腎氣丸加減方對高糖高脂誘導的MIN6細胞保護作用及PI3K/AKT/GSK-3β信號通路的影響

張月穎 張珊 溫志歌 史佩玉 王皓朔 倪青

胰島β細胞功能受損是2型糖尿病發生發展的中心環節,故保護和恢復胰島β細胞功能是改善和治療2型糖尿病的重要策略。近年來研究者認為胰島內分泌細胞間命運轉換是導致糖尿病胰島功能下降的重要原因[1-2],胰島β細胞“去分化”的發現拓展了β細胞功能損傷的機制范圍,去分化即β細胞在應激狀態下退化成具有多分化潛能的前體細胞,喪失部分或全部胰島素分泌的能力,當應激環境解除后,其可再分化為具有正常分泌功能的β細胞,此過程與遺傳基因和后天環境因素有關[3-4]。既往研究證實,補腎法在糖尿病治療中可以起到降血糖、保護胰島細胞功能作用[5-7]。金匱腎氣丸出自經書《金匱要略》,功用補腎填精,助陽化氣,本研究中藥腎氣丸加減方以金匱腎氣丸為基礎方加減化裁,去炮附子以防止其辛熱傷津,加黃芪、黨參健脾益氣,氣津雙補,胡蘆巴溫腎陽助氣化和馬齒莧清熱利濕以應標本兼顧治則。

胰島β細胞去分化機制為β細胞功能富集基因的下調,其中比較關鍵的兩個基因為胰腺十二指腸同源盒基因(pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1)和肌腱膜纖維肉瘤癌基因同系物 A(v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homologue A,MafA),PDX-1是胰腺發育成熟過程中重要轉錄因子,對β細胞增殖和胰島素分泌功能起重要作用[8-9],MafA特異存在于胰島β細胞,與PDX-1共同促進胰島素基因表達,是胰島β細胞分化過程中重要激活因子[10-11],PDX-1和MafA可作為量化β細胞再生和功能“再恢復”的標志物[12],其穩定性受糖原合成酶激酶-3β (glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)的影響。GSK-3β是一種多功能絲氨酸/蘇氨酸激酶,在能量代謝、細胞生長和凋亡中起重要作用[13],GSK-3β可調節胰島β細胞中PDX-1的穩定性,其過度激活可導致胰島β細胞增殖減少和功能下降[14-15]。在此基礎上,本研究從β細胞凋亡角度基于磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸—蘇氨酸激酶/糖原合成激酶3β(phosphoinositide3-kinase/threonine-protein kinase/glycogen synthase kinase-3,PI3K/Akt/GSK-3β)信號通路探究腎氣丸加減方對高糖高脂作用下MIN6細胞功能影響及可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞

小鼠胰島β細胞(MIN6),購于上海雅吉生物科技有限公司,完成細胞及種屬鑒定。

1.2 實驗藥物

腎氣丸加減方藥物組成:生地黃24 g、生山藥12 g、山茱萸12 g、茯苓9 g、澤瀉9 g、牡丹皮9 g、桂枝3 g、黃芪12 g、黨參9 g、胡蘆巴6 g、馬齒莧9 g。含藥血清制備:健康SD大鼠20只,6～8周齡,體質量300～350 g,購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司,適應性喂養結束后,隨機分為腎氣丸加減方含藥血清組及空白血清組。根據大鼠與人的藥物用量換算比(6.25∶1),每只大鼠的每日使用中藥灌胃劑量按以下公式計算:6.25×成人每日劑量(114 g生藥)/成人平均體重(70 kg)=10.2 g/(kg·d)。空白組予純凈水同等計量灌胃,每12小時灌胃一次,連續灌胃3.5天,使血藥濃度穩定。最后一天灌胃結束2小時后,使用3%戊巴比妥鈉按照30 mg/kg腹腔注射進行麻醉,行腹主動脈取血,室溫靜置2小時,使用低溫高速離心機離心,3 500 rpm,離心15分鐘,使用無菌移液槍吸取上清至新的離心管,即為血清,凍存于-80°C冰箱。

1.3 主要試劑與儀器

RPMI1640培養基(Gibco,11875-093),胎牛血清FBS(Gibco,10099141),高糖高脂試劑盒(鯤創,KT002),0.25%胰酶+0.02%EDTA(Gibco,25300054),CCK-8試劑盒(北京翱擎生物,AQ308),胰島素放射免疫分析盒(北方生物技術研究所,國藥準字S10930046),ANNEXIN V- FITC/PI 凋亡檢測試劑盒(Solarbio,CA1020),Anti-β Actin(Abcam, ab8245),Anti-PI3K(CST, 4257),Anti-p-PI3K(CST, 4228s),Anti-Akt(CST, 4691),Anti-p-Akt(CST, 4060s),Anti-GSK-3β(Abcam,ab93926),Anti-p-GSK-3β(ser-9)(CST,5558T),Anti-PDX-1(Abcam,ab134150),Anti-MafA(Abcam,ab264418),LY294002(Abcam,ab120243)。

倒置相差顯微鏡(Nikon,日本),T25/T75細胞培養瓶(430641,CORNING),細胞培養箱(HERAcell150i,Thermo),酶標儀(680,Bio-Rad),電泳儀(PowerPacTM,Bio-Rad),蛋白垂直電泳槽(MINI SUB,Bio-Rad)。

1.4 細胞造模建立與分組干預

參考制備糖脂毒性細胞模型相關實驗文獻,本實驗選用30 mmol/L葡萄糖(Glu)+棕櫚酸鈉(PA)進行造模,結合細胞活力及半數抑制率,設計實驗梯度進行PA造模條件摸索。為觀察腎氣丸加減方含藥血清促進MIN6增殖的最佳藥物濃度,根據藥物和大鼠血清的占比,含藥培養基設計2.5%、5%、10%、15%、20%不同濃度梯度預培養24小時后,根據上述最佳造模條件繼續干預24小時觀察最佳作用時間,實驗重復5次,按照腎氣丸加減方含藥血清促進MIN6增殖的最佳濃度進行后續實驗。

根據上述結果,實驗干預分組如下:空白組:培養基+15%空白血清;模型組:30 mmol/L Glu+0.4 mmol/L PA+培養基+15%空白血清;腎氣丸加減方低劑量組:5%腎氣丸加減方含藥血清預培養24小時,后使用30 mmol/L Glu+0.4 mmol/L PA+5%腎氣丸加減方含藥血清+10%空白血清培養基培養;腎氣丸加減方中劑量組:10%腎氣丸加減方含藥血清預培養24小時,后使用30 mmol/L Glu+0.4 mmol/L PA+10%腎氣丸加減方含藥血清+5%空白血清+培養基培養;腎氣丸加減方高劑量組:15%腎氣丸加減方含藥血清預培養24小時,后使用30 mmol/L Glu+0.4 mmol/L PA+15%腎氣丸加減方含藥血清+培養基培養;通路阻滯劑組(LY294002):15%腎氣丸加減方含藥血清預培養24小時,后使用30 mmol/L Glu+0.4 mmol/L PA +15%腎氣丸加減方含藥血清+培養基+50 μmol/L LY294002培養。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 CCK-8法檢測細胞活力 CCK-8法評估空白組、模型組及腎氣丸加減方低、中、高劑量組MIN6細胞活力:取對數生長期的MIN6細胞按照濃度1×105個細胞/mL(預實驗確定細胞個數)接種于96孔板,每孔加入100 μL細胞混懸液,每組設5個復孔,邊緣留空白孔加入PBS,以免細胞混懸液蒸發。

CCK-8反應:按照預定時間取出孵育細胞,棄去孔中培養基,每孔加入10% CCK-8液在空白培養基中(孔中不能有氣泡),培養板繼續按照規定時間孵育。

上機檢測:按照預定時間觀察細胞顏色并上酶標儀檢測,吸光值設定為450 nm,測定不同組別吸光度值。

1.5.2 細胞上清液胰島素含量測定 采用胰島素放射免疫分析試劑盒檢測空白組、模型組、腎氣丸加減方低、中、高劑量組MIN6細胞上清液胰島素含量。(1)藥品準備:Ins.標準品、125I-Ins、豚抗-Ins.抗體、驢抗豚免疫分離劑、Ins.質控血清、Ins.緩沖液。(2)測定步驟:取圓底聚苯乙烯試管若干,用記號筆或特殊鉛筆編號NSB、S0-S5和待測樣品管等,然后用微量加樣器按表1加樣。加樣前所有試劑(尤其分離劑)包括待測樣品要搖勻,并且最好平衡到室溫,每組重復3次。(3)數據處理: 由電腦自動處理得出結果,使用log-logit處理模式。

表1 加樣程序表 (單位:μL)

1.5.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率 細胞以2×105個/mL接種于6孔板中,每孔加2 mL細胞混懸液,待細胞貼壁后按照1.4實驗分組給予不同處理,干預24小時后根據Annexin V FITC/PI 凋亡檢測試劑盒說明書進行實驗:(1)使用細胞刮刀輕輕仔細刮下細胞(避免胰酶對細胞消化的傷害)轉移至15 mL離心管,同上清液一起離心,離心結束后棄去上清,用預冷的含2%FBS的PBS洗滌細胞2次,第2次離心結束后使用1 × Buffer重懸細胞,進行細胞計數,每組重復3次。(2)按照說明書調整細胞上機濃度為1×106個/mL,取100 μL轉移至Falcon流式管(提前在F管中加入AV、PI各5 μL),輕彈管身,充分混勻。(3)室溫避光孵育15分鐘后各管加入200 μL× Buffer,過濾后上機檢測。

1.5.4 PI3K/AKT/GSK-3β信號通路和PDX-1/MafA蛋白表達檢測 免疫蛋白印跡法樣本收集:對數生長期的MIN6細胞以2×105個/mL接種于6孔板中,每孔加2 mL細胞混懸液,待細胞貼壁后按照實驗分組給予不同處理,干預24小時后處理細胞。BCA 法測定蛋白濃度并將各組濃度調平,蛋白樣品經凝膠電泳后轉移至PVDF膜,封閉后加入一抗按一定比例稀釋抗體的抗體稀釋液中,置于4°C冰箱搖床上,搖蕩過夜。次日洗膜后孵育二抗(1∶5 000), 孵育結束洗膜后利用ECL化學發光法顯影,采用 Image J軟件統計蛋白條帶的灰度值及其相對應的內參蛋白條帶的灰度值。目的條帶灰度值/內參條帶灰度值,即為每個樣本所含目的蛋白的相對含量。每個目的基因至少測定3個樣本。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 MIN6細胞模型的成功構建

30 mmol/L Glu聯合PA呈梯度依賴性抑制MIN6細胞增殖,PA濃度越高細胞活力越低,直線回歸分析得出PA抑制細胞增殖的IC50值為0.38 mmol/L,故最終本實驗選取0.4 mmol/L PA聯合30 mmol/L Glu對MIN6細胞進行造模。見表2。

表2 PA造模法各濃度MIN6細胞活力吸光度值

2.2 腎氣丸加減方含藥血清改善MIN6細胞損傷模型的作用

與空白組相比,模型組細胞存活率顯著下降(P<0.01)。與模型組比較,不同濃度腎氣丸加減方組含藥血清干預細胞后,細胞存活率均有不同程度的升高,其中2.5%含藥血清組比較無統計學差異(P>0.05),5%、10%、15%以及20%組細胞存活率均有提升(P<0.05或P<0.01),其中5%～15%組細胞存活率呈升高趨勢,20%組細胞存活率較15%組出現下降,因此,選用15%組作為實驗中藥高劑量組,10%、5%依次作為實驗中、低劑量組。見表3。

表3 各組MIN6細胞活力吸光度值

2.3 腎氣丸加減方含藥血清對MIN6細胞胰島素分泌的影響

胰島素放射免疫分析結果顯示,與空白組比較,模型組MIN6細胞胰島素分泌水平顯著下降(P<0.01)。與模型組細胞比較,腎氣丸加減方各組MIN6細胞胰島素分泌水平均升高(P<0.05或P<0.01)。見表4。

表4 各組MIN6細胞胰島素分泌水平

2.4 腎氣丸加減方含藥血清對糖脂毒性誘導的MIN6細胞凋亡的影響

流式細胞實驗結果顯示,與空白組比較,模型組MIN6細胞凋亡顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,腎氣丸加減方低、中、高劑量組MIN6細胞凋亡率均出現下降(P<0.05或P<0.01),其中高劑量組MIN6細胞凋亡率最低。見表5,圖1。

表5 各組MIN6細胞凋亡率

2.5 腎氣丸加減方含藥血清對MIN6細胞PI3K/AKT/GSK-3β信號通路蛋白表達的影響

2.5.1 MIN6細胞PI3K/AKT/GSK-3β信號通路蛋白表達檢測 蛋白免疫印跡結果顯示,與空白組對比,模型組中PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT及p-GSK-3β蛋白表達均降低(P<0.05或P<0.01),GSK-3β表達量升高(P<0.05)。與模型組對比,腎氣丸加減方中劑量組、高劑量組中PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT及p-GSK-3β蛋白表達均升高(P<0.05或P<0.01),GSK-3β表達量降低(P<0.01)。通路阻滯劑組中腎氣丸加減方上述結果被抵消(P<0.05或P<0.01)。見表6,圖2。

注:A為空白組,B為模型組,C為腎氣丸加減方低劑量組,D為腎氣丸加減方中劑量組,E為腎氣丸加減方高劑量組,F為通路阻滯劑組。

表6 不同干預措施下MIN6細胞PI3K/Akt/GSK-3β信號通路的蛋白表達 目標蛋白/Actin)

2.5.2 MIN6細胞PDX-1/MafA蛋白表達檢測 蛋白免疫印跡結果顯示,與空白組對比,模型組中PDX-1及MafA蛋白表達均降低(P<0.05或P<0.01)。與模型組對比,腎氣丸加減方各組中PDX-1及MafA蛋白表達均升高(P<0.05或P<0.01)。LY組中腎氣丸加減方上述結果被抵消(P<0.05或P<0.01)。見表7,圖3。

注:A為空白組,B為模型組,C為腎氣丸加減方低劑量組,D為腎氣丸加減方中劑量組,E為腎氣丸加減方高劑量組,F為通路阻滯劑組。

表7 不同干預措施下MIN6細胞PDX-1/MafA蛋白的表達 目標蛋白/Actin)

3 討論

2型糖尿病屬中醫“消渴”范疇,病因包括先天稟賦不足、后天失養,病及五臟,尤與脾腎二臟密切相關。“脾主運化”是維持胰島功能和血糖穩態的核心環節,恢復脾主運化功能可改善糖尿病胰島功能衰竭[16]。胰島β細胞衰竭原因是去分化而非凋亡,去分化過程與基因表達及結構功能蛋白變化相關,結合中醫腎主先天基礎理論,因此本研究選方腎氣丸加減方,源于《金匱要略》經方金匱腎氣丸加減,本方補腎氣基礎上去大辛大熱的附子,改用胡蘆巴溫陽化氣,加用黃芪、黨參健脾助氣化,馬齒莧清熱利濕,全方補泄兼施,共奏補腎健脾,助陽化氣之功效。現代藥理研究表明,腎氣丸君藥生地有效成分環烯醚萜苷類具有促胰島素分泌和保護胰島細的胞功能[17-18],胡蘆巴的有效成分胡蘆巴堿能有效改善糖尿病大鼠糖脂代謝[19],馬齒莧有效成分馬齒莧多糖可促進胰島β細胞PDX-1蛋白表達,對胰島β細胞的增殖再生有促進作用[20],這為本研究選用腎氣丸加減方提供了理論基礎和實驗穩定性。

慢性應激環境是胰島β細胞去分化的主要誘導因素,糖尿病發生發展過程中出現的高血糖和脂代謝紊亂是人體處于氧化應激內環境的主要原因之一[21],慢性應激環境的解除是胰島β細胞再分化的前提基礎,基于此,本研究選用高糖聯合棕櫚酸鈉來模擬糖尿病人體內高糖高脂內環境,觀察在高糖高脂作用條件下,腎氣丸加減方對胰島細胞功能的保護作用及作用機制。本研究選用30 mmol/L 葡萄糖聯合0.4 mmol/L棕櫚酸鈉作用24小時作為構建體外細胞損傷模型的條件,CCK-8法測定模型組細胞活力值明顯下降,流式細胞實驗顯示模型組細胞凋亡率上升,說明成功構建了穩定的體外胰島β細胞損傷模型。在上述造模條件下,加入不同濃度腎氣丸加減方含藥血清干預24小時后,通過CCK-8法和流式細胞實驗觀察不同組MIN6細胞活力和凋亡率,結果顯示與模型組比較,腎氣丸加減方中、高劑量組細胞活力明顯升高,細胞凋亡水平下降,結合胰島素分泌水平的測定,證實腎氣丸加減方可提高高糖高脂造模條件下MIN6細胞活力,減少細胞凋亡率,顯著促進胰島素分泌,保護胰島β細胞功能。本研究中模型組細胞凋亡率為30%左右,但胰島素分泌水平卻下降很多,因此,是否有一部分細胞未發生凋亡,但已經失去了胰島素分泌水平,無論胰島細胞凋亡還是去分化都屬于胰島β細胞功能障礙,腎氣丸加減方起到了恢復胰島β細胞功能的作用。

PDX-1與MafA基因被認為是胰島素基因轉錄“調節器”,其中PDX-1主要參與胰島細胞生理功能的維持,是胰腺發育形成的開關基因[22],對胰島β細胞具有促增生和抗凋亡的作用[23],PDX-1表達減少會造成胰島β細胞功能減退,自我修復能力減弱,使胰腺組織在高血糖環境中自我修復能力減弱,進而加重糖尿病進展,因此在調控胰島β細胞成熟、保護胰島β細胞功能以及促進胰島β細胞再生中,PDX-1因子的重要性處于核心位置。MafA作為胰島β細胞特異性轉錄因子,是葡萄糖刺激胰島β細胞進行胰島素基因表達的關鍵轉錄因子之一,與PDX-1分別結合胰島素基因啟動子調控區域的C1、A3順式作用元件,協同激活胰島素基因表達,促進胰島β細胞分泌胰島素,它在β細胞分化的最后階段胰島素生成細胞成批發育時才有所表達,對β細胞的生存、增殖有重要作用[24]。PI3K/AKT作為胰島β細胞中經典代謝通路,其參與胰島β細胞增殖、胰島素代謝、葡萄糖利用等多個環節,對胰島β細胞功能維持具有重要作用,這個信號通路的開啟信號通路調控著下游蛋白,包括哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和GSK-3β,GSK-3β通路調節細胞凋亡和炎癥等多種生物活性[25],活化的AKT作為GSK-3β的上游因子,與GSK-3β結合后使GSK-3β絲氨酸9位點磷酸化而失活,因此p-GSK-3β可發揮抗凋亡作用。同時,GSK-3β調節著胰島β細胞中PDX-1的穩定性,GSK-3β作為糖原合成酶激酶的一種亞型,其過度激活對其他蛋白有降解作用[23]。本研究中模型組的GSK-3β蛋白表達升高,GSK-3β被激活同時PDX-1、MafA表達受抑制,其機制可能是由于GSK-3β參與了PDX-1和MafA蛋白的降解;腎氣丸加減方干預后,GSK-3β表達受到抑制,p-GSK-3β蛋白、PDX-1和MafA蛋白表達均上調,且加入通路阻滯劑LY294002后,腎氣丸加減方以上作用被抵消,證明腎氣丸加減方可能通過PI3K/AKT/GSK-3β通路提高了PDX-1和MafA蛋白的表達,以此恢復胰島β細胞功能。

綜上所述,腎氣丸加減方含藥血清可以提高糖脂毒性作用下MIN6細胞活力,減少細胞凋亡,促進胰島素分泌。作用機制與 PI3K/AKT/GSK-3β 信號通路的激活、抑制GSK-3β的表達有關,進而升高PDX-1和MafA的蛋白表達,保護和恢復胰島β細胞功能。