基于PARMS技術(shù)的稻瘟病抗性基因分子標(biāo)記研究及其在江蘇太湖稻區(qū)的應(yīng)用

宋云生，曹鵬輝，于雅潔，喬中英，朱勇良，謝裕林，袁彩勇，董明輝

（江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 蘇州 215000）

0 引言

水稻(Oryza sativaL.)是全球最為重要的糧食作物之一，尤其在我國其產(chǎn)量和穩(wěn)定性對國家糧食安全和經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定具有至關(guān)重要的作用［1］。然而，水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)往往受到各種病害的嚴(yán)重威脅，其中稻瘟病(Magnaporthe oryzae)對水稻的影響尤為顯著［2］。近年來，江蘇太湖稻區(qū)的稻瘟病發(fā)生頻率和嚴(yán)重程度均有上升的趨勢［3］，給當(dāng)?shù)厮旧a(chǎn)帶來了重大壓力，而抗病品種的利用是抵抗稻瘟病災(zāi)害風(fēng)險最直接、最有效的方法，因此，對稻瘟病抗病育種的研究成為太湖稻區(qū)水稻研究的重要內(nèi)容。

在稻瘟病的防治中，利用抗性基因?qū)λ酒贩N進(jìn)行篩選和改良是一種有效的策略［4］。隨著基因工程和生物技術(shù)的快速發(fā)展，已經(jīng)成功克隆并研究了一系列抗稻瘟病基因［5］，如Pi1、Pi2、Pi9、Pia、Pib、Pik和Pita等。然而，由于不同水稻品種中抗性基因的分布、頻率和效果存在較大差異［6］，如何準(zhǔn)確、高效地在育種材料中識別和利用抗性基因，已經(jīng)成為當(dāng)前學(xué)者們的重要研究方向之一。相比于傳統(tǒng)的育種方法，分子標(biāo)記輔助育種［7］(Marker-Assisted Selection， MAS)有助于提高育種的效率和精確性，利用抗性基因的分子標(biāo)記，可以在育種過程中對目標(biāo)基因進(jìn)行追蹤和篩選，從而實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的育種進(jìn)程。以往多項研究［8-9］已開發(fā)了一系列的分子標(biāo)記，如SSR、AFLP、CAPS、SNP等分子標(biāo)記在抗性基因的定位、鑒定和輔助選擇育種等方面取得了顯著的成果。作為一種獨(dú)特的SNPPCR分析技術(shù)，PARMS (Penta-Primer Amplification Refractory Mutation System，五引物擴(kuò)增受阻突變體系）結(jié)合了1對通用熒光引物、1對SNP等位基因特異引物以及1條反向共用引物進(jìn)行檢測［10］，該技術(shù)無須對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行耗時的DNA電泳分析，簡化了操作過程，同時保持了較高的標(biāo)記精確性，使得在大規(guī)模的育種項目中快速、準(zhǔn)確地篩選和鑒定抗性基因成為可能。卿冬進(jìn)等［11］采用PARMS技術(shù)成功開發(fā)了水稻Pigm基因的分子標(biāo)記，通過對48份水稻親本進(jìn)行基因型鑒定，并結(jié)合田間抗性表型驗證，證實(shí)了該技術(shù)的可靠性。伍豪等［12］研究表明，利用PARMS技術(shù)開發(fā)的分子標(biāo)記可有效地運(yùn)用于水稻抗病性分子標(biāo)記輔助育種。然而，以往研究大多集中于單個抗性基因的分子標(biāo)記開發(fā)和應(yīng)用，對于多個抗性基因共同作用的研究相對較少，而且抗性基因的效果容易受到遺傳背景和自然環(huán)境的影響［13］。因此，利用抗性基因進(jìn)行水稻抗病性育種仍需要進(jìn)一步研究和探索。

江蘇太湖稻區(qū)水稻種植歷史悠久，品種變異類型多樣、抗性基因資源豐富［14］，開發(fā)和利用分子標(biāo)記對于提升該地區(qū)水稻的抗性育種水平具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究以課題組多年篩選培育的水稻高代材料為主體，針對江蘇太湖稻區(qū)的稻瘟病種類和病原菌特性［15］，基于PARMS技術(shù)對Pi2、Pib、Pita和Pik等4個基因的快速準(zhǔn)確檢測進(jìn)行深入研究，分析以上抗性基因在供試水稻材料中的分布特征，并根據(jù)田間抗病性表現(xiàn)探討其與抗性基因之間的關(guān)系，旨在為該地區(qū)抗稻瘟病水稻品種選育提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻材料為江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所篩選培育的高代穩(wěn)定材料206份。供試菌株為2021年江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供的代表性稻瘟病菌株（2021-3、2021-43、2021-71、2021-150和2021-497）。由4個抗性基因分子標(biāo)記開發(fā)的感病和抗病品種對照分別為嘉58和淮稻5號(Pi2)、南粳46和淮稻5號(Pib)、武運(yùn)粳24和南粳46(Pita)、武運(yùn)粳24和南粳46(Pik)。

1.2 供試水稻材料穗頸瘟抗性鑒定

穗頸瘟田間自然鑒定在江蘇省常州市金壇試驗基地進(jìn)行。供試水稻材料和誘發(fā)品種（蘇御糯、麗江黑谷）采用交錯播種方式，在水稻分蘗階段將稻瘟病菌樣撒布在田間，于成熟期觀察并記錄穗頸瘟的發(fā)病情況，群體抗性分級標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。水稻全生育期內(nèi)不防治病害，蟲害防治和水肥管理參照大田常規(guī)生產(chǎn)。

表1 水稻穗頸瘟發(fā)病群體抗性分級標(biāo)準(zhǔn)

1.3 水稻葉片DNA提取與PCR擴(kuò)增

2021年8月對206份水稻材料葉片進(jìn)行取樣。取長、寬約1 cm的葉片置入深孔板中（96孔1.2 mL)，注入100 μL 0.3 mol/L的氫氧化鈉，進(jìn)行50 Hz磨樣1 min，研磨完成后以3000 r/min離心1 min，隨后在沸水浴中處理1 min，加入400 μL 0.2 mol/L Tris-HCl混勻，再次進(jìn)行沸水浴1 min，水浴完成后以3000 r/min離心1 min，取上清液稀釋10~30倍，用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。參考卿冬進(jìn)等［11］的研究方法對所選206份水稻材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過PARMS引物設(shè)計網(wǎng)站(http://www.snpway.com)設(shè)計等位基因特異引物和反向共用引物，詳細(xì)的標(biāo)記引物序列見表2，由武漢景肽生物科技有限公司負(fù)責(zé)合成引物。

表2 分子標(biāo)記引物序列及熒光信號類型

1.4 等位基因型分型鑒定

PCR擴(kuò)增完成之后，采用酶標(biāo)儀(TECAN infinite M1000)讀取擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號強(qiáng)度，使用snpdecoder 在線軟件(www.snpway.com/snpdecoder)將熒光信號進(jìn)行解析并轉(zhuǎn)換，以獲取清晰且直觀的基因分型圖。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和圖表繪制。采用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件對水稻材料攜帶的抗性基因與其田間穗頸瘟抗性級別進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記開發(fā)

利用稻瘟病抗性品種基因序列與感病品種等位基因的序列差異，設(shè)計針對水稻抗稻瘟病基因Pi2、Pib、Pita和Pik的4組共顯性SNP分子標(biāo)記，相應(yīng)的分子標(biāo)記名稱分別為SYS-Pi2、SYS-Pib、SYS-Pita和SYS-Pik，其引物序列及熒光信號類型見表2。對每個基因都設(shè)計了1對通用熒光引物、1對SNP等位基因特異引物以及1條反向共用引物，以確保擴(kuò)增出目標(biāo)基因的SNP位點(diǎn)。

其中，2條攜帶不同熒光信號的等位基因特異引物，將分別與PARMS master mix中帶FAM和HEX的熒光信號相互匹配。根據(jù)引物序列對比分析可知，預(yù)測PCR擴(kuò)增后，以上引物能夠有效地擴(kuò)增目標(biāo)基因的SNP位點(diǎn)，并通過檢測2種熒光信號將抗病品種與感病品種的基因型區(qū)分開，以實(shí)現(xiàn)這4組分子標(biāo)記的特異性。

2.2 基因型檢測

利用開發(fā)設(shè)計的4組熒光分子標(biāo)記檢測206份水稻材料的基因型，于PCR擴(kuò)增后經(jīng)熒光掃描、數(shù)據(jù)分析，得到FAM和HEX熒光信號的散點(diǎn)圖（圖1）。在供試水稻材料中，4組分子標(biāo)記均能有效識別區(qū)分相應(yīng)的SNP差異，表明分子標(biāo)記開發(fā)成功。

圖1 分子標(biāo)記對206份水稻材料的基因分型檢測結(jié)果

根據(jù)圖1結(jié)果，匯總稻瘟病抗性基因在供試材料中的分布如圖2所示。結(jié)合引物設(shè)計原理分析，發(fā)現(xiàn)在206份水稻材料中Pib抗性基因的檢出率最高，達(dá)到了98.06%（202/206）；其次為Pita和Pik基因，檢出率分別為85.44%（176/206）和40.29%（83/206）；Pi2基因的檢出率則較低，為26.70%（55/206）；而未檢出以上抗性基因的材料僅1份。以上結(jié)果表明，多年的育種選擇在很大程度上提高了抗性基因存在的比例，其中Pib、Pita和Pik抗性基因在樣本中具有較為廣泛的分布，而Pi2基因的低檢出率也提示了其在水稻材料中的稀缺性，這可能與水稻材料的遺傳背景和種質(zhì)資源有關(guān)。

進(jìn)一步分析顯示，在所有研究材料存在的基因組合中，同時存在4個抗性基因(Pi2+Pib+Pita+Pik)和3個抗性基因(Pi2+Pita+Pik)的材料數(shù)量較少，均僅有11份，占比均為5.34%（11/206）。而存在2個抗性基因和3個抗性基因的組合分別以(Pib+Pita)和(Pib+Pita+Pik)的材料較多，占比分別為84.47%（174/206）和34.47%（71/206）。這種情況反映出在太湖稻區(qū)，水稻更傾向于利用Pib、Pita和Pik基因提供對穗頸瘟的抗性，而較少依賴Pi2基因。

2.3 田間誘發(fā)抗病性鑒定

206份水稻材料田間誘發(fā)穗頸瘟發(fā)病情況統(tǒng)計結(jié)果顯示（表3），穗頸瘟達(dá)到1級的有48份，表現(xiàn)為抗；3級的有90份，表現(xiàn)為中抗；5級的有47份，表現(xiàn)為中感；7級的有21份，表現(xiàn)為感；0級高抗和9級高感的材料均未發(fā)現(xiàn)。結(jié)合4個抗性基因存在情況發(fā)現(xiàn)，具有單一Pib基因的水稻材料在抗穗頸瘟上表現(xiàn)優(yōu)異，中抗級別以上材料有4份，而Pi2、Pita和Pik基因則相對較弱，這突顯了Pib基因在防控稻瘟病中的重要性。在復(fù)合基因型中，當(dāng)同時存在2個基因“Pib+Pita”時，水稻材料對穗頸瘟的抗性表現(xiàn)出更強(qiáng)的穩(wěn)健性，中抗級別以上材料有48份，反映出這2個基因在防治稻瘟病上的潛在協(xié)同作用。此外，三基因型“Pi2+Pita+Pik”的抗性級別偏向于較強(qiáng)，中抗以上材料達(dá)到47份，尤其是當(dāng)4個抗性基因Pi2、Pib、Pita和Pik共存時，雖然樣本量僅有11份，但其抗性表現(xiàn)較好，特別是在1級的抗性級別中占比最高，揭示了多抗性基因共存對稻瘟病的抵抗力顯著增強(qiáng)。

表3 不同抗性基因組合的田間抗病性鑒定結(jié)果

相關(guān)性分析表明，Pib基因的存在與穗頸瘟的抗性呈極顯著相關(guān)（r=0.204**，P＜0.01），表明帶有Pib基因的水稻材料在抗穗頸瘟病方面可能有更好的表現(xiàn)。Pik基因與穗頸瘟抗性的相關(guān)性也達(dá)顯著水平(r=0.149*，P＜0.05），而Pi2和Pita基因與穗頸瘟抗性的相關(guān)性均不顯著(r=0.086和r=0.135，P＞0.05），這表明Pib和Pik基因可能對稻瘟病的抗性產(chǎn)生更大的影響。

3 討論與結(jié)論

水稻抗稻瘟病的種質(zhì)創(chuàng)新和優(yōu)良品種的選育是稻瘟病防治的最有效、最經(jīng)濟(jì)的手段［16］，其優(yōu)勢主要體現(xiàn)在減少了對化學(xué)藥劑的依賴，不僅降低了對生態(tài)環(huán)境的破壞，還有效地減輕了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者的成本負(fù)擔(dān)。分子標(biāo)記技術(shù)在抗病品種的選育過程中起到了重要的推動作用，可以迅速、高效地從大量水稻品種中篩選出攜帶抗性基因的優(yōu)良品種［17-18］。本研究基于PARMS技術(shù)開發(fā)了針對抗稻瘟病基因的分子標(biāo)記，并對江蘇太湖稻區(qū)206份水稻育種高代穩(wěn)定材料的基因型進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定，為了解抗稻瘟病基因的分布和作用，以及抗性基因與田間抗病性的關(guān)聯(lián)，提供了高效的技術(shù)工具。通過應(yīng)用分子標(biāo)記對基因型的鑒定結(jié)果，有針對性地對水稻育種材料進(jìn)行稻瘟病抗性篩選改良，可提高稻瘟病抗性選育效率。

水稻品種的抗病水平與其抗性基因種類密切相關(guān)［19］，不同種植區(qū)域水稻中蘊(yùn)含的稻瘟病抗性基因有所不同［20］，深入了解抗性基因的分布情況是稻瘟病抗性品種選育的基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示，Pib、Pita和Pik抗性基因在太湖稻區(qū)供試水稻材料中分布廣泛，同時存在2個抗性基因(Pib+Pita)和3個抗性基因(Pib+Pita+Pik)的樣本較多，而Pi2基因的檢出率則較低。王小秋等［21］研究發(fā)現(xiàn)，在江蘇粳稻品種中Pib和Pita基因的比例超過了50%，說明以上2個基因在稻瘟病抗性育種中應(yīng)用廣泛。范方軍等［22］通過對近年來審定的江蘇水稻品種進(jìn)行稻瘟病抗性基因檢測，發(fā)現(xiàn)大部分品種都包含Pib、Pita、Pik基因，多數(shù)材料聚合了多個基因，與本研究結(jié)果較為一致。本研究對基因型與田間自然誘發(fā)抗病性表現(xiàn)的關(guān)系進(jìn)行了深入分析，探討了基因間的協(xié)同作用。供試材料中具有單一Pib基因的水稻材料在抗穗頸瘟上表現(xiàn)優(yōu)異，當(dāng)Pib和Pita同時存在時，對稻瘟病的抗性顯著增強(qiáng)，特別是4個抗性基因Pi2、Pib、Pita和Pik共存時，材料中達(dá)到1級抗性級別的占比最高，這與王軍等［23-25］的研究結(jié)果一致，均強(qiáng)調(diào)了復(fù)合抗性基因在病害抗性增強(qiáng)中的關(guān)鍵作用。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)Pib和Pik基因與穗頸瘟的抗性呈（極）顯著正相關(guān)，表明Pib和Pik基因可能會對稻瘟病的抗性產(chǎn)生更大的影響，為進(jìn)一步理解稻瘟病抗性的遺傳機(jī)制提供了重要線索。與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)和序列標(biāo)記位點(diǎn)（SNP）技術(shù)相比，PARMS技術(shù)在基因型鑒定中表現(xiàn)出更高的檢測效率［26］，近年來在水稻［11］、小麥［27］、玉米［28］、油菜［29］上被廣泛應(yīng)用。然而，本研究在操作中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)目標(biāo)區(qū)域變異較小或重復(fù)序列較多時，PARMS技術(shù)的準(zhǔn)確性會受到影響，在應(yīng)用中還需注意進(jìn)行相應(yīng)優(yōu)化。

盡管本文在抗稻瘟病基因分布和基因型與田間抗病性關(guān)系等方面取得了一些研究結(jié)果，但試驗數(shù)據(jù)可能受到研究材料和技術(shù)選擇的影響，仍存在一些局限性。由于研究聚焦于江蘇太湖稻區(qū)，選擇的水稻材料和抗性基因也主要是針對該地區(qū)，一方面可能會限制結(jié)論的泛化性，但另一方面也使本研究結(jié)果更具有針對性和實(shí)際應(yīng)用價值。今后的研究將進(jìn)一步考慮抗性基因的組合及其與抗病性的關(guān)系，進(jìn)行更全面的抗性基因檢測和更大樣本的田間抗病性鑒定。