荊銀顆粒HPLC 指紋圖譜建立及13 種成分測定

張艷欣，江美芳，2＃，王丹丹*

（1.上海上藥杏靈科技藥業股份有限公司，上海 200120； 2.上海中醫藥大學，上海 200120）

荊銀顆粒由荊芥、金銀花、四季青、魚腥草、大青葉、蒲公英、牛蒡子、防風、甘草9 味藥材組成，具有疏風清熱、宣肺利咽的作用，臨床用于治療風熱感冒［1］。方中荊芥辛溫疏解，溫而不燥，入肺肝二經，為治風溫之主藥［2］，而金銀花清熱解毒，宣散透表，為清熱解毒之要藥［3］； 臣藥四季青、蒲公英、大青葉均可清肺熱，增強君藥清熱解毒之功［4］； 佐藥魚腥草、牛蒡子具有宣肺化痰、解毒利咽之功［5-6］； 使藥甘草、防風功效解毒和中、調和諸藥［7］。以往研究證實，荊銀顆粒具有抗炎、抗病毒作用［8-13］，被推薦用于H1N1 甲型流感病毒、COVID-19 新型冠狀病毒的預防與治療［14-17］。然而，荊銀顆粒現行質量標準僅有TLC鑒別、原兒茶醛含量測定［18-19］，難以全面評價該制劑整體質量。

指紋圖譜［20-23］具有中藥多組分、多靶點的整體作用特點，是從全成分角度出發的一種現代中藥質量控制方法，比單一成分更全面。本實驗建立荊銀顆粒HPLC 指紋圖譜，并測定原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、升麻素苷、甘草苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、5-O-甲基維斯阿米醇苷、異綠原酸C、牛蒡子苷的含量，以期為該制劑質量標準提升提供依據。

1 材料

Waters Acquity ARC 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）； KQ5200DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； Direct-Q 3UV 型超純水機（美國Millipore 公司）。

原兒茶酸（批號5668，純度100%）、咖啡酸（批號7403，純度99.7%）、隱綠原酸 （批號3208，純度98.0%）、升麻素苷（批號3246，純度99.6%）、甘草苷（批號9722，純度100.0%）、蘆丁（批號5981，純度91.7%）、木犀草苷（批號6567，純度99.3%）、異綠原酸B （批號3089，純度98.5%）、異綠原酸A （批號10639，純度99.0%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號6381，純度99.6%）、牛蒡子苷（批號5691、純度98.3%）對照品均購自上海詩丹德標準技術服務有限公司；綠原酸對照品（批號A22GB158496，純度99.4%）購自上海源葉生物科技有限公司； 異綠原酸C 對照品（批號22070639，純度98.0%） 購自上海泰坦科技股份有限公司。

荊銀顆粒共23 批 （批號211201、220401、220402、220403、220404、220405、220406、220407、220408、220409、220410、220411、220412、220413、220414、220501、220502、220503、220504、220701、220704、220708、221203，編號S1 ～S23），由上海上藥杏靈科技藥業股份有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters CORTECS C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）； 流動相0.1%磷酸（A） -乙腈（B），梯度洗脫（0 ～3 min，95% A； 3 ～16 min，95% ～90% A； 16 ～21 min，90% ～88% A；21～35 min，88% ～83%A； 35 ～55 min，83% ～70%A；55 ～65 min，70% ～55% A； 65 ～66 min，55% ～5%A）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫35 ℃； 檢測波長210 nm； 進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 取原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、升麻素苷、甘草苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、5-O-甲基維斯阿米醇苷、異綠原酸C、牛蒡子苷對照品適量，置于5 mL量瓶中，50% 甲醇溶解稀釋，即得（各成分質量濃度分別為0.458、0.548、0.438、0.678、0.386、0.234、0.321、0.309、0.356、0.436、0.386、0.504、0.245 mg/mL），密閉保存。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取23 批樣品，每批2.5 g，加入50% 甲醇25 mL，稱定質量，超聲（200 W、40 kHz） 處理30 min，70%甲醇補足減失的質量，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，即得。

2.2.3 單味飲片溶液 根據處方工藝，取荊芥、金銀花、四季青、魚腥草、大青葉、蒲公英、牛蒡子、防風、甘草單味飲片適量，按“2.2.2” 項下方法制備，即得。

純氮施用量為102 kg/hm2。基肥可施用復合肥（10∶8∶24）594 kg/hm2，采用定點定位環行施肥法在理墑前施下。提苗肥在煙株移栽后7 d內施加，30%的追肥在栽后20～25 d施加。

2.3 HPLC 指紋圖譜建立

2.3.1 精密度試驗 取本品適量，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得各共有峰峰面積RSD 均小于2.53%，相對出峰時間RSD 均小于0.46%，表明該方法精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取本品6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得各共有峰峰面積RSD 均小于3.00%，相對出峰時間RSD 均小于0.38%，表明該方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 取供試品溶液適量，室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得各共有峰峰面積RSD 均小于2.91%，相對出峰時間RSD 均小于0.16%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.4 圖譜生成 取23 批樣品，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版） ” 建立指紋圖譜，設定時間窗寬度為0.1 min，進行多點校正和Mark 峰匹配，再通過中位數法建立對照指紋圖譜（R），見圖1。由此可知，共有16 個共有峰，其相對保留時間RSD 為0.03% ～0.43%，表明各批樣品出峰時間穩定，同時由于綠原酸（峰4） 峰面積較大，保留時間適中，分離度較好，故選擇其作為參照峰（S）。另外，各批樣品色譜圖與對照指紋圖譜的相似度均超過0.970，可用于其整體質量控制。

圖1 23 批荊銀顆粒HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints for twenty-three batches of Jingyin Granules

圖2 對照品HPLC 色譜圖（A）、對照指紋圖譜（B）Fig.2 HPLC chromatogram of reference substances （A）and reference fingerprint （B）

圖3 荊銀顆粒、單味飲片HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of Jingyin Granules and single decoction pieces

2.4 各成分含量測定

2.4.1 專屬性試驗 取本品適量，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，發現各成分色譜峰均具有良好的分離度、峰形對稱性，并且與相應對照品一一匹配，表明該方法專屬性良好。

2.4.2 線性關系考察 取各對照品適量，按“2.2.1” 項下方法制備不同質量濃度的相應溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Results of content determination of various constituents

2.4.3 精密度試驗 取本品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、升麻素苷、甘草苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、5-O-甲基維斯阿米醇苷、異綠原酸C、牛蒡子苷峰面積RSD 分別為0.17%、0.48%、0.64%、0.09%、0.73%、0.26%、2.10%、2.53%、1.18%、2.44%、0.76%、0.82%、2.26%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復性試驗 取本品6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、升麻素苷、甘草苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、5-O-甲基維斯阿米醇苷、異綠原酸C、牛蒡子苷峰面積RSD 分別為0.20%、0.24%、0.81%、0.54%、0.25%、1.23%、2.60%、1.45%、2.09%、0.97%、0.56%、2.42%、0.39%，表明本方法具有良好的重復性。

2.4.5 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、升麻素苷、甘草苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、5-O-甲基維斯阿米醇苷、異綠原酸C、牛蒡子苷峰面積RSD 分別為0.07%、0.70%、0.58%、0.15%、0.89%、1.42%、2.73%、0.78%、2.58%、1.23%、2.87%、0.71%、1.41%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的本品9 份，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1” 項下方法制備與供試品溶液中各成分含量相同的對照品溶液，分別按后者的0.5、1.0、1.5 倍加到供試品溶液中，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、升麻素苷、甘草苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、5-O-甲基維斯阿米醇苷、異綠原酸C、牛蒡子苷平均加樣回收率分別為99.87%、100.98%、97.26%、96.34%、98.13%、101.55%、98.77%、96.05%、101.96%、100.84%、97.29%、102.06%、99.91%，RSD 分別為1.97%、0.98%、1.37%、1.99%、2.16%、1.09%、1.97%、2.06%、1.74%、1.45%、2.76%、1.21%、1.04%。

2.4.7 樣品含量測定 取23 批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表2。

表2 各成分含量測定結果（%，n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （%，n＝3）

3 討論

本實驗首先考察了水及不同體積分數（10%、25%、50%、75%、100%） 甲醇、乙醇的提取效果，發現50%甲醇提取時各成分色譜峰數量較多，響應強度整體較強，故選擇其作為提取溶劑。再進行全波長掃描，發現在210 nm 處各成分色譜峰數量較多，并且均有較強吸收，故選擇其作為檢測波長。

23 批荊銀顆粒HPLC 指紋圖譜中有16 個共有峰，并鑒定出其中13 個，覆蓋了方中全部9 味藥材的特征成分，主要為有機酸、黃酮、木脂素、色原酮等。其中，君藥荊芥標定了6 個，金銀花標定了7 個，主要為有機酸、黃酮，也是具有抗菌、抗病毒、抗炎活性的藥效物質。

4 結論

本實驗建立荊銀顆粒HPLC 指紋圖譜，并測定原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、升麻素苷、甘草苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、5-O-甲基維斯阿米醇苷、異綠原酸C、牛蒡子苷的含量，有助于該制劑整體質量控制，可為提升其質量標準提供數據支持，也能為其后續深入開發奠定基礎。