冬蟲夏草蛋白質提取工藝、分析鑒定及藥理作用研究進展

唐楚煜，李秀璋，2，王 濤，陳建博，梁 靜，李玉玲，2*

（1.青海大學畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016； 2.青海省畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016）

冬蟲夏草Chinese cordyceps 是一種長期分布在高寒草甸地帶陰坡或半陰半陽坡的特殊藥用真菌，相較于其他蟲草屬真菌，天然冬蟲夏草由于其地理分布的嚴苛和寄主蝠蛾生境的特殊，所以資源稀缺且價格昂貴［1］。真菌蛋白質作為天然冬蟲夏草的主要活性成分之一，是從絲狀真菌中提取的一種富含礦物質、維生素、人體必需氨基酸的物質，具有獨特的結構和豐富的營養價值［2］。近年來，對冬蟲夏草蛋白質的研究逐漸深入，發現蟲草蛋白除對機體具有提高免疫及抗腫瘤的功效外，也具備作為冬蟲夏草質量鑒定的關鍵活性成分的潛力［3-4］。因此，在天然冬蟲夏草資源極其有限的情況下，尋找一套簡便有效的工藝提取及鑒定方法是研究冬蟲夏草蛋白的關鍵。此外，對冬蟲夏草蛋白藥理活性的深入研究也為冬蟲夏草的進一步開發利用提供理論支持。

1 概述

冬蟲夏草是由麥角菌科真菌冬蟲夏草菌（Ophiocordyceps sinensis） 侵染鱗翅目蝙蝠蛾科（Hepialidae） 幼蟲后形成的真菌子座和充滿菌絲體的僵死幼蟲復合體［5-6］。在我國，天然冬蟲夏草主要分布在3 000 m 以上的高海拔地區，位于西藏、青海、四川等地的高寒灌叢或草甸草原［7-8］，其體內含有的甾醇、蟲草多糖、蛋白質等化學成分和營養物質與其他蟲草品種有所差異，對人體的機能恢復及疾病防御有更高效的作用。據報道，冬蟲夏草對于改善呼吸系統和治療肝臟、心血管、慢性腎臟疾病有較好效果，同時還具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、美白等功效［9-11］。

冬蟲夏草蛋白質作為給機體提供能量及增強免疫的源頭，每一根冬蟲夏草中約含20.06% ～26.40% 的粗蛋白，是冬蟲夏草中含量最高的活性成分［12］。童芯鋅等［13］發現，正品天然冬蟲夏草中共同表達的蛋白斑點有88 個，分別來自菌數據庫（6 個）、昆蟲數據庫（9 個）、全庫（12 個）等，提示功能性蛋白大多為低豐度蛋白。這些蛋白通常由天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、色氨酸等19 種氨基酸組成，其中谷氨酸、酪氨酸和色氨酸為天然冬蟲夏草的主要成分，色氨酸為主要的有效成分［12］。李文慶等［14］發現通過不同加工方式處理冬蟲夏草后氨基酸的種類未發生改變，但隨溫度增高游離氨基酸含量明顯下降，見表1。張晗星等［15-16］研究發現，冬蟲夏草在“由蟲至草” 的轉換過程中，蟲體、子實體及從寄主幼蟲至僵蟲過渡的進程中均有不同蛋白的形成和改變，其體內蛋白的變化存在寄主幼蟲蛋白向真菌蛋白發育過渡的聚類關系。在藥理研究方面，冬蟲夏草蛋白質具有抗氧化［17］、抗炎癥［18-19］、DNAase 活性［17］、抑制身體肥胖［20］等更多的功效，是保證機體健康和提供能量的基礎［21］。

表1 不同加工方式下冬蟲夏草氨基酸組成、含量（±s）

表1 不同加工方式下冬蟲夏草氨基酸組成、含量（±s）

注： 同行肩標不同小寫字母表示差異極顯著（P＜0.01）。

游離氨基酸鮮冬蟲夏草/%曬干冬蟲夏草/%烘干冬蟲夏草/%類型天冬氨酸0.45±0.0220.26±0.0210.32±0.010藥效氨基酸、呈味氨基酸谷氨酸1.11±0.3170.47±0.0300.53±0.052藥效氨基酸、呈味氨基酸天冬酰胺0.18±0.0190.15±0.0070.16±0.006—絲氨酸0.34±0.0080.18±0.0100.19±0.015呈味氨基酸谷氨酰胺0.49±0.3670.80±0.0430.63±0.053—甘氨酸0.22±0.0020.11±0.0090.11±0.007藥效氨基酸、呈味氨基酸組氨酸0.32±0.0070.18±0.0070.15±0.010呈味氨基酸精氨酸0.62±0.0230.39±0.0190.37±0.029藥效氨基酸、呈味氨基酸蘇氨酸0.33±0.01images/BZ_190_734_860_734_875.png60.19±0.0120.19±0.014呈味氨基酸、必需氨基酸丙氨酸0.53±0.0260.35±0.0380.39±0.019呈味氨基酸脯氨酸0.31±0.0130.21±0.0110.24±0.020—酪氨酸0.13±0.0080.16±0.0070.17±0.009藥效氨基酸纈氨酸0.36±0.0110.21±0.0180.21±0.013呈味氨基酸、必需氨基酸甲硫氨酸0.11±0.0030.05±0.0030.06±0.003藥效氨基酸、呈味氨基酸、必需氨基酸異亮氨酸0.26±0.0090.14±0.0070.15±0.010呈味氨基酸、必需氨基酸亮氨酸0.50±0.0130.29±0.0180.30±0.017藥效氨基酸、呈味氨基酸、必需氨基酸苯丙氨酸0.34±0.0090.22±0.0110.21±0.010藥效氨基酸、呈味氨基酸、必需氨基酸色氨酸0.08±0.0020.04±0.0010.05±0.003呈味氨基酸、必需氨基酸賴氨酸0.26±0.0040.17±0.0090.14±0.008藥效氨基酸、必需氨基酸總量7.06±0.271a4.55±0.236b4.57±0.228b—

2 提取工藝

隨著后基因組技術的不斷發展，蛋白質組學成為藥用真菌研究的主要技術［22］。通過蛋白水平對藥用真菌的藥理機制進行研究成為趨勢，因此，獲得高純度的目的蛋白是對該真菌質量評定的重要步驟，也可為進一步的分離純化及分析鑒定提供優質原材料［23］。

2.1 物理提取 為穩定蛋白質和多肽的結構一般使用Tris-HCl 提取液提取真菌蛋白［23］，而不溶于稀鹽、酸、堿的蛋白即與脂類結合的少數蛋白則選用TCA-丙酮溶液、乙醇、異丙酮等有機溶液提取［24］。由于低豐度蛋白的等電點及pH 值與其他蛋白存在差異，用酸、堿法提取往往能獲得更高的提取率［25-26］。研究發現，亞臨界水萃取技術（SWE）具備高滲透和高傳質能力，可替代有機溶劑從天然基質中萃取弱極性物質，大大提高萃取蛋白的能力［27］。楊文雅等［28］利用SWE 技術對蛹蟲草蛋白進行提取，在萃取溫度140 ℃、萃取時間20 min、液料比40 ∶1、萃取pH 值8 時，蛋白得率達33.25%，能有效解決傳統技術提取蛋白時溶出率低的問題，表明該技術相較于傳統熱水浸提法更環保。

由于真菌細胞壁通常是由蛋白質、葡聚糖、甘露聚糖等成分交織形成的堅韌、不易破碎的結構，會導致胞內蛋白難以釋放且提取相對困難［23］。因此，除試劑提取外還有超聲波法、液氮冷凍研磨法、玻璃珠法來進行蛋白的提取［29］。其中超聲波不同于光、電，在傳播過程中可使介質的結構或形態發生改變，所以在部分食品及蛋白質的提取過程中使用超聲提取能在一定程度上加快化學反應，進而提高提取效率［30］。使用超聲對真菌蛋白的提取率略高于回流提取［31-33］。才鳳等［32］采用超聲提取工藝運用單因素和正交實驗優化冬蟲夏草蛋白質提取方法，發現最佳條件為0.02 mol/L 溶劑，pH 值7.4，PBS 緩沖液料液比1 ∶50，提取時間15 min。

2.2 酶提取 酶解法是利用酶的專一性，通過裂解生物細胞壁或消溶該酶類作用對象得到胞內物質的方法，一般提前選擇與該蛋白相對應的酶進行提取［34］。利用酶解法進行蛋白提取時有單酶解和雙酶解兩種方式，常選用胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶［35］。宗靜［34］在提取蛹蟲草活性多肽時發現，雙酶解法的提取率明顯高于水提醇沉法，此外，利用胃蛋白酶和胰蛋白酶的雙酶解法對多肽的提取率明顯高于單酶解法，且在底物濃度為6%，加酶量為2.5%，溫度為42 ℃，時間為8 h 時，多肽提取率最高。相較于其他提取方法，雙酶解法具有反應條件溫和、提取時間短等優勢，但不足之處是提取過程中酶易停留在提取液中，蛋白質的降解也促使其得率下降且成本相對高［36］。綜上所述，冬蟲夏草蛋白提取的報道較少，故可與其他真菌蛋白的提取工藝相互借鑒。此外，真菌胞內蛋白進行提取時通常選用有機溶劑和復合超聲波提取，利用正交實驗和響應面法來優化參數得到最優提取工藝。相較于直接使用有機溶液或水進行提取，選用超聲波輔助提取能使細胞破碎更快并縮短時間，從而提高蛋白得率，因此，使用物理與化學相結合的方法能在一定程度上提高蛋白質提取率并降低損失率，得到相對理想結果。見表2。

表2 不同提取方法下真菌蛋白得率

3 分析鑒定

3.1 分離純化 蛋白質提取完成后一般將大分子混合物分離純化后再進行分析鑒定，通常根據蛋白質的溶解度、分子量、帶電量、吸附程度等性質選擇鹽析法、超濾法、凝膠色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法、高效液相色譜法等方法進行分離純化［34］。任艷［3］選用超濾分離法和葡聚糖凝膠柱層析法分別對冬蟲夏草蛋白進行分離純化，初步分離發現，在1 個柱體積的洗脫時間內，冬蟲夏草的5 個蛋白峰基本得到分離，對該蛋白組分的免疫活性進行研究后發現，其對巨噬細胞分泌因子IL-1、IL-12 等具有雙向調節的免疫作用。由于在分離純化過程中，分子伴侶、結合蛋白、折疊酶等維持正常的蛋白質穩態的小分子蛋白容易發生改變，所以在分離純化前將冬蟲夏草蛋白低溫保存是防止蛋白含量降低的關鍵。

3.2 定量定性分析 對蛋白質含量、分子量、純度、氨基酸組成、蛋白結構的分析測定是深入了解該蛋白的必要過程。基于分析方法原理，蛋白質的分析方法通常分為2 個方面，一方面是根據其共性如肽鏈、肽鍵、含氮量等利用凱氏定氮法、雙縮脲法、電泳法等方法對蛋白質含量進行測定； 另一方面是使用福林酚試劑等測定蛋白質中氨基酸殘基、酸堿性基團等。此外，生物檢定法、免疫學方法、色譜分析、質譜分析、電泳法等也是蛋白質定量定性分析中常用的方法［34，36-38］。

3.2.1 含量分析 化學分析法、色譜法、光譜法是蛋白含量測定過程中較常用的3 種方法［39］。在真菌蛋白檢測中常采用化學分析法，如二辛可寧酸法（BCA 法）、考馬斯亮藍法（Bradford 法）、福林-酚試劑法（Lowry 法）、色譜法中的毛細管電泳法［40］。BCA 法通常使用試劑盒測定總蛋白，其提取溶劑對蛋白提取效果有很大的影響，因此在反映蛋白質含量和對其進行定量跟蹤方面均有困難。Lowry 法為化學顯色法，在測定過程中可能因蟲草內色素物質以及化學物質產生反應，不宜進行準確測定，且其對時間精準度的要求較嚴格。Bradford 法在測定時由于操作誤差小且精密度較高，相較于Lowry 法的Tris 緩沖液、乙二胺四乙酸（EDTA） 等干擾因素，Bradford 法不存在試驗干擾，因此常用于對冬蟲夏草蛋白質含量進行測定［41］。任艷［3］分別使用BCA 法、Bradford 法、Lowry 法對冬蟲夏草可溶性蛋白質含量進行測定，對比發現，相對于其他2 種方法，Bradford 法對冬蟲夏草蛋白提取物、上樣蛋白液含量同組間有重現性好的優勢，且該法對蛋白質含量的影響較小、誤差率較低，但由于不同蛋白質所含精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，使用Bradford 法可能會產生不同程度的偏差。冷平等［41］研究發現，凝膠染色掃描法能有效提高冬蟲夏草蛋白含量測定的精密度和重復性，在一定程度上彌補了Bradford 法的不足，為蛋白質的測定提供新思路。

3.2.2 分子量及純度分析 電泳法作為冬蟲夏草及其他真菌蛋白純度和定量分析的最常用的方法之一，具有重現性好的優點，在多肽及低豐度小分子蛋白的定量分析中具有重要意義。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE） 是蛋白質分子量測定和純度鑒定的常用方法，它是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的一種電泳技術［9］。在運用SDS-PAGE 電泳對蛋白質進行分離時，可根據蛋白質的相對分子量對凝膠的種類和孔徑進行調整，從而將不同蛋白質分離，再對其相對分子量進行檢測評估，該方法相較于層析、瓊脂糖凝膠電泳等分離技術操作更簡便且分辨率高［21］。而雙向凝膠電泳技術（2-DE） 是利用蛋白質的等電點和相對分子質量的差異性在分離過程中通過等電聚焦電泳（IEF） 和SDS-PAGE 電泳進行2 個方向的分離，可將表達豐度差異較大的蛋白進行分析，并能對低豐度蛋白質進行檢測，因此，該技術是目前最高效、分辨率高的復雜蛋白質組分分離技術［9］。

SDS-PAGE 電泳和2-DE 電泳技術已被廣泛使用于真菌蛋白的組分定量分析中［42-43］。李春紅［21］通過SDS-PAGE 電泳得出不同產地蟲草蛋白條帶數量和光密度曲線基本相似，2-DE 電泳進一步分析發現不同產地冬蟲夏草蛋白個數和豐度均存在顯著差異，表明天然冬蟲夏草的可溶性蛋白組分與其來源有一定的關聯。Li 等［44］通過SDS-PAGE 電泳和2-DE 電泳對產地為青海、四川、西藏的26 批天然冬蟲夏草中的蛋白質多樣性進行分析，發現不同產區的冬蟲夏草蛋白條帶存在差異且蛋白質斑點數量和豐度也不同，通過層次聚類分析發現蛋白斑點與產地有一定關系。此外，石繼紅等［45］采用SDS-PAGE 電泳和高效液相色譜（HPLC） 法對冬蟲夏草菌絲體蛋白與天然冬蟲夏草蛋白成分進行分析，發現冬蟲夏草菌絲體所含水溶性蛋白較天然冬蟲夏草的水溶性蛋白組成簡單且分離效果好。綜上所述，SDS-PAGE 電泳和2-DE 電泳作為經典的蛋白質組分分析方法具有高分辨率、重現性好等特點，常用于冬蟲夏草等名貴中藥材蛋白質的分析并在活性蛋白研究中發揮重要作用［46-47］。

3.2.3 氨基酸組成分析 氨基酸組分分析能更直觀地展現成分含量及蛋白構成，因此常利用氨基酸自動分析儀，以外標法對氨基酸含量進行測定。嚴冬等［48］運用氨基酸自動分析儀測定西藏不同產地冬蟲夏草氨基酸的種類和含量，并進行營養評價，研究發現，西藏各產地冬蟲夏草均有19種氨基酸且藥效氨基酸約占總氨基酸量的56%。楊大榮等［49］對蟲草蝙蝠蛾和云南冬蟲夏草氨基酸進行分析，發現蝙蝠蛾幼蟲的氨基酸含量對于整株冬蟲夏草的氨基酸含量起著主導作用。相較于蛋白質分析，氨基酸分析能更直觀清晰且快速地測定蛋白的氨基酸組成，對后期的營養分析及成分藥理研究具有重要意義。但在測定過程中若存在雜蛋白將很大程度影響測定結果，因此在實驗過程中需結合其他方法進行進一步分析鑒定。

4 藥理作用

冬蟲夏草是我國珍貴的滋補腎肺的中藥材，《本草從新》 中指出其具有益腎、止喘、保肺等功效，近年國內外的實驗研究中證實冬蟲夏草可提高機體的免疫功能、對缺氧及血栓性疾病等都有重要作用［3］。其中冬蟲夏草蛋白的藥理研究較少，但蛋白質作為構成細胞的基礎，對機體的生存及各種活動及聯系至關重要，因此蟲草蛋白的作用不容小覷。

4.1 抗衰老、抗氧化 超氧化物歧化酶（SOD） 是存在于植物、動物、微生物體內的一種抗氧化金屬酶，是生物體系中抗氧化酶系的重要組成部分，在生物體內氧化與抗氧化的動態平衡中起著重要作用。《中藥大辭典》 中記載冬蟲夏草具有抗衰老、抗氧化的功效，其主要發揮作用的活性成分就是一種特殊的活性蛋白——超氧化物歧化酶［50］。肖瑛等［51］發現，鮮冬蟲夏草中存在能夠清除自由基及抑制自由基產生的SOD 酶，通過超氧陰離子、羥自由基及DPPH自由基清除實驗證實，鮮冬蟲夏草水提物中具備清理機體內有害物質的能力和抗氧化的作用。Cheng 等［52］發現，冬蟲夏草提取液可逆轉D-半乳糖胺/脂多糖誘導的肝衰竭，該提取液可使雄性小鼠SOD 活性升高，提高小鼠的抗衰能力，通過TUNEL 法等檢測發現冬蟲夏草提取液對肝細胞的凋亡有抑制作用。此外，孫祥環等［53］同樣發現，冬蟲夏草營養液具有抑制大鼠肝勻漿脂質過氧化的功能，并證實發酵冬蟲夏草營養液具有抗衰老作用。

4.2 抗血栓 血栓性疾病是通過血栓形成和血栓栓塞兩種病理過程所引起的疾病，發病率較高且嚴重威脅生命健康［54］。臧琬婷等［55］從冬蟲夏草菌絲中發現了至少2 種纖溶酶，分別命名為OSP-1、OSP-2，其中OSP-1 作為酸性絲氨酸蛋白酶可依次水解纖維蛋白原中的γ、Aα、Bβ 鏈，研究表明該蛋白酶不不僅具備較高的纖溶酶活性，還可能具備激活纖維蛋白溶酶原的作用。研究發現，纖溶酶在不少菌物藥中普遍存在，其活性在pH、金屬離子等因素影響下發揮不同作用，從冬蟲夏草菌絲中提取的纖溶酶相較于蛹蟲草及其他真菌具有更廣的纖溶范圍，同時具有水解γ、Aα、Bβ 三條鏈的獨特優勢，對真菌纖溶酶應用于臨床具有重要意義，也為開發新型溶栓藥物提供新思路［55-56］。

4.3 免疫調節 冬蟲夏草蛋白質在免疫調節中具有重要作用［57］，如從高等擔子菌子實體中提取的真菌免疫調節蛋白（FIPs） 和凝集素等。凝集素是一種非免疫起源的蛋白或糖蛋白，而FIPs 是一種免疫功能與凝集素相似的小分子蛋白，兩者都具有相似的免疫調控、抗病毒、抗腫瘤等藥理功能，在植物體內的防御及代謝過程中扮演著重要角色［58］。隨著真菌蛋白免疫功能的深入研究，He 等［59］在冬蟲夏草分離過程中發現并命名了一種新型多糖蛋白——HS002-Ⅱ，內含42.1% 蛋白質、57.9% 多糖，通過對小鼠巨噬細胞RAW264.7 中一氧化氮（NO）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α） 等細胞因子水平檢測后發現，HS002-Ⅱ具有免疫調節活性，可作為潛在的免疫調節源進行開發。王玉賢等［60］研究發現，冬蟲夏草蛋白提取物同樣具有免疫調節功能，通過ELISA 試劑盒檢測表明，冬蟲夏草蛋白提取物可以促進正常巨噬細胞分泌TNF-α、白細胞介素-1 （IL-1）、白細胞介素-12 （IL-12），并能抑制肺癌細胞A549 的增殖。此外，從冬蟲夏草中提取的多球殼菌素能抑制高濃度葡萄糖誘導的G1/S-特異性周期蛋白-D1 （cyclin D1） 表達升高，使cyclin D1 正常表達［6］。

4.4 其他 冬蟲夏草的活性成分除了蟲草多糖、蟲草腺苷、蟲草蛋白外，還有多種肽類物質，例如cycloaspeptides F～G［61］、cordyceamides A ～B 等蛋白多肽［62］。研究發現，從冬蟲夏草培養液中分離的一種環二肽cordycedipeptide A，對L-929、A375、HeLa 細胞均具有細胞毒活性［6］。此外，氨基酸和部分多肽具備治療高血壓、失眠、記憶、食欲不佳及調節情緒等功能，其中色氨酸作為血清素前體，對情緒及睡眠都有一定的舒緩及調節作用［63］。

5 結語

由于冬蟲夏草特殊的生長環境和相對嚴苛的保存條件，其活性成分的研究十分有限［64］。近年來，冬蟲夏草的研究集中在活性成分的粗提、冬蟲夏草菌菌絲體的發酵和冬蟲夏草寄主昆蟲等［65］。為了緩解天然冬蟲夏草資源短缺，目前已利用深層發酵技術獲得與天然冬蟲夏草藥用價值相當的冬蟲夏草發酵菌絲體，并成功制成“百令膠囊” 等相關產品［7］。

冬蟲夏草作為我國珍貴的藥用蟲生真菌，因其多成分多功效受到眾多關注。冬蟲夏草蛋白質的研究集中于提取、分離純化、鑒定、含量測定方面，超聲波輔助提取［33］、凝膠色譜法純化［3］、Bradford 法含量測定［40］、SDS-PAGE 電泳、2-DE 電泳為冬蟲夏草蛋白提取分析的最佳組合［21］，冬蟲夏草蛋白質具有抗氧化、抗血栓、免疫調節等作用。

目前，對冬蟲夏草蛋白質的研究多停留在粗提物，其功能性多肽的分離鑒定及藥理作用的研究鮮有報道，冬蟲夏草蛋白質藥理作用研究有著巨大潛力［60］。利用特征多肽或蛋白作為指標成分對冬蟲夏草進行真偽鑒定或質量評價，亦或是新型冬蟲夏草蛋白類藥物開發，都需要對冬蟲夏草蛋白質或蟲草多肽進行更深入的研究。此外，冬蟲夏草蛋白質的合成過程及代謝途徑未有報道，有待進一步研究。建立科學的、系統的冬蟲夏草蛋白質提取、分離純化、鑒定體系，并對蛋白合成途徑和結構深入分析是未來冬蟲夏草蛋白質的研究重點。