中藥通過調節鐵死亡作用治療潰瘍性結腸炎的用藥規律研究

吳 娜，饒 穎，周佳林，李 重，黃雪云，謝昌營，賀柯慶*

（1.江西中醫藥大學附屬醫院，江西 南昌 330006； 2.江西省中西醫結合醫院，江西 南昌 330006）

潰瘍性結腸炎是一種病因尚不明確的結腸和直腸慢性非特異性炎癥性疾病，臨床常表現為腹痛、腹瀉、黏液膿血便，具有病程長、易復發、難治愈等特點，現已被世界衛生組織列為現代社會最難治療的疾病之一，目前其發病率在我國呈持續上升趨勢［1-2］。正常的腸上皮細胞（IECs）死亡可維持其功能，保持其持續更新能力，維護組織穩態，而其脫離穩態后會導致腸通透性增加、腸屏障功能障礙，是導致潰瘍性結腸炎發生發展的關鍵因素［3］。鐵死亡是近年提出的一種新型細胞程序性死亡方式，主要依賴于細胞內鐵和脂質活性氧積累所引起的細胞死亡，目前被認為是導致IECs 死亡的重要原因［4］。近期多項研究表明，鐵死亡參與潰瘍性結腸炎的發生發展。

中藥治療潰瘍性結腸炎由來已久，療效確切，副作用較少，但其具體作用機制尚不明確。近年來，生物信息學在疾病診斷、靶向新藥研發等臨床研究中廣泛運用，本研究通過生物信息學尋找出治療潰瘍性結腸炎的中藥中作用機制與鐵死亡相關的中藥，再采用數據挖掘技術分析其配伍規律、核心藥物組合，以期為相關中醫治療及機制探索提供參考。

1 資料與方法

1.1 潰瘍性結腸炎中與鐵死亡相關基因檢索 FerrDb（http： / /www.zhounan.org/ferrdb/index.html） 是從PubMed數據庫中下載關于鐵死亡的文章，從中提取出與鐵死亡調控因子、標志物及相關疾病的數據庫，于2021 年12 月下載鐵死亡的標志物（marker）、抑制因子（suppressor）、驅動因子（driver） 3 個文件，并將相關數據進行合并，刪除重復項，最終獲得相關基因（數據集1）。DisGeNET （v 7.0）［5］（http： / /www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu）包含了17 074 個基因、20 370 種疾病、561 119 個基因-疾病相關，從中獲得與潰瘍性結腸炎相關的疾病基因（數據集2）。將上述2 個數據集輸入Uniprot 數據庫（https： / /www.uniprot.org/） 進行標準化后映射，最終得到共有基因，即為潰瘍性結腸炎中與鐵死亡發生機制相關的基因。

1.2 潰瘍性結腸炎中與鐵死亡相關關鍵基因獲取 將鐵死亡基因輸入STRING （the Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes） 數據庫（v 11.5）（http： / /string-db.org/）［6］進行蛋白-蛋白相互作用（PPI） 分析，選取得分大于0.4 的基因輸入Cytoscape 3.7.1 軟件［7］，應用network analysis plugin 功能對網絡中基因進行統計分析，得到其在網絡中的作用——自由度（Degree），根據其大小進行可視化，顏色由淺黃色逐漸變成紅色，紅色越深，Degree 越大，該基因在網絡中的生物功能越多，選取排名前十的基因，即為潰瘍性結腸炎鐵死亡基因中的關鍵基因。

1.3 調節鐵死亡作用潰瘍性結腸炎中藥獲取 Coremine Medical 是挪威與中國科學院、中國醫學科學院、美國國立醫學圖書館等機構聯合開發的醫學信息檢索平臺，通過輸入基因名可檢索出與該基因相關的疾病及潛在治療藥物。將潰瘍性結腸炎鐵死亡關鍵基因輸入該數據庫，以P＜0.05為標準進行篩選［8］，得到作用于每個關鍵基因的中藥，對其出現頻次進行統計，得到排名最高的前3 味中藥。

1.4 中藥數據挖掘 查閱相關文獻，從“1.3” 項下出現頻次前三的中藥中篩選合適的1 味進行后續數據挖掘，分析以其為核心治療潰瘍性結腸炎的用藥配伍規律。

1.4.1 數據來源 在中國知網（CNKI） 數據庫中以“潰瘍性結腸炎” 及“1.4” 項下中藥為關鍵詞進行檢索，時間為建庫至2021 年12 月。

1.4.2 納入標準 （1） 文獻為已公開發表、可瀏覽內容的隨機對照試驗，單盲、雙盲或非盲法不限，語種中文；（2） 給藥途徑為口服，試驗組干預措施為單純中藥、中成藥或中藥/中成藥聯合西藥治療，對照組干預措施為西醫治療（包括水楊酸制劑、激素、免疫抑制劑等）。

1.4.3 排除標準 （1） 使用重復中藥復方的文獻； （2）給藥途徑包括中藥灌腸； （3） 無具體中藥組成的文獻；（4） 僅使用單味中藥治療的文獻； （5） 學術經驗體會類、綜述類、實驗類文獻。

1.4.4 數據處理 經檢索后共得到3 905 篇相關文獻，按“1.4.2” “1.4.3” 項下標準篩選后得到363 個符合條件的方劑，根據2015 年版《中國藥典》［9］和《中藥學》［10］將中藥名稱、分類進行統一，例如“川白芍” “白芍藥” 均統一為“白芍”，“廣木香” “云木香” 統一為“木香”，“橘皮” 統一為“陳皮”，“炙甘草” 統一為“甘草”。

1.4.5 數據分析 采用Excel 2019 軟件對方劑中單味中藥出現頻次、類型、性味歸經等進行統計； IBM SPSS Modeler 18.0 軟件分析組方中藥，以出現頻次≥40 次者為高頻中藥； Cytoscape 3.7.1 軟件繪制高頻中藥網絡圖； Apriori 算法進行關聯規則分析，其中滿足支持度≥30%、置信度≥100%、提升度≥1 的藥對為核心中藥； IBM SPSS Statistics 26.0 軟件對高頻中藥進行聚類分析。

2 結果

2.1 潰瘍性結腸炎中與鐵死亡發生機制相關的基因 在FerrDb 數據庫中共得到259 個與鐵死亡發生機制相關的基因（數據集1），在DisGeNET 數據庫中得到1 458 個與潰瘍性結腸炎發生相關的基因（數據集2），將上述2 個數據集標準化后映射得到76 個共有基因，即為潰瘍性結腸炎鐵死亡基因，見圖1。

圖1 潰瘍性結腸炎中與鐵死亡發生機制相關的基因韋恩圖

2.2 潰瘍性結腸炎鐵死亡關鍵基因分析 將76 個潰瘍性結腸炎鐵死亡基因輸入STRING 數據庫篩選，通過Cytoscape 軟件可視化，根據Degree 大小進行顏色渲染，得到10 個關鍵基因，分別為腫瘤蛋白P53 （TP53）、白細胞介素-6 （IL6）、低氧誘導因子-1A （HIF1A）、信號轉導和轉錄激活因子3 （STAT3）、白蛋白（ALB）、表皮生長因子受體（EGFR）、血管內皮生長因子A （VEGFA）、肉瘤基因（SRC）、V-Ha-Ras 肉瘤病毒癌基因同源物（HRAS）、TOLL樣受體4 （TLR4），具體見表1、圖2。

表1 潰瘍性結腸炎中與鐵死亡相關的關鍵基因

圖2 潰瘍性結腸炎中與鐵死亡發生機制相關的基因

2.3 調節鐵死亡作用潰瘍性結腸炎的中藥 將“2.2” 項下關鍵基因輸入Coremine Medical 數據庫進行檢索，發現出現頻次最高的前3 味中藥是丹參、人參、黃芩、黃芪，其中黃芩、黃芪出現頻次相同，故一起納入，具體見表2?，F代研究發現，黃芩主要成分黃芩素可直接螯合人體內鐵離子，減少鐵離子沉積，抑制芬頓反應，具有顯著的抗鐵死亡活性，對其抑制作用優于傳統抑制劑Ferrostatin-1，并且潰瘍性結腸炎病機以濕熱、瘀熱蘊結腸道為主，故選擇該中藥進行后續數據挖掘。

表2 調節鐵死亡作用潰瘍性結腸炎的中藥

2.4 含黃芩方劑統計 共得到含黃芩方劑363 首，包含209 味中藥，①功效，包括清熱類（1 128 次，29.20%）、補虛類（1 040 次，26.92%）、理氣類（356 次，9.22%）、解表類（243 次，6.29%）、止血類（242 次，6.26%）、利水滲濕類（191 次，4.94%）、溫理類（125 次，3.24%）、收澀類（93 次，2.41%）、化濕類（86 次，2.22%）、驅蟲類（78 次，2.02%）、化痰止咳平喘類（77 次，1.99%）、消食類（64 次，1.66%）、活血化瘀類（64 次，1.66%）、瀉下類（56 次，1.45%）、祛風濕類（8 次，0.21%）、平肝息風類（5 次，0.13%）、安神類（4 次，0.10%）、開竅類（3 次，0.08%）； ②四氣，包括寒（1 381 次，39.46%）、溫（1 193 次，34.09%）、平 （621 次，17.74%）、涼（169 次，4.83%）、熱（136 次，3.89%），具體見圖3A；③五味，包括苦 （2 495 次，41.72%）、甘 （1 447 次，24.19%）、辛 （ 1 138 次，19.03%）、酸 （ 878 次，14.68%）、咸（23 次，0.38%），具體見圖3B； ④歸經，包括脾 （2 825 次，22.00%）、胃 （2 020 次，15.73%）、肺（1 567 次，12.20%）、肝（1 562 次，12.16%）、大腸（1 520 次，11.84%）、心（1 143 次，8.90%）、膽 （984次，7.66%）、小腸 （396 次，3.08%）、腎 （395 次，3.08%）、三焦 （ 218 次，2.19%）、膀胱 （ 156 次，1.21%）、心包（55 次，0.43%），具體見圖3C。

圖3 含黃芩方劑中藥雷達圖

2.5 核心中藥組分析 采用Apriori 算法進行關聯規則分析，發現核心藥對共16 對，其中黃芩與黃連、甘草、白芍、木香出現頻次最多，為核心中藥組，具體見表3。

表3 核心中藥組

2.6 聚類分析 采用IBM SPSS Modeler 18.0 軟件進行聚類分析，共篩選出29 味使用頻次≥40 次的中藥，即為高頻中藥，Cytoscape 軟件繪制其網絡圖，具體見圖4。再采用IBM SPSS Statistics 26.0 軟件中的“組間聯接”，測量區間選擇“皮爾遜相關性”，設置區類間距離為21，可將高頻中藥藥物聚為6 類，第1 類為半夏、干姜、大棗、黨參；第2 類為黃芩； 第3 類中組1 為陳皮、防風、白術、茯苓、黃芪，組2 為柴胡、枳殼、甘草、地榆； 第4 類為大黃、肉桂、檳榔、當歸、白芍、木香； 第5 類為薏苡仁、敗醬草、黃連、葛根； 第6 類為白頭翁、秦皮、黃柏、白及、赤芍，具體見圖5。

圖4 高頻中藥網絡圖

圖5 高頻中藥聚類分析

3 討論與結論

2012 年，Dixon、Stockwell 等［11］發現，小分子化合物愛拉斯汀可通過抑制胱氨酸/谷氨酸逆轉運體減少半胱氨酸依賴的谷胱甘肽合成，從而導致一種不同于細胞凋亡、壞死、自噬、焦亡等的新型細胞死亡模式，并將其命名為“鐵死亡”，目前它正參與腫瘤、神經退行性疾病、缺血再灌注損傷、潰瘍性結腸炎等疾病的發生發展［12-15］。中藥治療潰瘍性結腸炎由來已久，療效確切，現已發現多種中藥成分可調控鐵死亡，并且與經典相關干預劑相比具有價格低廉、來源廣、療效可靠等優勢［16］，故挖掘該類中藥并研究其用藥規律對相關診療具有重大意義。

通過生信預測發現，丹參、人參、黃芩、黃芪治療潰瘍性結腸炎的作用機制可能與鐵死亡相關，近年來研究表明含上述4 味中藥的方劑對潰瘍性結腸炎有治療作用，與本研究預測結果相符。中醫認為，潰瘍性結腸炎發病與“濕熱” “熱毒” 相關，其病機主要為濕熱蘊結腸道［17-18］。黃芩入心、肺、膽、大腸經，有清熱祛濕、瀉火解毒功效，常用于治療濕熱瀉痢、諸熱腸澼等病，其符合該病證的治法要求，現代藥理研究證實，其主要成分黃芩素可直接螯合人體內鐵離子，減少鐵離子沉積，抑制芬頓反應，具有顯著的抗鐵死亡活性，并且對其抑制作用優于傳統抑制劑Ferrostatin-1［19-20］，故選用該中藥進行后續研究。通過數據挖掘得到含黃芩方劑共363 首，涉及209 味中藥，發現以清熱、補虛、理氣類為主，并且黃芩與黃連、甘草、白芍、木香為核心中藥組。黃芩配伍清熱類中藥黃連時，前者善清上焦火，后者善清中焦火，兩者性味相投，功效相似，相須為用，可增強清熱解毒燥濕之功，有助清胃腸之濕熱；配伍補虛類中藥白芍、甘草時，白芍斂陰和營、緩急止痛，芩芍相配，酸苦相濟，調中存陰，而甘草益氣和中、調補正氣，與黃芩一瀉一補、相互制約，可減弱前者瀉下之力，使其瀉熱而存陰、祛邪不傷正； 與理氣類中藥木香配伍時，可得后者行而不滯，而后者得前者溫而不燥，寒熱并有，相反相成，共奏清熱燥濕、行氣止痛之功效。另外，黃芩、白芍、甘草也是治療里熱下痢之祖方黃芩湯的重要組方藥材，而且課題組前期發現，黃芩湯作用潰瘍性結腸炎的機制可能與鐵死亡相關［21］，與本研究結論相符。

綜上所述，本研究以鐵死亡為切入點，通過生物信息學、數據挖掘方法分析中藥通過調節鐵死亡作用治療潰瘍性結腸炎的用藥規律，發現丹參、人參、黃芩、黃芪4 味中藥治療作用可能與鐵死亡相關，從病機、藥理方面考慮選擇黃芩進行考察，發現它治療本病時常與清熱、補虛、理氣類中藥配伍，其中黃芩、黃連、甘草、白芍、木香為核心中藥組。上述結果可為潰瘍性結腸炎中醫治療及其作用機制探索提供參考。