暗褐網柄牛肝菌化學成分及其抗腫瘤細胞毒活性

陳招莉，符大天，張 蕾，譚林燕，符秀娟

（1.海南省婦女兒童醫學中心，海南 海口 570206； 2.海南醫學院第一附屬醫院，海南 海口 570102；3.海南職業技術學院，海南 海口 570216）

牛肝菌因其肉質肥厚，極似牛肝而得名，為“四大菌王” 之一，主要分布于全球熱帶和亞熱帶地區，包括泰國、老撾、緬甸、斯里蘭卡、印度尼西亞、墨西哥、澳大利亞等［1-2］。我國牛肝菌種質資源豐富，主要分布于廣東、廣西、海南、云南、貴州、四川等地［3］。《滇南本草》 是我國最早記載牛肝菌的醫藥典籍，其記載“牛肝菌，氣味微酸、辛、平，主治清熱解煩，養血和平”［4］。現代研究表明，牛肝菌包括華麗牛肝菌、考夫曼網柄牛肝菌、茶褐牛肝菌等含有豐富的化學成分，包括甾體、黃酮、萜類、多酚等多種活性成分，其中麥角甾體是牛肝菌中特征性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降血糖、保肝利膽、提高人體免疫力、調節內分泌等作用［5-9］。

暗褐網柄牛肝菌又名暗褐脈柄牛肝菌，商品名黑牛肝菌，隸屬于牛肝菌目小牛肝菌科脈柄牛肝菌屬，主要分布于云南、海南等地，其個體肥大，味道鮮美，營養豐富，是備受群眾喜愛的一種牛肝菌，具有很好的開發潛力［10］。然而，有關暗褐網柄牛肝菌的化學成分報道較少，僅見Sun 等［11］從中分離得到7 種吡咯類成分。基于海南熱帶島嶼暗褐網柄牛肝菌資源的優勢，對該真菌進行化學成分研究，從其95%乙醇提取物中分離鑒定了4 個麥角甾烷型甾體類化合物，其中化合物1 為新化合物，并具有一定婦科癌細胞毒活性，為該類高等真菌資源的進一步開發和利用提供了一定的參考和科學依據。

1 材料

AVANCE 600 MHz 核磁共振儀（德國Bruker公司）； 高分辨質譜儀Q-tof （美國Waters 公司）；Spectrum Two FT-IR 紅外光譜儀 （美國Perkin Elmer 公司）； EVO300 紫外分光光度計 （美國Thermo Scientific 公司）； SGW-1 自動旋光儀（上海精科物光儀器有限公司）； P3000 型HPLC 儀（北京創新通恒科技有限公司）； 制備型C18色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC 公司）； 200 ～300 目柱色譜硅膠、硅膠GF254薄層板（青島海洋化工有限公司）。甲醇（批號B2209091）、二氯甲醇 （ 批號 B2209241 ）、乙酸乙酯 （ 批號B2207021）、石油醚 （批號2211027）、正丁醇（批號1811241） 為分析純（西隴科技股份有限公司）； 水（杭州哇哈哈集團有限公司）。

RPMI1640 培養基 （批號SH30809.01，美國Cytiva 公司）； 人肝癌細胞株HepG2 （批號CL-0103）、人肺癌細胞株A549 （批號CL0016）、人宮頸癌細胞株HeLa （批號CL-0101）、人乳腺癌細胞株MCF-7 （批號CL-0149）、人三陰乳腺癌細胞株MDA-MB-231 （批號CL-0150A） （武漢普諾賽生命科技有限公司）。

新鮮暗褐網柄牛肝菌子實體收集于海南省海口市，經海南醫學院藥學院李慧研究員鑒定為暗褐網柄牛肝菌Phlebopusportentosus，標本保存于海南醫學院中藥室標本館（編號20190618PP）。

2 提取與分離

取干燥暗褐網柄牛肝菌子實體粉末350.0 g，95%乙醇冷浸提取3 次，濾過，減壓回收溶劑，濃縮后得總浸膏34.5 g，乙酸乙酯萃取3 次，合并乙酸乙酯，減壓濃縮得到相應部位20.8 g，經硅膠柱層析，以石油醚-二氯甲烷（100 ∶0 ～0 ∶100） 梯度洗脫，得Fr.A ～Fr.F。Fr.C 經硅膠柱層析，以二氯甲烷-甲醇（90 ∶1 ～0 ∶100） 梯度洗脫，得Fr.C-1～Fr.C-7，Fr.C-2 經半制備HPLC 分離純化，以甲醇-水（85 ∶15） 洗脫（體積流量2.0 mL/min，檢測波長210 nm），得到化合物1 （5.8 mg，tR＝16.6 min）； Fr.C-3 經半制備HPLC 分離純化，以甲醇-水（85 ∶15） 洗脫（體積流量2.0 mL/min，檢測波長210 nm），得到化合物2 （4.7 mg，tR＝20.5 min）。Fr.D 經硅膠柱層析，以二氯甲烷-甲醇（100 ∶1 ～0 ∶100） 梯度洗脫，得Fr.D-1 ～Fr.D-6，Fr.D-3 經半制備HPLC 分離純化，以甲醇-水（85 ∶15） 洗脫（體積流量2.0 mL/min，檢測波長210 nm），得到化合物3 （6.5 mg，tR＝21.4 min）；Fr.D-4 經半制備HPLC 分離純化，以甲醇-水（80 ∶20） 洗脫 （體積流量2.0 mL/min，檢測波長210 nm），得到化合物4 （7.2 mg，tR＝26.4 min）。

3 結構鑒定

化合物1： 白色粉末，易溶于甲醇、氯仿等，HR-ESI-MSm/z： 467.313 2 ［M ＋Na］＋，分子式C28H44O4，不飽和度7。UV（甲醇）λmax（logε） ＝246 （0.65） nm； IR （KBr）νmax＝3 440、2 932、1 660、1 615、1 455、1 373、1 054、920 cm-1，表明存在羥基、共軛羰基等官能團。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）譜（表1） 中顯示6 個甲基氫信號δ：1.11 （3H，d，J＝6.6 Hz，H-19），1.05 （3H，s，H-20），0.94 （3H，d，J＝7.8 Hz，H-24），0.85（3H，d，J＝7.2 Hz，H-26），0.87 （3H，d，J＝7.2 Hz，H-27），1.04 （3H，s，H-28）； 7 個亞甲基氫信號δ： 1.67 （1H，m，H-2a），2.09 （1H，m，H-2b），1.34 （1H，m，H-4a），2.16 （1H，m，H-4b），1.58 （2H，m，H-6），2.38 （1H，m，H-7a），4.09 （1H，m，H-7b），1.80 （1H，m，H-11a），1.45 （1H，m，H-11b），1.33 （2H，m，H-12），2.08 （1H，m，H-16a），2.16 （1H，m，H-16b）； 2 個普通烯烴質子信號δ： 5.31 （dd，J＝15.0，7.8 Hz，H-21），5.23 （dd，J＝15.0，7.8 Hz，H-22）； 7 個次甲基氫信號δ： 3.61 （1H，dd，J＝4.8，1.8 Hz，H-1），4.02 （1H，m，H-3），1.48 （1H，m，H-9），1.50 （1H，m，H-17），2.70 （1H，m，H-18），1.88 （1H，m，H-23），2.24 （1H，m，H-25）。結合13C-NMR （150 MHz，CD3OD） （表1） 和HSQC 圖譜，可知有28個碳信號，包括6 個甲基碳信號δ： 20.6 （C-19），17.0 （C-20），16.8 （C-24），18.7 （C-26），19.1（C-27），18.1 （C-28）； 7 個亞甲基碳信號δ：39.7 （C-2），37.0 （C-4），19.0 （C-6），31.1（C-7），30.2 （C-11），31.9 （C-12），42.8 （C-16）； 9 個次甲基碳信號δ： 76.5 （C-1），65.7（C-3），32.9 （C-9），51.6 （C-17），42.9 （C-18），133.0 （C-21），134.6 （C-22），43.0 （C-23），39.3 （C-25）； 6 個季碳信號δ： 74.5 （C-5），150.6 （C-8），42.4 （C-10），40.9 （C-13），140.3 （C-14），207.5 （C-15）。

表1 化合物1 的1H-NMR、13C-NMR 數據Tab.1 1H-NMR and 13C-NMR data on compound 1

以上數據與文獻［12-13］ 報道基本一致，具有相同的麥角甾烷型甾體類特征骨架結構，見圖1。結合分子式信息，可知化合物1 與已知化合物（22E） -8，14-epoxyergosta-6，22-diene-3β，5α，9α-triol［12］的主要不同之處在于前者在C-1 位存在羥基取代，C-6、C-7 位之間存在雙鍵還原，C-9 位存在羥基還原，C-8、C-14、C-15 位之間存在α，β-不飽和酮結構片段。

圖1 化合物1 的結構Fig.1 Structure of compound 1

1H-1H COSY 譜（圖2） 顯示，H-6 （δH1.58）與H-7 （δH2.38，4.09），H-9 （δH1.48）、H-11（δH1.80，1.45） 與H-12 （δH1.33） 相關，推測該結構中C-6、C-7 位間存在-CH2-CH2-，C-9、C-11、C-12 位間存在-CH-CH2-CH2-。HMBC 譜（圖2） 中H-2 （δH1.67，2.09） 與C-1 （δC76.5）、C-3 （δC65.7） 遠程相關，結合其化學位移以及化合物的分子量，判斷C-1、C-3 位存在羥基取代； H-7（δH2.38，4.09） 與C-8 （δC150.6）、C-14 （δC140.3） 遠程相關，H-16 （δH2.08，2.16） 與C-14、C-15 （δC207.5） 遠程相關，結合C-8、C-14、C-15 位的化學位移，推斷三者之間以α，β-不飽和酮的形式連接。結合HMBC、1H-1H COSY 等二維圖譜中的其他關鍵相關信號，確定化合物1 的平面結構，見圖2。

圖2 化合物1 的1H-1H COSY 和HMBC 主要相關Fig.2 Key correlations between 1H-1H COSY and HMBC of compound 1

為了進一步確定其絕對構型，參考該類化合物的生物合成途徑及在B3LYP/6-31 G （d） 基組的水平，發現ECD 圖譜與化合物1 的圖譜一致（圖3），確定其絕對構型為1S，3S，5R，9S，10S，13R，17R，18R，23R，是新化合物，命名為phlesterol A。

圖3 化合物1 的實測和計算ECD 譜圖Fig.3 Measured and calculated ECD spectra of compound 1

化合物2： 白色粉末，ESI-MSm/z： 451.3［M＋Na］＋，分子式C28H44O3Na。1H-NMR （ 600 MHz，CDCl3）δ： 3.93 （1H，m，H-3），6.21（1H，d，J＝8.4 Hz，H-6），6.45 （1H，d，J＝8.4 Hz，H-7），0.85 （ 3H，s，H-18），1.20（3H，s，H-19），0.96 （3H，d，J＝6.6 Hz，H-21），5.11 （1H，dd，J＝8.4，15.0 Hz，H-22），5.19 （1H，dd，J＝8.4，15.0 Hz，H-23），0.79（3H，d，J＝6.0 Hz，H-26），0.77 （3H，d，J＝6.0 Hz，H-27），0.87 （3H，d，J＝7.2 Hz，H-28）；13C-NMR （150 MHz，CDCl3）δ： 34.9 （C-1），30.3 （C-2），66.7 （C-3），37.1 （C-4），82.4 （C-5），135.6 （C-6），130.9 （C-7），79.6（C-8），51.2 （C-9），37.0 （C-10），23.6 （C-11），39.5 （C-12），44.7 （C-13），51.9 （C-14），20.2 （C-15），28.9 （C-16），56.4 （C-17），13.1（C-18），18.4 （C-19），39.5 （C-20），20.8 （C-21），135.4 （C-22），132.5 （C-23），43.0 （C-24），33.3 （C-25），19.9 （C-26），18.4 （C-27），17.8 （C-28）。以上數據與文獻［14］ 報道基本一致，故鑒定為過氧化麥角甾醇。

化合物3： 白色粉末，ESI-MSm/z： 453.3［M＋Na］＋，分子式C28H46O3Na。1H-NMR （ 600 MHz，CDCl3）δ： 5.27 （1H，m，H-7），5.19（2H，m，H-22 ～23），3.97 （1H，m，H-3），3.54 （1H，m，H-6），1.05 （3H，s，H-19），1.02 （3H，d，J＝6.6 Hz，H-21），0.91 （3H，d，J＝6.6 Hz，H-26），0.84 （3H，d，J＝6.6 Hz，H-27），0.82 （3H，d，J＝6.8 Hz，H-28），0.62（3H，s，H-18）；13C-NMR （150 MHz，CDCl3）δ：143.7 （C-8），136.7 （C-22），132.9 （C-23），118.7 （C-7），76.8 （C-5），73.9 （C-6），68.2（C-3），57.1 （C-17），55.7 （C-14），44.5 （C-13），44.0 （C-24），44.0 （C-24），41.5 （C-20），40.4 （C-13），40.1 （C-12），37.9 （C-10），34.1（C-25），33.7 （C-2），31.4 （C-1），29.0 （C-16），23.8 （C-15），22.8 （C-11），21.7 （C-21），20.5 （C-27），20.1 （C-26），18.9 （C-19），18.2（C-28），12.8 （C-18）。以上數據與文獻［15］ 報道基本一致，故鑒定為（22E，24R） -7，22-二烯-3β，5α，6β-麥角三醇。

化合物4： 白色粉末，ESI-MSm/z： 419.3［M＋Na］＋，分子式C28H44ONa。1H-NMR （600 MHz，CDCl3）δ： 5.16 （1H，m，H-7），0.57 （3H，s，H-18），1.01 （3H，s，H-19），1.05 （3H，d，J＝6.6 Hz，H-21），5.20 （1H，m，H-22），5.24（1H，m，H-23），0.80 （3H，d，J＝6.6 Hz，H-26），0.83 （3H，d，J＝6.0 Hz，H-27），0.90（3H，d，J＝7.2 Hz，H-28）；13C-NMR （150 MHz，CDCl3）δ： 38.9 （C-1），38.3 （C-2），212.2 （C-3），44.4 （C-4），43.0 （C-5），30.2 （C-6），117.1 （C-7），139.7 （C-8），49.0 （C-9），34.6（C-10），21.9 （C-11），39.5 （C-12），43.4 （C-13），55.2 （C-14），23.1 （C-15），28.2 （C-16），56.1 （C-17），12.3 （C-18），12.6 （C-19），40.6（C-20），21.3 （C-21），135.7 （C-22），132.1（C-23），43.0 （C-24），33.2 （C-25），20.1 （C-26），19.8 （C-27），17.7 （C-28）。以上數據與文獻［16］ 報道基本一致，故鑒定為麥角甾-7，22E-二烯-3-酮。

4 抗腫瘤細胞毒活性研究

采用MTT 法［17］，以紫杉醇為陽性對照，測定化合物1 ～4 對人肝癌細胞株HepG2、人肺癌細胞株A549、人宮頸癌細胞株HeLa、人乳腺癌細胞株MCF-7、人三陰乳腺癌細胞株MDA-MB-231 的細胞毒活性。選擇對數生長的腫瘤細胞，用RPMI1640培養基培養，以5.0×103/孔的密度接種于96 孔板上，每孔100 μL，在5%CO2、37 ℃孵育箱中培養48 h，加入不同濃度的待測樣品（設空白對照組、陽性對照組），繼續培養48 h 后吸出原培養基，加入0.5 mg/mL MTT 溶液100 μL，孵育4 h 后吸出MTT 溶液，加入100 μL DMSO，低速振蕩5 min，在570 nm 波長處檢測吸光度（A），計算腫瘤細胞生長抑制率，重復3 次，計算IC50值。

結果，化合物1 ～4 對HepG2、A549 細胞毒活性不顯著，IC50值均大于20.0 μmol/L； 化合物1對婦科癌細胞HeLa、MCF-7 的抑制活性較強，IC50值為6.45 ～8.38 μmol/L，對MDA-MB-231 細胞具有一定的細胞毒活性，其IC50值為14.84 μmol/L，見表2。

表2 各化合物對腫瘤細胞的細胞毒活性（±s，n＝3）Tab.2 Cytotoxic activities of various compounds on tumor cells （±s，n＝3）

表2 各化合物對腫瘤細胞的細胞毒活性（±s，n＝3）Tab.2 Cytotoxic activities of various compounds on tumor cells （±s，n＝3）

注： 與紫杉醇比較，**P＜0.01。

化合物IC50/（μmol·L-1）HepG2A549HeLaMCF-7 MDA-MB-231 1 30.48±1.62**27.58±1.45**6.45±0.68**8.38±0.55**14.84±1.15**2 35.65±2.18**22.64±2.35**12.82±1.25**15.38±1.84**19.76±1.33**3 32.87±2.64**24.88±2.14**16.05±2.06**15.84±1.25**22.56±2.08**4 42.58±2.55**38.56±2.18**25.84±1.86**19.63±1.08**28.62±2.05**紫杉醇2.54±0.251.64±0.150.88±0.221.23±0.214.48±0.36

5 結論

本研究通過色譜分離技術及天然產物結構鑒定方法，從暗褐網柄牛肝菌中分離鑒定4 個麥角甾烷型甾體類化合物，其中化合物1 為新化合物； 采用MTT 法測定了化合物1 ～4 對HepG2、A549、HeLa、MCF-7、MDA-MB-231這5 種腫瘤細胞毒活性，發現化合物1 對婦科癌細胞具有一定的細胞毒活性。本研究豐富了暗褐網柄牛肝菌的化學成分，發現了其體外細胞毒活性，為其進一步開發利用積累了基礎數據。