復方百部止咳糖漿對百日咳小鼠免疫功能、TLR4/NF-κB 信號通路的影響

李 星，劉 琪，張瀟予，張 偉，李竹英

（1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院呼吸科，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫藥大學研究生院，黑龍江 哈爾濱 150040； 3.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院兒科，黑龍江 哈爾濱 150040）

百日咳作為致嬰幼兒死亡的急性呼吸道傳染病之一，主要因百日咳桿菌引起［1］。在百日咳治療上，從傳統的多抗原全細胞百日咳疫苗到無細胞百日咳疫苗，在一定程度上降低了與百日咳有關疾病的發病率和死亡率，但卻不能為機體提供持久的免疫力，使機體自身抵抗疾病［2］。中醫認為，百日咳初期肺氣宣發，邪氣尚存，中、后期若能行潤肺清嗓、清肺氧陰治療，可使患兒逐漸康復［3］。復方百部止咳糖漿由百部、苦杏仁、桑白皮、麥冬、知母、黃芩、陳皮、甘草、天南星、枳殼、桔梗11味中藥加工而成，具有清肺止咳功效，用于肺熱咳嗽、痰黃黏稠、百日咳，收錄于《衛生部藥品標準》 中藥成方制劑第六冊［4］。Toll 樣受體4 （Tolllike receptor 4，TLR4） 在固有免疫和獲得性免疫中起橋梁作用，是炎癥信號通路的門戶蛋白，在免疫防御中廣泛表達，TLR4 啟動機體炎癥參與入侵病原體的清除，在肺組織中表達升高亦會加重炎癥損傷［5-6］。核因子-κB （nuclear factor-κB，NF-κB） 是TLR4 調節的重要下游分子，其活化是炎癥反應和免疫應答的關鍵調節機制，NF-κB 活化在肺疾病中引發肺部損傷和氣道高反應性狀態［7］。TLR4/NF-κB信號通路在百日咳中的作用機制尚未見報道，故本研究探討復方百部止咳糖漿對百日咳小鼠呼吸道感染模型的影響，并初步探討其作用機制。

1 材料

1.1 動物 78 只4 周齡SPF 級BALB/c 雌性小鼠，體質量（11.23±1.14） g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［實驗動物生產許可證號SCXK （京） 2019-0018］，在溫度 （25±0.5）℃、相對濕度（55±5）%、自然光照環境下常規飼養。本實驗經黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院倫理委員會批準（倫理號2021LSD191）。

1.2 菌株 日本百日咳桿菌標準株Tohama Ⅰ株（上海金畔生物科技有限公司，批號M1917B） 在小鼠肺部進行毒力復蘇，然后將其接種在瓊脂培養基上，37 ℃培養40 h，在無菌室溫環境下將含有菌落的培養液置于離心管中，4 000 r/min 離心10 min，棄培養基，收取菌液，添加TE 緩沖液懸浮菌液，加80%甘油，于-80 ℃保存。

1.3 試劑與藥物 復方百部止咳糖漿 （批號20210613，重慶科瑞制藥有限責任公司）； 羅紅霉素片（批號20210326，石藥集團歐意藥業有限公司），用蒸餾水配制成4 mg/mL 混懸液。瓊脂培養基，小鼠腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL） -1β、IL-6酶聯免疫吸附（ELISA） 試劑盒，CD4-PE 抗體，CD8-FITC 抗體 （ 批號 HB0109-3、HB0402-5、HB1327-4、HB1325-9、HB1912-1、1913-2，青島海博生物技術有限公司）； 蘇木素-伊紅（HE） 染色試劑盒、二氨基聯苯胺顯色試劑、蛋白裂解液（批號BZ-6012、BZ-7143、BZ-8017，北京索萊寶科技有限公司）； 羊抗鼠TLR4、NF-κB、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 單克隆抗體、羊抗鼠二抗 （ 批號ab71241、ab70558、ab79114、ab10871，英 國Abcam 公司）； BCA 試劑盒 （批號PAZ57112-K，上海碧云天生物科技有限公司）。

1.4 儀器 KW-DM-YWH 型小動物肺部定量霧化器、KC6700 型酶標儀（北京元森凱德生物技術有限公司）； F700 型小動物麻醉機、XK-SW002 型光學顯微鏡（北京友誠嘉業生物科技有限公司）；Auto40 型流式細胞儀、5200 型蛋白凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 66 只小鼠參考文獻［8］報道建立百日咳模型，使用實驗Tohama Ⅰ株（濁度3.8×1010CFU/mL，體積5 mL） 霧化30 min，感染7 d。實驗過程中6 只小鼠死亡，其余60 只均表現為聳毛、精神萎靡、易受驚狀態，培養菌落明顯增加，表明模型建立成功［8］，成功率為90.91%。60 只小鼠隨機分為模型組、陽性組（40 mg/kg 羅紅霉素混懸液［9］） 和復方百部止咳糖漿低、中、高劑量組（0.715、1.43、2.86 g/kg，臨床等效劑量的0.5、1、2 倍），每組12 只； 另取12 只同周齡正常小鼠作為對照組。復方百部止咳糖漿各劑量組小鼠每天灌胃給藥2 次，陽性組小鼠每天灌胃給藥1 次，對照組、模型組小鼠每天灌胃給予等體積蒸餾水，連續3 d。

2.2 一般狀況觀察 給藥結束后，觀察小鼠一般狀況，包括精神、運動狀態，皮毛、飲食飲水情況。

2.3 菌落計數檢測 給藥結束后，小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，在麻醉機吸氣端、呼氣端、儲氣囊口采集標本，無菌棉球在麻醉機管腔內壁平速移動2 cm 擦拭取樣，取樣后同一樣品置于同一5 mL 瓊脂培養基上振蕩，取0.5 mL 接種在無菌培養基上，37 ℃培養箱中培養48 h，菌落計數。

2.4 樣本采集 取小鼠腹主動脈血4 mL，分成2份，一份室溫靜置1 h，1 000 r/min 離心10 min，取上清用于炎癥因子水平檢測； 另一份用于CD4＋、CD8＋T 細胞比例檢測。取血后小鼠頸椎脫臼，胸骨劍突處沿著胸骨正中剪開皮膚，肋骨下緣兩側剪開橫骨，提拉胸骨暴露出雙肺，小心取出，左肺置于4%多聚甲醛中固定，右肺置于-80 ℃冰箱中保存。

2.5 HE 染色觀察肺組織形態 取于4%多聚甲醛中固定的肺組織，經乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切片（5 μm），蘇木精染色，乙醇伊紅復染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察拍照。參考文獻［10］ 報道對肺組織損傷進行評分，正常肺組織為0 分； 輕度炎癥現象為1 分； 肺泡壁結構無明顯破壞，出現中度炎癥改變為2 分； 肺泡壁增厚，中度炎癥損傷為3 分；肺組織結構區域性破壞，中至重度炎癥損傷為4 分；肺組織破壞布滿整個視野，重度炎癥損傷為5 分。

2.6 ELISA 法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平 嚴格按照ELISA 試劑盒說明書檢測小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平。

2.7 流式細胞儀檢測腹主動脈血CD4＋、CD8＋T 細胞比例 取各組小鼠血液，加入CD4-PE、CD8-FITC 抗體，黑暗環境下反應30 min，離心后重懸，置于流式細胞儀中，上機檢測CD4＋、CD8＋T 細胞比例。

2.8 Western blot 法檢測肺組織TLR4、NF-κB 蛋白表達 取于-80 ℃冰箱保存的小鼠肺組織約30 mg，添加蛋白裂解液后冰上裂解20 min，4 ℃、10 000 r/min 離心20 min，BCA 試劑盒測定蛋白總濃度，每孔上樣30 μg，電泳分離蛋白質，轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，加入對應一抗TLR4 （1 ∶1 000）、NF-κB （1 ∶1 000）、GAPDH （1 ∶2 000），4 ℃孵育過夜，次日加入二抗（1 ∶4 000），室溫孵育1 h，二氨基聯苯胺顯色試劑顯色，蛋白凝膠成像儀拍照。

2.9 統計學分析 通過SPSS 25.0 軟件進行處理，符合正態分布、方差齊的計量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 復方百部止咳糖漿對小鼠一般狀況的影響 對照組小鼠精神狀態良好、運動活潑，皮毛光亮，飲食飲水正常； 模型組小鼠精神較差，反應遲鈍，皮毛凌亂缺乏光澤，食量下降； 陽性組小鼠精神狀態良好，運動、飲食增加； 復方百部止咳糖漿各劑量組小鼠精神狀態逐漸好轉，運動、飲食增加。

3.2 復方百部止咳糖漿對小鼠菌落數量及肺組織形態的影響 除對照組外，其余各組小鼠均檢測到百日咳桿菌，見圖1。對照組肺泡間隔無增厚； 模型組肺組織肺泡受損明顯，出現異常的肺泡結構、明顯的炎癥浸潤，肺泡增厚和彌漫性間充質水腫明顯； 陽性組肺組織損傷不明顯，出現一定的炎癥浸潤、水腫； 復方百部止咳糖漿各劑量組隨著劑量的增加，肺組織肺泡結構逐漸正常，炎癥浸潤明顯緩解，水腫減輕，肺泡間隔增厚減弱，見圖2。與對照組比較，模型組菌落數量、肺組織損傷評分升高（P＜0.05）； 與模型組比較，復方百部止咳糖漿各劑量組菌落數量、肺組織損傷評分降低 （P＜0.05），并呈劑量依賴性； 與陽性組比較，復方百部止咳糖漿低、中劑量組菌落數量、肺組織損傷評分升高（P＜0.05），高劑量組菌落數量、肺組織損傷評分降低（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠菌落數量、肺組織損傷評分比較（±s，n＝12）Tab.1 Comparison of colony number and pulmonary tissue injury score in mice of each group （±s，n＝12）

表1 各組小鼠菌落數量、肺組織損傷評分比較（±s，n＝12）Tab.1 Comparison of colony number and pulmonary tissue injury score in mice of each group （±s，n＝12）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與陽性組比較，△P＜0.05。

組別菌落數量/個肺組織損傷評分/分對照組0.00±0.000.00±0.00模型組404.42±32.72*3.95±0.36*陽性組204.42±22.48＃2.16±0.23＃復方百部止咳糖漿低劑量組 343.50±25.43＃△3.15±0.32＃△復方百部止咳糖漿中劑量組 262.17±26.62＃△2.57±0.27＃△復方百部止咳糖漿高劑量組87.42±14.34＃△1.86±0.19＃△

圖1 各組菌落觀察Fig.1 Observation of colonies in each group

圖2 各組小鼠肺組織形態學（HE 染色，×200）Fig.2 Mouse pulmonary tissue morphology of each group （HE staining，×200）

3.3 復方百部止咳糖漿對小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平的影響 與對照組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，復方百部止咳糖漿各劑量組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平降低（P＜0.05），并呈劑量依賴性； 與陽性組比較，復方百部止咳糖漿低、中劑量組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平升高（P＜0.05），高劑量組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平降低（P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比較（pg/mL，±s，n＝12）Tab.2 Comparison of serum TNF-α，IL-1β and IL-6 levels in mice of each group （pg/mL，±s，n＝12）

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比較（pg/mL，±s，n＝12）Tab.2 Comparison of serum TNF-α，IL-1β and IL-6 levels in mice of each group （pg/mL，±s，n＝12）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與陽性組比較，△P＜0.05。

組別TNF-αIL-1βIL-6對照組562.12±73.46645.13±43.1656.16±7.48模型組1 023.13±143.16*2 338.16±534.45*186.15±16.35*陽性組737.86±68.47＃1 286.47±268.86＃113.24±11.34＃復方百部止咳糖漿低劑量組865.12±96.15＃△1 756.37±447.81＃△154.48±13.47＃△復方百部止咳糖漿中劑量組793.23±73.42＃△1 568.66±346.19＃△132.44±13.03＃△復方百部止咳糖漿高劑量組647.58±64.73＃△1 067.76±247.77＃△86.48±9.15＃△

3.4 復方百部止咳糖漿對小鼠腹主動脈血CD4＋、CD8＋T 細胞比例的影響 與對照組比較，模型組小鼠腹主動脈血CD4＋T 細胞比例降低（P＜0.05），CD8＋T 細胞比例升高（P＜0.05）； 與模型組比較，復方百部止咳糖漿各劑量組小鼠腹主動脈血CD4＋T細胞比例升高（P＜0.05），CD8＋T 細胞比例降低（P＜0.05），并呈劑量依賴性； 與陽性組比較，復方百部止咳糖漿低、中劑量組小鼠腹主動脈血CD4＋T 細胞比例降低（P＜0.05），CD8＋T 細胞比例升高（P＜0.05），高劑量組小鼠腹主動脈血CD4＋T細胞比例升高（P＜0.05），CD8＋T 細胞比例降低（P＜0.05），見圖3、表3。

表3 各組小鼠腹主動脈血CD4＋、CD8＋T 細胞比例比較（±s，n＝12）Tab.3 Comparison of blood CD4＋and CD8＋T cell ratios in mouse abdominal aorta of each group （±s，n＝12）

表3 各組小鼠腹主動脈血CD4＋、CD8＋T 細胞比例比較（±s，n＝12）Tab.3 Comparison of blood CD4＋and CD8＋T cell ratios in mouse abdominal aorta of each group （±s，n＝12）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與陽性組比較，△P＜0.05。

組別CD4＋T 細胞比例/%CD8＋T 細胞比例/%對照組38.45±1.9820.97±0.95模型組27.91±0.81*31.15±1.59*陽性組32.94±1.36＃23.98±1.05＃復方百部止咳糖漿低劑量組29.89±1.03＃△27.53±1.30＃△復方百部止咳糖漿中劑量組31.79±1.24＃△25.49±1.17＃△復方百部止咳糖漿高劑量組34.63±1.45＃△22.17±1.01＃△

3.5 復方百部止咳糖漿對小鼠肺組織TLR4、NFκB 蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組小鼠肺組織TLR4、NF-κB 蛋白表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，復方百部止咳糖漿各劑量組小鼠肺組織TLR4、NF-κB 蛋白表達降低（P＜0.05），并呈劑量依賴性； 與陽性組比較，復方百部止咳糖漿低、中劑量組小鼠肺組織TLR4、NF-κB 蛋白表達升高（P＜0.05），高劑量組肺組織TLR4、NF-κB蛋白表達降低（P＜0.05），見圖4、表4。

表4 各組小鼠肺組織TLR4、NF-κB 蛋白表達比較（±s，n＝12）Tab.4 Comparison of pulmonary tissue TLR4 and NF-κB protein expressions in mice of each group （±s，n＝12）

表4 各組小鼠肺組織TLR4、NF-κB 蛋白表達比較（±s，n＝12）Tab.4 Comparison of pulmonary tissue TLR4 and NF-κB protein expressions in mice of each group （±s，n＝12）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與陽性組比較，△P＜0.05。

組別TLR4/GAPDHNF-κB/GAPDH對照組0.16±0.030.34±0.05模型組0.86±0.09*1.57±0.18*陽性組0.34±0.05＃0.70±0.06＃復方百部止咳糖漿低劑量組0.67±0.06＃△1.40±0.16＃△復方百部止咳糖漿中劑量組0.51±0.06＃△1.12±0.13＃△復方百部止咳糖漿高劑量組0.23±0.03＃△0.47±0.06＃△

圖4 各組小鼠肺組織TLR4、NF-κB 蛋白條帶Fig.4 Protein bands of pulmonary tissue TLR4 and NF-κB in mice of each group

4 討論

目前，接種百白破疫苗可有效降低百日咳桿菌感染，但不能獲得終身性免疫［11-12］，導致百日咳發病率回升，研究百日咳的有效治療方法對于緩解疾病意義重大。本研究采用Tohama Ⅰ株感染7 d 建立百日咳小鼠呼吸道感染模型，經鑒定，模型小鼠均檢出百日咳桿菌，且均表現為聳毛、精神萎靡、易受驚狀態，與高晶晶等［8］研究一致，證明模型建立成功。

百日咳病因在本虛標實，治療除“祛邪” 外，還應重視“扶正”。祛邪主要指清熱化痰，調肝降逆； 扶正表現為瀉肺祛邪時兼潤肺［3］。復方百部止咳糖漿中百部潤肺下氣、止咳； 苦杏仁止咳平喘、潤腸通便； 桑白皮瀉肺平喘、利水消腫； 麥冬養陰生津、潤肺清心； 知母清熱、鎮咳； 黃芩清熱燥濕、瀉火解毒； 陳皮健脾燥濕化痰、化寒痰； 甘草益氣復脈、鎮咳平喘； 天南星燥濕化痰、祛風止痙； 枳殼利尿、鎮靜、行氣化瘀； 桔梗止咳祛痰、宣肺利咽，全方諸藥相合，具有宣肺止咳、平喘化痰功效［13-14］。本研究以4 周齡小鼠為研究對象，模擬4～5 歲兒童［15］，發現復方百部止咳糖漿可以在一定程度上減少小鼠百日咳細菌數量和肺組織損傷評分，并改善百日咳小鼠肺組織肺泡結構和炎癥浸潤，減輕水腫和肺泡間隔增厚現象，且呈劑量依賴性。提示復方百部止咳糖漿可以在一定程度上改善百日咳小鼠疾病狀況，緩解肺組織損傷情況，實現對百日咳的治療作用。

TLR4 參與炎癥反應與免疫應答調節模式識別受體，細菌、病毒刺激后病原模式分子能被TLR4識別，從而誘發TLR4 活化，活化的TLR4 通過多種途徑促進NF-κB 活化，從而調控基因的表達［16］。而NF-κB 作為核轉錄因子，位于TLR4 下游，正常情況下與抑制蛋白結合沒有活性［17］； 在細胞受到刺激時，NF-κB 與抑制蛋白分離而被活化，活化后的NF-κB 進入細胞核，與靶基因上特定的κB 序列結合，啟動核內相關因子的表達，進而促進下游炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6 的表達［18-19］。TLR4可進一步調節T 細胞免疫，增強免疫活性，放大炎癥效應，從而發揮作用［20］。在機體免疫過程中，CD4＋起輔助作用，CD8＋起免疫抑制作用，二者相互拮抗。研究顯示百日咳患兒的外周血中CD4＋水平降低，CD8＋水平升高，二者比例明顯失調［21］，本研究結果與其一致，說明百日咳小鼠的免疫反應過度。經復方百部止咳糖漿干預后，小鼠血清TNFα、IL-1β、IL-6 水平、腹主動脈血CD8＋T 細胞比例、肺組織TLR4、NF-κB 蛋白表達均降低，腹主動脈血CD4＋T 細胞比例升高，表明復方百部止咳糖漿可能通過抑制TLR4/NF-κB 信號通路降低炎癥因子的表達，緩解免疫過度激活，發揮抗炎作用。

綜上所述，復方百部止咳糖漿可能通過抑制TLR4/NF-κB 信號通路從而降低炎癥因子的表達，緩解過度免疫反應，起到抗炎作用，從而實現對機體的保護，為百日咳的臨床治療提供理論依據。