基于TLR4 /MyD88/NF-κB 通路探討茯磚茶改善ApoE-/- 小鼠非酒精性脂肪肝的作用

張文將，段麗芳，孟 濤，李 鑫，楊冬梨，劉圓月

（1.陜西中醫藥大學基礎醫學院，陜西 咸陽 712046； 2.益陽醫學高等專科學校，湖南 益陽 413000；3.湖南省白沙溪茶廠股份有限公司，湖南 安化 413500）

非酒精性脂肪肝 （nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD） 為慢性進行性肝臟疾病，我國NAFLD 患病率高達29.2%，已經逐漸超越病毒性肝炎，成為我國第一大肝病，該病可發展為肝硬化甚至肝癌，同時NAFLD 的長期存在增加了動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS） 和2 型糖尿病罹患風險，且中晚期很難逆轉，因此早期防治尤為關鍵［1-3］。“二次打擊” 學說無法解釋NAFLD 形成的復雜機制，“多重平行打擊” 學說認為慢性、持續性、低度非感染性炎癥反應為NAFLD 發展過程中的一個重要病理特征［4］。有研究證實長期高脂飲食可破壞腸黏膜屏障功能，大量內毒素隨門靜脈入血進入肝臟，激活肝實質細胞和肝庫普弗細胞上的Toll 樣受體4 （Toll-like receptor 4，TLR4） /髓樣分化因子88 （myeloid differentiation factor88，MyD88） /核因子Kappa B （nuclear factor-kappa B，NF-κB）通路，引起肝臟炎癥反應和胰島素抵抗的發生，促使脂質在肝臟的沉積，從而為NAFLD 的發生創造條件［5］。

NAFLD 防治尚無特效藥物，抗氧化劑的應用為防治NAFLD 提供新思路。茯磚茶屬于黑茶類，除了具有抗氧化作用的茶多糖及茶多酚外，在發酵過程中形成了冠突散囊菌屬等優勢益生菌，是醫學領域中具有應用潛力的微生物［6-7］。課題組前期實驗證實茯磚茶可通過抑制甘油三酯合成，減輕機體炎癥反應，抑制肥胖和AS 形成，降低肝重及肝指數，但是深入機制尚不明確［8］。因此，本研究通過高脂飲食連續喂養載脂蛋白E 敲除 （apolipoprotein E，ApoE-/-） 小鼠4 個月的方法復制NAFLD 模型，同時予以茯磚茶灌胃干預，檢測TLR4/MyD88/NF-κB 通路上的關鍵因子的基因表達變化，以期為NAFLD 的早期防治提供新的實驗依據。

1 材料

1.1 動物 50 只8 周齡SPF 級雄性ApoE-/-小鼠，體質量（20±5） g，品系名ApoE Cas9-KO，遺傳背景C57BL/6； 10只8 周齡C57BL/6J 雄性野生型小鼠，購于南京大學生物模式中心［實驗動物生產許可證號SCXK （蘇） 2015-0001］。小鼠飼養于SPF 實驗室，室內IVC 獨立送風隔離籠，儀器壓差20 Pa，相對濕度50% ～70%，溫度（24±0.5）℃，晝夜光照節律，每籠5 只，各組小鼠定量喂養，自由飲水（Ⅲ級水），每2 d 更換1 次墊料，籠具及水瓶定期消毒。ApoE-/-小鼠采用高脂輻照飼料（含21%脂肪、0.15%膽固醇，貨號H10141，北京華阜康生物科技股份有限公司） 喂養，飼料于-20 ℃下保存，取需用量于4 ℃冰箱中短期保存。

1.2 藥物 2014 年茯磚茶（湖南省白沙溪茶廠），經湖南中醫藥大學劉柏炎教授鑒定原料為茶葉一級嫩料壓筑而成，色澤黑褐，金花茂盛。阿托伐他汀（輝瑞制藥有限公司，批號110590）。

1.3 試劑 TRIzol 試劑 （美國Invitrogen 公司，批號50175111）； 熒光定量PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司，批號A152172A）； 反轉錄試劑盒 （美國 Thermo Fisher Scientific 公司，批號00692424）。引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成。

1.4 儀器 Z32HK 型高速冷凍離心機（德國Hermle 公司）； BX-51 型光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）； 核酸蛋白濃度測定儀（英國Bio-Drop 公司）； PCR 擴增儀（美國Bio-Rad 公司）； 熒光定量PCR 儀（德國Eppendorf 公司）。

2 方法

2.1 藥物制備 茯磚茶掰成分散片狀后用無菌紗布包裹投入無菌燒杯中，加入實驗用Ⅲ級水浸泡30 min （加水量沒過茶葉2～3 cm），武火煮開后文火煎煮30 min，藥液冷卻后過濾，取汁； 二次煎煮加水量以淹沒藥包為準，沸騰后冷卻，將2 次濾液合并，濃縮至所需體積，4 ℃冰箱保存備用，依據茶吸收實驗推薦成人每日攝入量為10 g （166.7 mg/kg），參照人與小鼠體表面積換算得小鼠所需劑量為1.44 g/kg［9］，設置茯磚茶高、中、低劑量分別為2.16、1.44、0.72 g/kg。阿托伐他汀使用前將藥片放入干凈研缽中碾碎，加入生理鹽水溶解，攪拌成混懸液，按10 mg/kg劑量進行灌胃，現配現用。

2.2 分組、造模與給藥 將50 只8 周齡雄性ApoE-/-小鼠適應性飼養1 周后隨機分為模型組（10 mL/kg 生理鹽水）、阿托伐他汀組（10 mg/kg） 和茯磚茶高、中、低劑量組（2.16、1.44、0.72 g/kg），每組10 只，定量予以高脂飼料喂養； 另設同周齡雄性C57BL/6J 小鼠10 只作為空白組，定量予以普通維持飼料喂養。各組小鼠于每天早上9 點予以相應的藥物連續灌胃干預17 周［10-11］。

2.3 標本收集與處理 各組小鼠給藥第17 周末禁食不禁水12 h，麻醉后摘眼球取血，全血室溫靜置2 h，4 ℃、3 000 r/min 離心15 min，取血清于-80 ℃冰箱中保存待測。頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟稱重，預冷生理鹽水漂洗，取各組小鼠相同部位肝葉（約1 cm×1 cm×1 cm） 于4%多聚甲醛中固定，用于HE 染色； 取約100 mg 肝組織于盛有1 mL 預冷TRIzol 的無RNA 酶凍存管中，液氮速凍后轉移至-80 ℃冰箱中保存，用于RT-qPCR 檢測。

2.4 HE 染色觀察肝組織病理形態 肝組織于4 ℃、4%多聚甲醛中固定48 h，經常規脫水、包埋、4 μm 切片、烤片、染色后封片，于顯微鏡下觀察。按照《NASH 臨床研究網病理工作指南》 對NAFLD 活動度積分 （NAFLD activity score，NAS） 進行半定量分析［12］，具體評判標準為①肝細胞脂肪變，0 分（＜5%），1 分（5% ～33%），2 分（34% ～66%），3 分（＞66%）； ②小葉內炎癥（20 倍鏡計數壞死灶），0 分（無），1 分（＞2 個），2 分（2 ～4 個），3 分（＞4 個）； ③肝細胞氣球樣變，0 分（無），1 分（少見），2 分（多見）。

2.5 RT-qPCR 法檢測肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FASmRNA 表達 TRIzol 法提取肝組織總RNA，采用核酸蛋白濃度測定儀測定RNA 濃度和質量，按試劑盒說明書將RNA 逆轉錄為cDNA，反應程序為42 ℃，60 min；70 ℃，5 min； 4 ℃維持。隨后進行PCR 擴增反應，反應程序為95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，循環40 次。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因mRNA 相對表達，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.6 統計學分析 通過SPSS 18.0 軟件進行處理，實驗數據以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 茯磚茶對小鼠肝組織病理形態的影響

3.1.1 肉眼觀察 如圖1 所示，空白組小鼠肝臟大小適中，暗紅色，邊緣銳利； 模型組小鼠肝臟體積增大，黃色油膩感，邊緣較鈍； 茯磚茶高劑量組小鼠肝臟稍大，暗紅為主，色稍黃，邊緣稍鈍； 茯磚茶中劑量組小鼠肝臟體積適中，顏色暗紅，邊緣銳利； 茯磚茶低劑量組小鼠肝臟體積增大，顏色黃色油膩感，邊緣變鈍； 阿托伐他汀組小鼠肝臟體積變大，黃色油膩感，邊緣鈍。

圖1 各組小鼠肝臟肉眼觀察

3.1.2 HE 染色鏡觀察 如圖2 所示，空白組低倍鏡下肝小葉輪廓清晰，中央靜脈居中，肝索放射狀分布，肝血竇清晰； 高倍鏡下肝細胞大小均勻，細胞核居中，胞質均質紅染。模型組低倍鏡下肝小葉輪廓模糊，肝索非放射狀排列，肝血竇不清； 高倍鏡下肝細胞體積變大，大小不一，界限不清，胞漿疏松化，有大量的空泡形成。茯磚茶高劑量組低倍鏡下肝小葉結構完整，中央靜脈居中，部分細胞核偏位，胞漿淡染疏松化； 高倍鏡下肝細胞大小較均勻，細胞核居中，胞漿淡染，部分胞漿有少量空泡形成。茯磚茶中劑量組低倍鏡下肝小葉結構完整，中央靜脈居中，肝索呈放射狀，肝血竇較為清晰； 高倍鏡下細胞核居中、胞漿淡染疏松化，有部分體積較小空泡形成。茯磚茶低劑量組低倍鏡下肝小葉輪廓及肝血竇欠清晰； 高倍鏡下可見大量的空泡變性。阿托伐他汀組低倍鏡下肝小葉輪廓及肝血竇紋理欠清晰； 高倍鏡下可見胞漿淡染疏松化、細胞核偏位，存在大小不等的空泡形成。

圖2 各組小鼠肝組織HE 染色

3.1.3 NAS 評分 與空白組比較，模型組小鼠肝臟NAS 評分升高（P＜0.05）； 與模型組比較，阿托伐他汀組和茯磚茶各劑量組小鼠肝臟NAS 評分降低（P＜0.05）； 與阿托伐他汀組比較，茯磚茶各劑量組小鼠肝臟NAS 評分降低（P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠肝臟NAS 評分比較（±s，n＝10）

表2 各組小鼠肝臟NAS 評分比較（±s，n＝10）

注： 與空白組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與阿托伐他汀組比較，△P＜0.05。

組別NAS 評分/分空白組0.00±0.00模型組6.72±0.49*阿托伐他汀組4.43±0.52＃茯磚茶高劑量組3.24±0.42＃△茯磚茶中劑量組2.92±0.57＃△茯磚茶低劑量組3.82±0.42＃△

3.2 茯磚茶對TLR4/MyD88/NF-κB 通路相關因子mRNA 表達的影響 與空白組比較，模型組小鼠肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FASmRNA 表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，阿托伐他汀組和茯磚茶各劑量組小鼠肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FASmRNA 表達降低（P＜0.05）； 與阿托伐他汀組比較，茯磚茶高、中劑量組小鼠肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、FASmRNA 表達降低（P＜0.05），茯磚茶高劑量組小鼠肝組織IL-1βmRNA 表達降低（P＜0.05），見表3。

表3 各組小鼠肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FAS mRNA 表達比較（±s，n＝10）

表3 各組小鼠肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FAS mRNA 表達比較（±s，n＝10）

注： 與空白組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與阿托伐他汀組比較，△P＜0.05。

組別TLR4MyD88NF-κBIL-1βFAS空白組1.00±0.071.09±0.071.12±0.181.06±0.121.01±0.13模型組5.64±0.80*2.05±0.16*2.00±0.27*3.04±0.84*3.74±0.49*阿托伐他汀組3.55±0.45＃1.58±0.26＃1.60±0.20＃1.37±0.38＃2.32±0.44＃茯磚茶高劑量組1.96±0.54＃△1.35±0.12＃△1.34±0.28＃△1.14±0.17＃△1.42±0.20＃△茯磚茶中劑量組1.82±0.41＃△1.32±0.10＃△1.27±0.30＃△1.44±0.27＃1.21±0.19＃△茯磚茶低劑量組2.96±0.36＃△1.70±0.08＃1.58±0.34＃1.73±0.28＃△2.26±0.65＃

4 討論

近年來提出的“腸-肝軸” 理論認為，腸道菌群失調在NAFLD 的形成中發揮著重要作用［13］。研究顯示，NAFLD患者比正常人群更容易出現小腸細菌過度生長，導致富有脂多糖 （Lipopolysaccharide，LPS） 成分的細菌含量升高［14］。腸道內毒素通過門脈系統到達肝臟，被肝臟實質細胞中的TLR4或者Kupffer 細胞所識別［15-16］。LPS 激活TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路后促使大量炎癥因子的釋放，造成肝細胞的損傷［17］。通過阻斷TLR4通路來抑制炎癥反應，已經成為了干預肝臟疾病的有效途徑之一［18］。

課題組前期實驗證實，茯磚茶預防性灌胃給藥可減輕NAFLD 小鼠肝臟氧化損傷［19］，降低血清IL-1β、腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 等炎癥因子表達［8］，由此證實NAFLD 模型小鼠確實存在慢性非感染性炎癥現象，而茯磚茶灌胃給藥可以起到抑制炎癥反應的效果，但其抗炎機制尚不明確。本研究結果顯示，茯磚茶各劑量組和阿托伐他汀組預防性灌胃給藥均可抑制小鼠肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FASmRNA 表達，其中茯磚茶高、中劑量組抑制效果優于低劑量組和阿托伐他汀組，由此可見適當濃度茯磚茶預防性灌胃給藥發揮著較好預防NAFLD 形成效果。阿托伐他汀為臨床抑制膽固醇合成常用降脂藥物，在本實驗中雖可抑制NAFLD 形成，但其效果不如茯磚茶高、中劑量組，考慮可能是研究過程中阿托伐他汀所用劑量并非治療最佳劑量所致。FAS 為催化乙酰輔酶A 和丙二酸單酰輔酶A 合成脂肪酸的關鍵限速酶，其表達量的增加會導致甘油三酯在體內的蓄積，由此可見FAS 系統在NAFLD 的發生與發展中起到關鍵作用［20］。本實驗結果顯示肝臟FAS基因表達和肝臟脂肪變性程度呈正相關，由此可見茯磚茶預防性灌胃給藥可抑制肝臟脂類物質的合成，從而達到了延緩肝脂變的效果。

茯磚茶作為一種后發酵茶，有報道顯示茯磚茶水提物可明顯恢復高脂飲食小鼠引起的厚壁菌門/擬桿菌門比值的升高，提高雙歧桿菌科細菌的相對豐度［21］。茯磚茶中的冠突散囊菌增加了小鼠腸道中產生乙酸和丁酸的細菌，可以部分逆轉高脂飲食小鼠腸道菌群失調［22］。由此可見對腸道菌群失衡的調節可能是茯磚茶發揮作用的重要因素，但茯磚茶是否通過調節腸道菌群而抑制肝臟TLR4/MyD88/NF-κB 通路激活尚不明確，后續將完善通路關鍵因子蛋白表達實驗，并配合細胞實驗對該通路進一步驗證。