成分之一，具有許多藥理作用。然而，檳榔堿也對多種細胞產生毒性作用，表現為細胞活性降低、細胞氧化損傷、細胞形態結構改變、細胞凋亡等，進而導致口腔黏膜下纖維化、2 型糖尿病、鱗狀上皮癌、不育不孕等疾病的發生。近年來研究發現檳榔堿有許多臨床治療價值，可作為治療多種疾病的藥物。因此，研究檳榔堿細胞毒性作用及其可能存在的機制，可為臨床應用提供一定的參考，同時需要更深入的研究以減少或者消除其毒性作用。