冬凌草甲素類脂囊泡制備及其體內藥動學研究

王美麗，唐 靜，方曉東，王曉靜，豆銀霞

（1.鄭州澍青醫學高等專科學校，河南 鄭州 450064； 2.河南大學，河南 開封 475004）

冬凌草甲素是從冬凌草中提取出的一種二萜類化合物，具有清熱解毒、心血管保護、降血壓、抑菌、止痛、增強免疫等活性［1-4］，在卵巢癌［5-6］、乳腺癌［6-7］、子宮內膜癌［8］等婦科腫瘤方面也具有較好的治療作用，還可用于婦科消炎等［1］，具有重大開發價值。該成分在37 ℃水中的溶解度為0.64 g/L，容易導致藥物溶出受限； 表觀油水分配系數lgP為1.66［9］，在水中不穩定，容易發生降解［10］； 絕對口服生物利用度僅約為10%［11］，目前已有膠束［12］、自微乳［13］、固體分散體［14］、磷脂復合物［14］、固體脂質納米粒［15］等相關報道。

類脂囊泡一般由非離子表面活性劑在水中自組裝形成，為增加其機械強度，往往在處方中加入一定量的膽固醇［16-17］，可包載脂溶性、水溶性藥物，其結構與脂質體類似，但類脂囊泡處方中不含易氧化的磷脂或磷脂衍生物類物質，具有更高的儲存穩定性［17-18］，并且其囊材廉價易得。因此，本實驗制備冬凌草甲素類脂囊泡，并考察其體內藥動學，以期為該相關藥物研發提供一種新型給藥制劑。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；XWD-08T 型超聲儀（深圳市鑫旺達超聲波自動化設備有限公司）； BSA224S 型電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］； JB-4 型恒溫磁力攪拌器（常州金壇精達儀器制造有限公司）； MDS-2008DS 型溶出儀（寧波新芝藥檢科技有限公司）； Master-sizer 型粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）； Venus-3 型真空凍干機（杭州富瑞捷科技有限公司）。

冬凌草甲素對照品（批號111721-211127，純度99.1%，中國食品藥品檢定研究院）； 冬凌草甲素原料藥（批號k28473，純度98%，西安開來生物工程有限公司）。司盤-60 （批號191210，江蘇采薇生物科技有限公司）； 海藻糖（批號190210，南京松冠生物科技有限公司）； 膽固醇（批號20200517，西格瑪奧德里奇上海貿易有限公司）。模擬胃液（含胃蛋白酶，批號20220816）、模擬腸液（含胰蛋白酶，批號20220915） （東莞市信恒科技有限公司）。甘露醇（批號20191105，上海康朗生物科技有限公司）； 蔗糖（批號20191008，南京松冠生物科技有限公司）。

SD 大鼠，雌雄兼具，體質量（220±20） g，購自河南省動物實驗中心，動物生產許可證號SCXK （豫） 2020-0001。

2 方法與結果

2.1 冬凌草甲素含量測定 采用HPLC 法。

2.1.1 色譜條件 Agilent Zorbax C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm），測定血藥濃度時串聯預柱（4 mm×4 mm，5 μm）； 流動相甲醇-水（60 ∶40）； 體積流量1 mL/min；柱溫35 ℃； 檢測波長238 nm； 進樣量10 μL。

2.1.2 供試品溶液制備 取類脂囊泡混懸液1 mL，置于100 mL 量瓶中，加入50 mL 甲醇超聲處理6 min，甲醇稀釋定容，取5 mL 至10 mL 量瓶中，流動相定容，即得。

2.1.3 線性關系考察 精密稱取冬凌草甲素對照品12.48 mg，置于50 mL 量瓶中，甲醇溶解，制成249.6 μg/mL貯備液，流動相依次稀釋至12.48、6.24、1.248、0.624、0.124 8、0.062 4 μg/mL，即得對照品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，得方程為Y＝23.117X-0.509（r＝0.999 8），在0.062 4 ～12.48 μg/mL 范圍內線性關系良好。

2.1.4 方法學考察 取同一份類脂囊泡混懸液，按“2.1.2” 項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得冬凌草甲素含量RSD 為1.40%，表明該方法重復性良好。取供試品溶液適量，于0、2、4、6、12、18 h 在“2.1.1” 項色譜條件下測定，測得冬凌草甲素含量RSD 為0.49%，表明溶液在18 h 內穩定性良好。取0.062 4、1.248、12.48 μg/mL 對照品溶液適量，在“2.1.1” 項色譜條件下各進樣測定6 次，測得冬凌草甲素含量RSD 分別為0.97%、0.28%、0.24%，表明儀器精密度良好。取9 份脂囊泡混懸液，每份0.5 mL，置于100 mL 量瓶中，分為低、中、高3 組，每組3 份，分別加入貯備液0.8、1.6、2.4 mL，按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得冬凌草甲素平均加樣回收率分別為101.04% （RSD ＝1.07%）、100.23% （RSD＝0.65%）、99.01% （RSD＝0.90%）。

2.2 類脂囊泡制備 采用薄膜分散法［16-17］。固定冬凌草甲素用量20 mg，稱取處方量膽固醇、司盤至圓底燒瓶中，加入適量二氯甲烷，45 ℃水浴磁力攪拌溶解并減壓旋蒸除去二氯甲烷，在容器內壁形成一層均勻薄膜，加入一定pH值磷酸鹽緩沖液25 mL，45 ℃水浴磁力攪拌水化一定時間，超聲（功率200 W） 處理15 min，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 包封率、載藥量測定 取類脂囊泡混懸液1 mL 至超濾管中 （截留分子量10 000 Da），10 000 r/min 離心20 min，測定冬凌草甲素游離量（m游離）； 另取1 mL，測定冬凌草甲素總含量（m總）； 另取1 mL，在-50 ℃下預凍2 d 后真空凍干，測定粉末質量（m0），計算包封率、載藥量，公式分別為包封率＝ ［（m總-m游離） /m總］ ×100%、載藥量＝ ［（m總-m游離） /m0］ ×100%。

2.4 粒徑、PDI、Zeta 電位測定 取類脂囊泡混懸液適量，蒸餾水稀釋50 倍，常溫下采用粒度分析儀測定（粒徑入射角165°），平行3 份，取平均值。

2.5 單因素試驗

2.5.1 司盤種類 固定冬凌草甲素用量20 mg，囊材（司盤＋膽固醇） 總用量400 mg，司盤與膽固醇用量1 ∶1，水相pH 值6.0，考察司盤種類對包封率、載藥量的影響，結果見圖1。由此可知，司盤80 制得的類脂囊泡包封率、載藥量最低，可能是由于它含不飽和長鏈，可使長鏈彎曲變性，導致類脂囊泡通透性增加，藥物容易泄露［19］； 司盤20、40、60 均為飽和脂肪鏈，其中司盤60 脂肪鏈最長，可更有效地阻止藥物泄露［19］，使得包封率、載藥量最高，故選擇司盤60 制備類脂囊泡。

圖1 司盤種類對包封率、載藥量的影響（n＝3）

2.5.2 司盤60 與膽固醇比例 固定冬凌草甲素用量20 mg，囊材總用量400 mg，水相pH 值6.0，考察司盤60與膽固醇比例對包封率、載藥量的影響，結果見圖2。由此可知，隨著膽固醇用量增加包封率、載藥量均先升后降，當司盤60 與膽固醇比例為1 ∶1.5 時兩者最高； 雖然膽固醇可賦予囊泡一定的剛性［17］，但其比例較小時囊泡流動性較強，導致藥物容易泄露，而用量過大時膜曲率變小，導致囊泡總表面積、容納藥物空間更小，使得兩者均降低，故選擇1 ∶1.5 作為司盤60 與膽固醇比例。

圖2 司盤60 與膽固醇比例對包封率、載藥量的影響（n＝3）

2.5.3 囊材用量 固定冬凌草甲素用量20 mg，司盤60 與膽固醇比例1 ∶1.5，水相pH 值6.0，考察囊材用量對包封率、載藥量的影響，結果見圖3。由此可知，隨著囊材用量增加包封率先升后趨穩，載藥量先升后降，為400 mg 時兩者最高，故選擇400 mg 作為囊材用量。

圖3 囊材用量對包封率、載藥量的影響（n＝3）

2.5.4 水相pH 值 固定冬凌草甲素用量20 mg，司盤60與膽固醇比例1 ∶1.5，囊材用量400 mg，考察水相pH 值對包封率、載藥量的影響，結果見圖4。由此可知，水相pH 值較低時包封率、載藥量均較低，為7.4 時兩者均較高，可能是由于水相pH 值較低時原料藥溶解度更大［9］，更容易進入水相［19］，故選擇7.4 作為水相pH 值。

圖4 水相pH 值對包封率、載藥量的影響（n＝3）

2.6 驗證試驗 “2.5” 項下結果顯示，最優處方為冬凌草甲素用量20 mg，司盤60 與膽固醇比例1 ∶1.5，囊材用量400 mg，水相pH 值7.4。按上述優化處方制備3 批樣品，測得平均包封率為82.94%，載藥量為3.96%，粒徑為243.87 nm，PDI 為0.145 （圖5），Zeta 電位為-34.80 mV（圖6），表明類脂囊泡表面帶負電荷，并且絕對值大于30 mV，即存在較強的靜電排斥力，有利于增加類脂囊泡穩定性。

圖5 冬凌草甲素類脂囊泡粒徑分布

圖6 冬凌草甲素類脂囊泡Zeta 電位

2.7 凍干粉制備 將海藻糖與甘露醇按1 ∶1 比例混勻，作為凍干保護劑。取類脂囊泡混懸液20 mL，加入3%凍干保護劑振蕩溶解，分成若干份后置于西林瓶中，在-50 ℃下預凍2 d，置于-40 ℃冷凍干燥機中凍干1 d，取出，即得。另外，類脂囊泡混懸液加入蒸餾水稀釋30 倍后可見藍色乳光，而其凍干粉外觀飽滿，無色差。

2.8 穩定性研究 取類脂囊泡凍干粉適量，密封后置于溫度30 ℃、相對濕度65% 的恒溫恒濕箱中，于0、10、15、30、60 d取樣，測定包封率、粒徑，平行3 次，結果見圖7。由此可知，凍干粉包封率、粒徑分別為80.41%、276.13 nm；放置60 d后前者降至78.02%，后者升至290.38 nm，即變化程度不明顯，表明其穩定性良好。

圖7 穩定性試驗結果（n＝3）

2.9 體外釋藥研究 取類脂囊泡凍干粉適量（冬凌草甲素含量均為20 mg），加入5 mL 模擬胃液，置于活化透析袋（平均截留分子量10 000 Da） 中扎緊，設定釋放介質為900 mL 模擬胃液，轉速為100 r/min，待介質溫度恒定至（37±1）℃后于0、10、15、30、45、60、75、90、120 min各取樣3 mL，并補加3 mL 模擬胃液，而原料藥粉末直接置于釋藥介質中，6 000 r/min 離心15 min，測定冬凌草甲素含量； 同法測定素類脂囊泡凍干粉在模擬腸液中的釋藥情況，取樣時間點為0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、12 h，結果見圖8～9。由此可知，類脂囊泡在模擬胃液、模擬腸液中的累積釋放度均高于原料藥［20］，可能是由于后者在酸性、堿性介質中容易降解所致［10］。

圖8 模擬胃液中冬凌草甲素體外釋藥曲線（n＝6）

圖9 模擬腸液中冬凌草甲素體外釋藥曲線（n＝6）

2.10 溶解度測定 取過量冬凌草甲素、物理混合物（配比同類脂囊泡凍干粉）、類脂囊泡凍干粉適量，置于蒸餾水中，超聲（功率200 W） 處理30 min 得混懸液，37 ℃水浴中磁力攪拌2 d，取混懸液，12 500 r/min 離心20 min［21］，取上清液，測定溶解度，結果分別為0.64、0.78、4.06 g/L，即原料藥在類脂囊泡中的溶解度增加至6.34 倍。

2.11 體內藥動學研究

2.11.1 分組、給藥與采血 12 只大鼠隨機分為2 組，每組6 只，分別灌胃給予冬凌草甲素（0.5%CMC-Na 溶液制備，3 mg/mL） 及其類脂囊泡（蒸餾水制備，3 mg/mL），劑量均為20 mg/kg，于0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、3、4、6、8、12 h 眼眶取血各約250 μL，置于肝素化離心管中，立即振蕩混勻以防止溶血，3 500 r/min 離心2 min，密封后冷凍保存。

2.11.2 血漿樣品處理 將血漿樣品在37 ℃水浴中復溶，取100 μL，加入2 mL 甲醇密封，渦旋5 min，10 000 r/min離心5 min 沉淀蛋白，取上層有機相，40 ℃氮氣吹干，加100 μL 甲醇渦旋復溶。

2.11.3 線性關系考察 取對照品溶液適量，甲醇制成1 600、800、400、200、100、50 ng/mL，分別取100 μL，40 ℃氮氣吹干，加100 μL 空白血漿渦旋復溶，即得血漿對照品溶液，按“2.11.2” 項下方法處理，在 “2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積（Y） 對其質量濃度（X） 進行回歸，得方程為Y＝1.161X＋141.7 （r＝0.994 6），在50～1 600 ng/mL 范圍內線性關系良好。

2.11.4 方法學考察 取100 μL 空白血漿，按“2.11.2”項下方法處理，另取灌胃給藥12 h 后血漿樣品、血漿對照品溶液（50 ng/mL） 適量，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖10，可知雜質未干擾測定，表明該方法專屬性良好。取50、400、1 600 ng/mL 血漿對照品溶液適量，同一天內在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得冬凌草甲素峰面積RSD 分別為7.14%、5.32%、6.08%，表明該方法日內精密度良好； 同法連續測定6 d，每天1次，測得冬凌草甲素峰面積RSD 分別為8.04%、5.17%、7.44%，表明該方法日間精密度良好。取400 ng/mL 血漿對照品溶液適量，于0、2、4、8、12、18 h 在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得冬凌草甲素峰面積RSD 為6.69%，表明樣品在18 h 內穩定性良好。取50、400、1 600 ng/mL 血漿對照品溶液適量，在“2.1.1” 項色譜條件下各進樣測定3 次，測得冬凌草甲素平均加樣回收率分別為91.60% （RSD ＝7.67%）、96.07% （RSD ＝6.98%）、93.94% （RSD＝7.67%）。

圖10 冬凌草甲素HPLC 色譜圖

2.11.5 結果分析 血藥濃度-時間曲線見圖11，主要藥動學參數見表1。由此可知，與原料藥比較，納米囊泡tmax、t1/2延長 （P＜0.01），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高 （P＜0.01），相對生物利用度增加至5.38 倍。

表1 冬凌草甲素主要藥動學參數（±s，n＝6）

表1 冬凌草甲素主要藥動學參數（±s，n＝6）

注： 與冬凌草甲素比較，**P＜0.01。

參數單位冬凌草甲素冬凌草甲素類脂囊泡tmaxh0.77±0.342.07±0.64**Cmaxng·mL-1337.28±71.691 216.41±337.83**t1/2h2.30±0.595.78±0.94**AUC0～tng·mL-1·h 975.16±109.53 5 241.83±712.06**AUC0～∞ng·mL-1·h 1 013.27±115.90 5 460.22±811.74**

圖11 冬凌草甲素血藥濃度-時間曲線（n＝6）

3 討論與結論

體外釋藥研究結果顯示，冬凌草甲素在模擬胃腸液中的累積釋放度均出現不同程度的降低情況［10，15］，表明其穩定性存在問題； 制成類脂囊泡后，隨著時間延長其累積釋放度均呈現升高趨勢，故推測該劑型將原料藥包裹于內部時，可降低水相對其穩定性的影響，而且在不同條件下的藥物累積釋放度均明顯更高，從而增加了藥物溶出。前期報道，冬凌草甲素類脂囊泡在普通緩沖液中的釋藥情況與在模擬胃腸液中存在一定差別，這可能是由于后者中的胰蛋白酶脂解會對脂類囊泡結構產生影響［22］，加速了藥物釋放，可更好地反映體內實際情況［23］。

體內藥動學研究結果顯示，冬凌草甲素類脂囊泡tmax延后，可能是由于原料藥從類脂囊泡中釋放出去時需克服較大的阻力，從而表現出一定的緩釋作用；t1/2延長，除了與該制劑緩釋作用有關外［24］，可能還由于類脂囊泡增加了原料藥在胃腸道的穩定性［20］，降低了降解率，增加了后期進入血液循環的量；Cmax、相對生物利用度分別增加至3.58、5.38 倍，可能是由于類脂囊泡增加了原料藥溶解度、溶出度，降低了后者降解率，解決了其口服吸收的缺陷［17，20，23］。

綜上所述，本實驗制備了冬凌草甲素類脂囊泡，可為充分發揮該成分藥理活性奠定了基礎，今后將對其安全性、藥效等方面展開研究。