金銀花根際土壤放線菌分離及其抑菌活性測定

蘇柏茵，楊翠鳳，陸燕雯，冼思蔓，梁 忠，藍 丹

（百色學院農業與食品工程學院，廣西百色 533000）

藥用植物是一類具有入藥用途的植物，在根系存在著植物和微生物之間的相互作用，它們的相互作用可改善土壤環境，從而成為有利于植物生長的資源。植物與這些微生物關系密切，在長時間的自然演變中雙方形成了互惠共生體系［1］。大量研究表明，根際微生物無論在種類還是數量上都具有多樣性的特征，且遠多于根際外土壤的微生物［2］。另外，一些研究表明，藥用植物的根際中微生物較多，尤其是活性放線菌［3］，綜合藥用植物的功效，其根際被推測可能擁有更多的生防菌株［4］。

放線菌（Actinomycetes）是原核微生物，革蘭氏染色呈陽性，在培養基上菌落呈放射狀，故得名放線菌，以孢子繁殖，其菌絲呈分支狀，分類有氣生菌絲和基內菌絲，在土壤中廣泛分布，主要分類有鏈霉菌屬、小單孢菌屬、小雙孢菌屬、馬杜拉菌屬等，土壤中90%以上屬于鏈霉菌屬。放線菌是具有潛力的微生物資源，其價值主要來自其次級代謝產物，可應用于抗生素、維生素、酶制劑等，應用的抗生素大約70%由放線菌產生，如鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素等，與人類日常的生活與生產關系密切［5］。在一些極端環境下，如干旱、潮濕、鹽堿地、重金屬污染、輻射污染區、地熱地區等，發現新型放線菌已成為研究的一大熱點［6］。

土壤中含有大量放線菌，是放線菌的主要來源。以分離技術來說，人們分離出的放線菌僅占自然界放線菌總量的10%～20%。因此，土壤放線菌資源的新菌種分離也是重要的研究方向。本試驗采用金銀花（Lonicera japonicaThunb.）根際土壤作為試驗材料，對其中的放線菌資源進行分離，并對分離出的放線菌進行抗菌活性篩選。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品采自金銀花根際土壤，金銀花高35～40 cm，整株植株健康，無明顯病害，樣品取自金銀花根部5～15 cm 耕作層土壤，樣品裝于一次性無菌袋中，帶回實驗室放于置物架上風干。

高氏一號培養基：磷酸氫二鉀0.5 g，七水硫酸鐵0.01 g，硝酸鉀1 g，七水硫酸鎂0.5 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，可溶淀粉20 g，無菌水1 000 mL，pH 調至7.2～7.4。LB 培養基：LB 肉湯25 g、無菌水1 000 mL、瓊脂15～20 g。培養基配制好后立即高溫高壓滅菌（121 ℃，20 min），放置備用。

抑菌活性測試菌株：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。

1.2 方法

1.2.1 金銀花根際土壤樣品預處理 采集的土壤在室溫下風干6 d，然后取出5 g土壤樣品放入盛有45 mL無菌水的三角瓶內，置入搖床（設定180 r/min，30 min）混勻，使土壤充分懸浮［7］。用移液槍取1 mL上清液，加入9 mL 無菌水中，依次按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍梯度稀釋。本次試驗取10-3、10-4、10-5的樣品溶液涂布于高氏一號培養基。

1.2.2 菌株分離與純化 將涂布土壤稀釋液的平板置于28 ℃恒溫箱，培養5～7 d 后觀察菌落生長情況和菌落特征，挑選肉眼可辨別的放線菌接種于高氏一號培養基純化培養。

1.2.3 抑菌活性研究 放線菌發酵液制備：從培養好的已純化放線菌培養基中挑取菌絲，置于高氏一號液體培養基中進行搖床培養，搖床設定28 ℃，180 r/min 轉速，培養5 d。

細菌種子液制備：采用平板劃線法，在LB 培養基上37 ℃培養24 h，之后用接種環將細菌接種于LB液體培養基的試管，搖床培養2 h，設定溫度37 ℃，180 r/min 轉速。

待測細菌平板處理：分別從上述制備的種子液中吸取100 μL 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌置于平板上，均勻涂布至微干。

放線菌抑菌特性研究采用濾紙片法［8］：用無菌鑷子將濾紙片（直徑6 mm，厚度0.7 mm）浸入放線菌發酵液中，取出并在瓶內壁除去多余的液體，將紙片放到接好靶標菌的平板上，每個處理3 次重復，以無菌水代替發酵液浸泡濾紙片作為對照，28 ℃培養48～72 h。

1.2.4 拮抗菌16S rDNA 的鑒定 鑒定使用Biospin細菌基因組DNA 提取試劑盒提取篩選出的拮抗菌DNA，以 通 用 引 物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCA-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）擴增拮抗菌株16S rDNA 序列。

PCR 反 應 體 系 為40 μL，包 括2×Phanta Max Master Mix 20 μL，10 μmol/L上游引物1 μL，10 μmol/L下 游 引 物1 μL，DNA 模 板1 μL，ddH2O 補 足 至40 μL。PCR 擴增在Biometra Easy Cycler Gradient 中進行，程序為95 ℃預變性3 min；95 ℃完成變性15 s，56 ℃復性15 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環；最后72 ℃延伸5 min。PCR 擴增產物委托擎科生物科技有限公司進行測序，最后將測序結果在NCBI 網站進行BLAST-N 比對，然后利用MEGA5.05 軟件構建NJ系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 放線菌菌落形態

從金銀花根際土壤分離獲得的7 株放線菌菌落多為白色（1 株為粉色，1 株為灰色），圓形，表面干燥，不光滑，呈干粉樣，凸起或扁平，部分有可溶性色素產出，如圖1 所示。

2.2 抑菌活性

圖2 為濾紙片法篩選抑菌活性菌株的結果。經篩選，4 號和7 號放線菌對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌具有拮抗作用，2 株放線菌對金黃色葡萄球菌的抑菌作用效果相當，抑菌圈直徑均為4.5 mm（表1）；2 株放線菌對枯草芽孢桿菌均具有抑菌作用，其中4 號放線菌對枯草芽孢桿菌產生的拮抗效果較好，抑菌圈直徑達6.5 mm。

表1 產生拮抗作用的放線菌的抑菌圈直徑 （單位：mm）

圖2 濾紙片法篩選抑菌活性菌株

2.3 拮抗菌株的分子鑒定

對拮抗菌株進行16S rDNA 分子鑒定，結果見圖3。結果表明，4 號放線菌與黃三素鏈霉菌（Streptomyces flavotricini）菌株的親緣關系最近，聚為一個分支，一致性為100%；7 號放線菌與加納鏈霉菌（Streptomyces gardneri）菌株的親緣關系最近，聚為一個類群，經鑒定，黃三素鏈霉菌和加納鏈霉菌均屬于鏈霉菌屬，一致性為100%。

圖3 基于16S rDNA 構建NJ 系統發育樹

3 討論

自植物根際土壤中分離的具有拮抗作用的放線菌大多為鏈霉菌屬，其次為小單孢菌屬、小雙孢菌屬等其他屬［9-11］。研究人員從艾草［12］、枸骨［13］、木豆［14］等中草藥的根際土壤中能夠分離獲得具有抑菌活性的放線菌菌株，甚至是廣譜性抑菌的活性菌株，因此，從藥用植物根際土壤分離篩選有益菌株是發掘具有抑菌作用的活性菌株的有效途徑。與內生菌不同的是，根際的分泌物使得附近的土壤微生物富集，分布在根際的放線菌的豐富度依賴于土壤所處環境的理化性質。研究發現，最利于這些菌株生長的成分往往來自鄰近植物根際的土壤浸液。此外，土壤中的有機質會影響放線菌的富集度，有機質越多，其他細菌便會和放線菌形成競爭性關系導致該區域的放線菌的富集度下降，因此在一些極端土壤環境下更有可能發現新型放線菌［15］。本試驗共分離出7 株放線菌，經初篩與復篩，4 號和7 號這2 株放線菌對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌2 種病原細菌產生了抑菌圈，即具有拮抗作用。經分子鑒定，結果表明4 號為黃三素鏈霉菌，7 號為加納鏈霉菌。