金絲桃苷納米結構脂質載體制備及其體內藥動學研究

張艷慧，董亞娜，談秀鳳

（1.黃河科技學院，河南 鄭州 450063； 2.上海中醫藥大學，上海 201203）

金絲桃苷是普遍存在于金絲桃科、藤黃科、桔梗科、杜鵑花科、豆科植物中的一種黃酮醇苷類化合物［1］，具有抑制痛經、抗抑郁、抗炎、心腦血管保護、抗血栓、抗急性肝損傷等作用［1］，并且在婦科腫瘤方面中的應用也較多，可用于治療卵巢功能不全、卵巢癌、子宮癌等［1-3］，但其水溶性差［4］，體外溶出度低［5］，口服吸收生物利用度僅為10%左右［6］，導致藥理作用無法充分發揮。前期報道，Feng 等［7］制備了金絲桃苷脂質體，但工藝復雜； Shen 等［8］制備了金絲桃苷納米混懸劑，但粒徑達384 nm，可能會限制其生物利用度提高程度［9］。

納米結構脂質載體具有較高的包封率、載藥量，可有效提高生物利用度、藥效［10-13］，是制劑學領域研究的熱門技術之一。因此，本實驗制備金絲桃苷納米結構脂質載體，并考察其體內藥動學，以期為相關制劑學研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器 BSA224S 型電子天平（德國Sartorius 公司）；Agilent 1200 型高效液相色譜儀，配置DAD 檢測器、溫控進樣盤（美國Agilent 公司）； JP-060S 型超聲儀（深圳市明望科技有限公司）； Alpha 1-4 型真空冷凍干燥機（北京博勱行儀器有限公司）； Nano-ZS90 型粒度分析儀 （英國Malvern Panalytical 儀器有限公司）； HJ-4A 型恒溫磁力攪拌器（常州市凱航儀器有限公司）； D-37520 型高速離心機（德國Kendro 儀器公司）； UGC-12M 型氮氣吹掃儀（北京優晟聯合科技有限公司）。

1.2 試劑與藥物 金絲桃苷原料藥（批號20190719，純度＞90%，杭州甫洛生物科技有限公司）； 金絲桃苷對照品（批號111521-1909，純度95.4%，中國食品藥品檢定研究院）； 山崳酸甘油酯對照品（批號20190225，國藥集團化學試劑有限公司）； 乙酰苯胺對照品（批號202004-1，純度98.2%，南京森貝伽生物科技有限公司）。Miglyol ?812 （批號20180708，北京鳳禮精求醫藥股份有限公司）； 泊洛沙姆188 （批號181118，武漢興起點生物科技有限公司）； 超濾離心管（截留分子量8 000～14 000 Da，美國Pall 公司）。

1.3 動物 SD 大鼠，體質量240～270 g，購于河南省實驗動物中心，動物生產許可證號SCXK （豫） 2016-0001。

2 方法與結果

2.1 納米結構脂質載體制備 取金絲桃苷原料藥50 mg 及處方量山崳酸甘油酯、液體脂質Miglyol ?812，置于燒瓶中，加入10 mL 甲醇，70 ℃水浴加熱溶解，作為有機相；蒸餾水配制50 mL 泊洛沙姆188 溶液，70 ℃水浴加熱溶解，作為水相，在900 r/min 攪拌速度下將有機相滴加至水相中，持續攪拌2 h 以除盡有機溶劑，設置超聲功率為1 138 W的30%，超聲時間為20 min，置于-18 ℃冰箱中固化8 min，0.45 μm 微孔濾膜過濾，續濾液加蒸餾水至50 mL，即得。

2.2 金絲桃苷含量測定 采用HPLC 法。

2.2.1 色譜條件 Agilent SB-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）； 流動相乙腈-0.1% 磷酸（20 ∶80）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫35 ℃； 檢測波長360 nm。

2.2.2 線性關系考察 取金絲桃苷對照品10 mg，置于50 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，得200 μg/mL 貯備液，流動相依次稀釋至40.0、20.0、5.0、1.0、0.1、0.05 μg/mL，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積 （Y） 對質量濃度 （X） 進行回歸，得方程為Y＝16.341 8X＋0.627 5 （r＝0.999 6），在0.05～40.0 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.3 供試品溶液制備 取納米結構脂質載體混懸液1 mL，置于10 mL 量瓶中，加8 mL 甲醇超聲處理以破壞其結構，流動相定容至刻度，取1 mL 至10 mL 量瓶中，流動相定容至刻度，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2.4 方法學考察 取納米結構脂質載體混懸液1 mL，按“2.2.3” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得金絲桃苷含量RSD為1.41%，表明該方法重復性良好。取供試品溶液適量，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得金絲桃苷含量RSD 為0.45%，表明儀器精密度良好。取供試品溶液適量，于0、4、8、12、16、24 h 在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得金絲桃苷含量RSD 為1.07%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。取納米結構脂質載體混懸液1 mL，共9 份，置于9 個10 mL 量瓶中，分成低、中、高3 組，分別加入200 μg/mL 貯備液0.8、1.2、1.6 mL，加8 mL 甲醇超聲處理以破壞其結構，按“2.2.3” 項下方法制備份供試品溶液，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得金絲桃苷平均加樣回收率分別為100.67%、98.96%、100.09%，RSD 分別為1.82%、1.53%、1.46%。

2.3 包封率、載藥量測定 先計算金絲桃苷總含量（m總）。再取納米結構脂質載體混懸液1 mL，置于超濾管（截留分子量8 000 ～14 000 Da） 中，設置轉速為10 000 r/min，溫度為4 ℃，時間為30 min，取續濾液，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算游離藥量（m游離）。包封率、載藥量計算公式分別為載藥量＝ ［（m總-m游離） /（m總＋m納米粒）］ ×100%、包封率＝ ［（m總-m游離） /m總］ ×100%，其中m納米粒為納米粒總質量。

2.4 粒徑、Zeta 電位測定 取納米結構脂質載體混懸液0.5 mL，蒸餾水稀釋20 倍，取適量在粒度分析儀上測定粒徑、多分散系數（PDI）、Zeta 電位。

2.5 處方優化 采用Box-Behnken 響應面法。

根據預實驗結果，固定投藥量50 mg，以固態脂質用量（X1）、液態脂質用量（X2）、表面活性劑（泊洛沙姆188） 濃度 （X3） 為影響因素，包封率 （Y1）、載藥量（Y2）、粒徑（Y3） 為評價指標，Box-Behnken 響應面法優化處方，因素水平見表1，結果見表2。

表1 因素水平

表2 試驗設計與結果

表3 方差分析

響應面分析見圖1。由此可知，在一定范圍內固態脂質用量、液態脂質用量增加可使包封率升高，但隨著前者用量增加載藥量呈先升后降的趨勢，而后者對其影響較復雜； 表面活性劑用量對包封率、載藥量的影響均為先升后降； 隨著固態脂質用量增加粒徑呈現先降后升的趨勢，而液態脂質用量對其影響不大； 隨著表面活性劑增加粒徑先降后升，并且液態脂質用量對其影響較小； 隨著表面活性劑、固態脂質用量增加粒徑先降后升。

圖1 各因素響應面圖

最終確定，最優處方為固態脂質用量1 015.59 mg，液態脂質用量269.41 mg，表面活性劑濃度1.12%，包封率為91.74%，載藥量為3.48%，粒徑為158.14 nm，為便于實際操作，將其修正為固態脂質用量1 015 mg，液態脂質用量270 mg，表面活性劑濃度1.1%。按優化處方平行制備3批樣品（圖2），測得平均包封率為89.92%，載藥量為3.37%，粒徑為162.56 nm （圖3），后兩者與預測值3.48%、158.14 nm 較接近，同時平均Zeta 電位為-34.28 mV （圖4）。

圖2 金絲桃苷納米結構脂質載體外觀

圖3 金絲桃苷納米結構脂質載體粒徑分布

圖4 金絲桃苷納米結構脂質載體Zeta 電位

2.6 凍干粉制備 取納米結構脂質載體混懸液適量，加入5%凍干保護劑甘露醇，振蕩混勻，在-30 ℃下預凍3 d，置于冷凍干燥儀（冷阱值-50 ℃） 中，抽真空（0.1 MPa）1 d，即得 （圖5）。經測定，其復溶后平均包封率為81.14%，平均粒徑為217.43 nm，Zeta 電位為-31.48 mV。

圖5 金絲桃苷納米結構脂質載體凍干粉外觀

2.7 體外釋藥研究 取金絲桃苷及其納米結構脂質載體凍干粉適量（金絲桃苷含量均為40 mg），空白介質制成混懸液，轉移至活化透析袋中，手術線將兩端封口。以脫氣后的蒸餾水為釋藥介質，于設定取樣點各取樣5 mL 后立即補加同體積空白介質，8 000 r/min 離心15 min，取上清液，測定累積釋放度，結果見圖6。由此可知，原料藥在前6 h釋藥較快，累積釋放度為21.96%，之后程度趨緩，48 h 內累積釋放度僅為33.71%； 納米結構脂質載體在前8 h 釋放較快，累積釋放度為44.90%，之后緩慢升高，48 h 內累積釋放度為71.77%。

圖6 金絲桃苷體外釋藥曲線（±s，n＝6）

2.8 體內藥動學研究

2.8.1 血漿樣品處理 參考文獻［14］ 報道，取200 μL解凍后血漿樣品，加入20 μL 內標 （乙酰苯胺） 溶液（1 000 ng/mL）、500 μL 乙腈［15］，渦旋60 s，4 ℃、8 500 r/min 離心10 min，取上層溶液，45 ℃氮氣緩慢吹干得殘渣，200 μL 乙腈復溶，4 ℃、8 500 r/min 離心5 min。

2.8.2 線性關系考察 取適量對照品溶液，45 ℃氮氣緩慢吹干，空白血漿依次稀釋至3 000、1 500、1 000、500、100、50 ng/mL，即得血漿對照品溶液，按“2.8.1” 項下方法處理，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積（Y） 對質量濃度（X） 進行回歸，得方程為Y＝0.137 2X-10.11 （r＝0.992 6），在50～3 000 ng/mL 范圍內線性關系良好。

2.8.3 方法學考察 取50、1 000、3 000 ng/mL 血漿對照品溶液適量，同一天內在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得金絲桃苷含量RSD 分別為9.61%、5.27%、6.14%，表明該方法日內精密度良好； 于0、1、2、3、4、6 d 同法各測定6 次，測得金絲桃苷含量RSD 分別為9.66、4.10%、6.43%，表明該方法日間精密度良好。取灌胃給藥1 h 后血漿樣品適量，于0、2、4、6、8、12 h 在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得金絲桃苷含量RSD 為9.06%，表明樣品在12 h 內穩定性良好。取50、1 000、3 000 ng/mL血漿對照品溶液適量，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得金絲桃苷平均加樣回收率分別為89.21%、93.69%、91.74%，RSD 分別為5.37%、8.04%、7.69%。

2.8.4 分組、造模與給藥 取金絲桃苷及其納米結構脂質載體凍干粉適量，加入0.5%CMC-Na 溶液（金絲桃苷質量濃度均為5 mg/mL，現用現配） 制成灌胃液。12 只大鼠隨機分為2 組，每組6 只，實驗前禁食12 h，自由飲水，以40 mg/kg 劑量給藥，于0.5、1、2、3、4、4.5、5、6、8、10、12 h 眼眶后靜脈叢取血，置于肝素化離心管中，振蕩混勻，3 000 r/min 離心3 min，取上層血漿，密封后冷凍保存。

2.8.5 結果分析 血藥濃度-時間曲線見圖7，主要藥動學參數見表4。由此可知，與原料藥比較，納米結構脂質載體tmax、t1/2延長 （P＜0.01），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.01），相對生物利用度增加至3.19 倍。

圖7 金絲桃苷血藥濃度-時間曲線（±s，n＝6）

表4 金絲桃苷主要藥動學參數（±s，n＝6）

表4 金絲桃苷主要藥動學參數（±s，n＝6）

注： 與金絲桃苷比較，**P＜0.01。

參數單位金絲桃苷金絲桃苷納米結構脂質載體tmaxh1.89±0.333.08±0.52**t1/2h4.90±0.616.74±0.93**Cmaxμg·L-1 1 191.07±155.832 446.35±306.43**AUC0～t μg·L-1·h 4 354.19±628.67 13 897.32±1 688.71**AUC0～∞ μg·L-1·h 5 038.22±689.71 14 906.46±1 846.64**

3 討論

對于納米結構脂質載體而言，包封率、載藥量、粒徑是最主要的指標，包封率較高時載藥量可能較低，后者較高時前者亦然，故僅選擇1 ～2 個指標來優化處方并不全面［11］。另外，制劑粒徑也會影響口服吸收生物利用度［16］，由于本實驗希望得到200 nm 粒徑以下納米制劑，故需同時考慮包封率、載藥量、粒徑這3 個指標。另外，正交試驗優化處方時精確度較差，重復性可能存在問題［17］； Box-Behnken 響應面法精確度較高，可全面研究幾種因素的交互作用，重復性較高，故本實驗采用該方法進行處方優化。

前期報道，金絲桃苷臨床用量為90 mg［18］，故成人用藥劑量為1.5 mg/kg （平均體質量以60 kg 計），折換成大鼠等效劑量為9.45 mg/kg （大鼠與人等效劑量比為6.3［19］），但受到檢測條件的限制，目前藥動學實驗中所用劑量高于人體實際劑量［19］。另外，大鼠給藥劑量為175 mg/kg時無明顯毒副作用［20］，結合實際條件，本實驗選擇40 mg/kg劑量來考察金絲桃苷納米結構脂質載體體內藥動學。

結果顯示，金絲桃苷納米結構脂質載體tmax延長，Cmax、口服生物利用度升高，可能是由于胃腸道對納米粒黏附性的影響，以及藥物從納米結構脂質載體釋放出來需要克服的屏障較多，并且納米結構脂質載體使原料藥比表面積激增，從而促進其溶出；t1/2延長，表明體內循環時間增加；原料藥與胃腸道接觸面積增加，有助于其經胞間、淋巴轉運等進入血液循環［21-22］； 相對生物利用度增加至3.19 倍，高于Shen 等［8］報道（增加210.63%）。但藥物口服吸收是一個非常復雜的過程，制劑在胃腸道中的穩定性（粒徑增大、藥物泄露等）、胃腸道黏膜上黏蛋白的排斥作用等因素均會影響生物利用度提高程度，尚需進一步研究。