丹參活性成分防治骨關節炎作用機制的研究進展

戴娜 王從安 師彬

中醫將骨關節炎歸為“骨痹”范疇,其病機特點為痹證多瘀血,“瘀”貫穿整個疾病始終,治療當以活血祛瘀治療其標,再辨證論治求本,丹參是典型的活血祛瘀藥物,可用于治療多種痹證[1]。丹參的活性成分包括水溶性酚酸類和脂溶性丹參酮類化合物,具有抗炎、抗氧化、抗血栓、抗凝、改善微循環、抗腫瘤等多種功效[2]。丹參的活性成分中水溶性酚酸類包括丹參素、丹酚酸A、丹酚酸B等,脂溶性丹參酮類包括丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅱ、隱丹參酮等,臨床主要的丹參類制劑包括注射用丹參多酚酸、注射用丹參多酚酸鹽、丹紅注射液等,臨床廣泛用于心腦血管病的治療[3]。但目前丹參類制劑用于骨關節炎的研究尚少。袁長深等[4]運用網絡藥理學分析,丹參的活性成分可作用于骨關節炎65個靶基因,發揮抗骨關節炎作用。本研究通過統計整理國內外近年來丹參活性成分用于骨關節炎的相關研究,綜述了其作用機制,為丹參的新藥開發提供理論支持。

1 丹參活性成分通過減輕炎癥反應延緩骨關節炎的進展

甲氨喋呤作為抗炎藥臨床廣泛用于膝骨關節炎,但其免疫抑制劑的特性顯著性了長期使用,尋找膝骨關節炎更佳的抗炎藥物迫在眉睫,丹參酮為膝骨關節炎的治療開辟了新的思路[5]。孫曉娟等[5]對膝骨關節炎大鼠模型運用丹參酮連續治療21天后,與甲氨喋呤組相比,丹參酮組降低大鼠膝關節炎指數評分作用相似,證實丹參酮對膝骨關節炎具有較好的抗炎活性,經熒光素酶基因活性方法對比,經55%洗脫液的丹參酮乙醇提取液的抗炎活性最高。丹參多種活性成分具有良好的抗炎活性,機制包括抑制白介素1β(interleukin 1 β,IL-1β)的活性、下調低氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)/血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達、上調β抑制蛋白2(β-arrestin2)的表達、阻止toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)/ 髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)/ 核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的激活發揮抗炎作用。

1.1 丹參活性成分通過抑制IL-1β的活性發揮抗炎作用

IL-1β在骨關節炎的炎癥反應中起著關鍵作用, IL-1β能促使NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)等多種炎癥信號通路活化,加劇骨關節炎的炎癥反應。丹參酸A可通過抑制IL-1β的活性發揮抗炎作用[6-9]。

Feng S等[7]運用24 ng/mL的IL-1β刺激人原代軟骨細胞后發現,誘導性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,iNOS)、環氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)等炎癥介質表達明顯增強,p-65/NF-κB、p-38/MAPK的水平明顯提高,經10、20、40 μg/mL的丹參酸A處理2小時后,呈劑量依賴性促使COX-2、iNOS的表達明顯下降,總p-65、p-38的表達顯著降低,與IL-1β組對比差異顯著(P<0.01),提示,丹參酸A通過下調NF-κB和p38/MAPK途徑發揮抗炎活性。

Lou YT等[8]進行體內和體外的實驗發現,25、50、100 μmol/L丹酚酸B呈濃度依賴性抑制IL-1β刺激人軟骨細胞引起的COX-2、iNOS、一氧化氮(nitric oxide,NO)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)水平升高,阻止IL-1β誘導的NF-κB p65的信號通路激活和核易位,進一步降低骨性關節炎的炎性損傷。

Feng ZH等[9]研究也證實,5、10、20 μmol/L的隱丹參酮能以濃度依賴性降低IL-1β刺激引起的人類骨關節炎軟骨細胞NO、PGE2、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等炎癥介質的表達,阻止NF-κB、MAPK、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)的活化及p65核易位,通過抗炎活性延緩骨關節炎的進展。

1.2 丹參活性成分通過下調低HIF-1/VEGF的表達發揮抗炎作用

HIF-1/VEGF信號通路,參與骨關節炎的炎癥反應和血管形成,丹酚酸B可通過抑制該通路減輕骨關節炎的炎癥程度[10]。與骨關節炎大鼠相比,10、40 mg/kg丹酚酸B處理后大鼠軟骨中HIF-1、VEGF、TNF-α、IL-6、iNOS的表達顯著降低,丹酚酸B+HIF-1激活組的VEGF、TNF-α、IL-6、iNOS水平較單純丹酚酸B處理組的高(P<0.05),運用CT機檢測幾組大鼠的關節炎軟骨的骨體積分數和踝骨表面積與骨體積比值也顯示出了與上述指標相似的變化,表明丹酚酸B可通過下調HIF-1/VEGF的表達,以降低炎癥反應,減輕軟骨組織的損傷[10]。

1.3 丹參活性成分通過上調β-arrestin2的表達發揮抗炎作用

β-arrestin2是NF-κB的上游細胞因子,其過表達可抑制NF-κB的激活,丹參酮ⅡA可通過促進β-arrestin2的表達,發揮抗炎活性[12]。IL-1β可促使大鼠軟骨細胞中NF-κB激活及誘導多種炎癥介質的分泌已得到多篇研究證實[8-9, 11],與IL-1β組相比,25、50 μmol/L的丹參酮ⅡA處理大鼠軟骨細胞后,β-arrestin2的表達明顯升高,NF-κB/p56的表達顯著降低,證實,丹參酮ⅡA可通過促進β-arrestin2的表達以減輕如昂細胞的炎癥反應[12]。

1.4 丹參活性成分通過阻止TLR4/MyD88/NF-κB的激活發揮抗炎作用

TLR4/Myd88/NF-κB的激活與骨關節炎的發生與發展密切相關,丹參酮ⅡA可通過抑制該通路的激活以抑制局部炎癥反應[13]。張金峰等[13]通過丹參酮ⅡA治療前交叉韌帶切斷術建立的膝骨關節炎大鼠,與空白組對比,10、20、50 mg/kg的丹參酮ⅡA能顯著降低大鼠關節組織和血清中IL-1β、TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達(P<0.05),顯著抑制軟骨組織中TLR4、Myd88、NF-κB蛋白的表達(P<0.05),阻止NF-κB p56蛋白核易位,發揮顯著抗炎活性。

2 丹參活性成分通過保護軟骨細胞減輕軟骨組織損傷

丹參活性成分通過抑制IL-1β誘導的軟骨降解,調節軟骨細胞去分化,提高TGF-β1的活性,對軟骨細胞發揮保護作用,以延緩軟骨的病理改變,促進軟骨組織的形成,延緩骨關節炎的進展。

2.1 丹參活性成分通過抑制軟骨降解對軟骨細胞發揮保護作用

骨性關節炎的主要病理特征為進行性軟骨降解,IL-1β可誘導軟骨細胞分泌中性金屬蛋白酶,如基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-1、MMP-13、聚蛋白多糖酶(aggrecanase,ADAMTS)-5,還能抑制蛋白多糖和膠原蛋白Ⅱ的合成來影響軟骨細胞的合成代謝活性,最終引起軟骨降解和骨質破壞,丹參多種活性成分可通過抑制軟骨降解,延緩骨關節炎的進展[11-15]。Wang XP等[11]丹參酮I用于軟骨細胞系CHON-001的體外實驗中,使用10 ng/mL IL-1β刺激72小時后,膠原蛋白II、聚集膠、SOX001的表達顯著降低(P<0.05),MMP-13和p-NF-κB的表達顯著提高(P<0.05),經10、20 μmol/L的丹參酮I處理后,逆轉了IL-1β引起的上述改變(P<0.05),降低骨關節炎小鼠的國際骨關節炎研究學會(OARSI)評分、軟骨下骨厚度和滑膜炎評分(P<0.05),顯著阻止軟骨細胞外基質降解,有助于控抑制骨關節炎病情的發展。經IL-1β刺激后,MMP-1、MMP-13、ADAMTS-5的表達明顯高于未被IL-1β處理的人原代軟骨細胞(P<0.05),經10、20、40 μg/mL的丹參酸A處理后MMP-1、MMP-13、ADAMTS-5的水平顯著降低(P<0.05),抑制效果存在濃度依賴性[7]。一項丹參酸A用于小鼠軟骨細胞的體外實驗中,與未被IL-1β處理的相比,經10 ng/mL的IL-1β處理的大鼠軟骨細胞膠原蛋白Ⅱ的產生顯著下降(P<0.05),MMP-3、ADAMTS-5的水平顯著提高(P<0.05),運用6.25、12.5、25 μmol/L的丹參酸A處理后,以濃度依賴性促使膠原蛋白Ⅱ的分泌,同時抑制MMP-3、ADAMTS-5的表達,以阻止小鼠軟骨細胞細胞外基質的降解[6]。丹參酮ⅡA能逆轉IL-1β刺激大鼠軟骨細胞引起的MMP-1、MMP-3、MMP-13的高表達和膠原蛋白Ⅱ、聚蛋白多糖酶的低表達,從而顯著降低軟骨細胞排列紊亂、表面粗糙、軟骨層變薄等病理學改變,有效阻止軟管基質降解[12]。Jia PT等[14]通過前交叉韌帶橫斷和內側半月板切除術建立骨關節炎大鼠模型,經0.25～0.5 mg/kg的丹參酮ⅡA處理后,不僅顯著抑制了TNF-α、IL-1β、iNOS的表達,還使軟骨中MMP-13的表達顯著降低(P<0.05),基質金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)的表達顯著升高(P<0.05),有效延緩骨關節炎形成過程中軟骨降解的進程。閔亞林等[15]使用丹參水提液治療骨關節炎大鼠,5 mg/kg的丹參水提液可有效逆轉碘乙酸鈉引起的大鼠血清MMP-13升高,顯著提高軟骨體積和厚度,延緩軟骨細胞的病理變化。

2.2 丹參活性成分通過調節軟骨細胞去分化對軟骨細胞發揮保護作用

軟骨細胞去分化后將失去成軟骨特征,并顯示出成纖維細胞樣形態,失去其結構和功能,丹參酮ⅡA可通過調節軟骨細胞去分化的發生,以減輕軟骨組織的損傷[6]。Zhang Y S等[16]采用網絡藥理學方法篩選發現,丹參酮IIA可通過7個hub基因在內的28個靶點參與軟骨去分化進程,通過促進結締組織、細胞外基質、骨骼系統、軟骨發育和軟骨細胞分化,調節軟骨細胞去分化的發生和發展,促進骨性關節炎軟骨的修復;值得注意的是,丹參酮IIA在100～200 μg/mL的濃度下可促進了軟骨細胞的體外增殖和活力,但在400 μg/mL下可抑制軟骨細胞的增殖和活力。

2.3 丹參活性成分通過提高轉化生長因子β1 (transforming growth factor β1,TGF-β1)的活性以減輕軟骨的病理改變

TGF-β1參與軟骨的形成,可維持軟骨細胞的功能,抑制MMP的活性,丹參活性成分可通過促進TGF-β1的分泌促進和維持軟骨細胞的功能[14]。與模型組相比,10 mg/kg的丹酚酸A治療前交叉韌帶橫斷術建立的骨關節炎大鼠4周后,能促使大鼠軟骨組織中TGF-β1的表達,顯著提高p-Smad2/Smad2的水平,有效減輕骨關節炎的軟骨組織損傷[17]。前交叉韌帶橫斷和內側半月板切除術建立的骨關節炎大鼠模型,可導致軟骨細胞中TGF-β1、骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)的表達顯著,運用0.5 mg/kg的丹參酮IIA可促使軟骨細胞中TGF-β1、BMP-2的表達,進而促進成軟骨細胞的增殖和分化,促進軟骨的形成[14]。

3 丹參活性成分通過抑制軟骨細胞凋亡延緩骨關節炎的進展

過度的細胞凋亡能導致軟骨細胞減少,關節軟骨結構和功能受到影響,丹參活性成分可通過抑制細胞凋亡對軟骨發揮保護作用[18]。展嘉文等[18]運用丹酚酸A治療持續加壓建立的腰椎小關節骨關節炎兔的實驗,與模型組相比,腹腔注射40 mg/kg的丹酚酸A可顯著降低軟骨細胞凋亡率(P<0.05),還可顯著降低TNF-α、IL-1β、IL-6的表達,減輕軟骨組織的病理改變。丹參活性成分通過調節凋亡相關蛋白的分泌,抑制IL-1β誘導的細胞凋亡,阻斷JAK2/STAT3信號通路,抑制軟骨細胞凋亡,以減輕軟骨組織損傷,發揮抗骨性關節炎的作用。

3.1 丹參活性成分通過調節凋亡相關蛋白的分泌抑制細胞凋亡

一項丹參注射液用于兔軟骨細胞的體外實驗中,給予0～400 μg/L的丹參注射液按照梯度時間法進行干預,各梯度的丹參注射液均可顯著提高軟骨細胞的活性,顯著提高軟骨細胞的增殖效率,并在100 μg/L時兔軟骨細胞可獲得最大的活性,誘導凋亡第3代細胞經丹參注射液處理后,Bcl-2相關X蛋白(BCL2-Associated X,Bax)基因表達明顯降低,B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)基因表達明顯升高,結果證實,丹參注射液能通過調節凋亡相關蛋白抑制線粒體凋亡通路活性[19]。

3.2 丹參活性成分通過抑制IL-1β誘導的細胞凋亡發揮抗凋亡活性

IL-1β可通過增加Bax和半胱天冬酶3的水平誘導軟骨細胞凋亡。丹參可通過抑制IL-β的分泌以發揮抗細胞凋亡活性[6,11]。Wu YF等[6]為檢驗丹參酸A抑制IL-1β誘導的小鼠軟骨細胞凋亡的實驗結果顯示,小鼠軟骨細胞經10 ng/mL的IL-1β刺激后,Bax和裂解的半胱天冬酶-3的表達明顯提高,Bcl-2的表達明顯受到抑制,小鼠軟骨細胞的數量顯著提高,經6.25、12.5、25 μmol/L的丹參酸A處理后,Bax和裂解的半胱天冬酶-3的表達顯著降低,Bcl-2顯著提高,以濃度依賴性逆轉了凋亡相關蛋白的表達,顯著降低了軟骨細胞的凋亡。一項體外研究證實,10 ng/mL的IL-1β可促使軟骨細胞系CHON-001細胞凋亡,經20 μmol/L的丹參酮I處理后,丹參酮I逆轉了IL-1β誘導的細胞凋亡,CHON-001的凋亡率顯著降低[11]。

3.3 丹參活性成分通過阻斷Janus 激酶2(Janus kinase 2,JAK2)/轉錄信號傳感器和激活劑3(Transcription signal sensors and activators 3,STAT3)信號通路抑制軟骨細胞凋亡

JAK2/STAT3信號通路參與調節軟骨細胞自噬和凋亡,丹參活性成分可通過調節該通路阻止細胞凋亡[20-21]。棕櫚酸能促進軟骨細胞中p-JAK2、p-STAT3水平的升高,分別給予JSI-124(JAK2/STAT3抑制劑)、丹參酸B進行干預,二者均能降低p-JAK2、p-STAT3的水平,同時能提高LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1的水平,提示,丹參酸B能通過抑制JAK2/STAT3信號通路,增強軟骨細胞自噬,以阻止細胞凋亡進程,延緩骨關節炎的進程[20]。Xu XL等[21]通過手術建立實驗性骨關節炎兔模型,分別給予1.05 g/d丹參注射液、0.4 mL/d透明質酸鈉、生理鹽水連續治療5周,與假手術相比,實驗性骨關節炎兔模型組的p-JAK2和p-STAT3水平的表達顯著提高,丹參注射液組和透明質酸鈉組均使p-JAK2和p-STAT3水平顯著下降,顯著抑制軟骨細胞凋亡,為進一步驗證丹參對JAK2/STAT3的作用,同時給予AG490(JAK2/STAT3促進劑)進行干預,結果AG490消除了丹參對JAK2/STAT3的抑制作用,結果證實丹參注射液可通過阻斷JAK2/STAT3信號通路,抑制軟骨細胞凋亡,延緩軟骨退變進程。

4 丹參活性成分調節非編碼RNA的分泌以延緩骨關節炎的進展

丹參活性成分通過調節KCNQ1重疊轉錄物1(KCNQ1 overlapping transcript 1,KCNQ1OT1)、miR-155、miR-106a-5p、miR-574-5p的分泌以延緩骨關節炎的進展。

4.1 丹參活性成分通過調節KCNQ1OT1延緩骨關節炎發展

KCNQ1重疊轉錄物1(KCNQ1 overlapping transcript 1,KCNQ1OT1)屬于長非編碼RNA,在骨關節軟骨細胞中表達下調,丹參酸B可通過調節KCNQ1OT1的分泌發揮抗骨關節炎的作用[20]。

Sun TW等[20]通過前交叉韌帶橫斷和內側半月板切除術建立骨關節炎小鼠,并給予高脂肪飲食喂養建立肥胖相關骨關節炎小鼠模型,給予25 mg/kg的丹參酸B腹腔注射持續治療10周,與空白對照組相關,丹參酸B顯著降低了小鼠的體重,提高了軟骨細胞中KCNQ1OT1的表達,降低了TNF-α、IL-6和PGE2的水平,對miR-128-3p發揮負調控作用,提高了SIRT1的表達,顯著降低了小鼠軟骨細胞的凋亡,激活軟骨細胞自噬,而過表達的miR-128-3p和低表達的SIRT1能進一步加重小鼠軟骨細胞的炎癥反應、細胞凋亡,結果提示,丹參酸B能靶向調節KCNQ1OT1的分泌,通過miR-128-3p/SIRT1信號通路調節軟骨細胞自噬,減輕炎癥反應和抑制細胞凋亡,以延緩肥胖相關骨關節炎的進展。

4.2 丹參活性成分通過調節多種miRNA的分泌延緩骨關節炎進展

微小核糖核酸(MicroRNA,miRNA)是維持軟骨穩態的關鍵調節劑,miR-155、miR-106a-5p等多種miRNA參與骨關節炎的發生與發展,丹參活性成分可通過調節miR-155、miR-106a的表達發揮抗抗骨關節炎作用[22-25]。

Zhou B等[22]將丹參酮ⅡA干預脂多糖刺激人原代關節軟骨細胞的實驗發現,脂多糖能促使人原代關節軟骨細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6等多種炎癥因子的分泌,促進軟骨細胞中miR-155-5p的低表達及叉頭框蛋白O3(Forkhead box O3,FOXO3)高表達,進一步促進細胞凋亡,1、10、100 μmol/L的丹參酮ⅡA干預后,逆轉了炎癥因子的高表達,通過上調miR-155-5p的表達和抑制FOXO3的表達,通過轉染miR-155證明了,丹參酮ⅡA可直接作用于miR-155/FOXO3發揮抗炎和抑制細胞凋亡的作用。一項關于丹參酮ⅡA干預聚乙烯誘導骨溶解大鼠的實驗中,30 mg/kg的丹參酮ⅡA顯著降低骨溶解的病理改變,抑制血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌,誘導的miR-155-5p水平并抑制FOXO3表達,有助于改善骨保護素(osteoprotegerin,OPG)和破骨細胞分化因子(receptor acti-vator nuclearfactor kappa B ligand,RANKL)的平衡,恢復成骨細胞的數量和活力,發揮抗骨溶解作用[23]。

Ji QB等[24]將隱丹參酮用于人膝骨性關節炎軟骨細胞的實驗發現,10 μmol/L的隱丹參酮能以時間依賴性方式促進miR-106a-5p在人軟骨細胞中的表達,miR-106a-5p可減輕骨性關節炎中軟骨的損傷,使用靶標預測程序研究發現, miR-106a-5p能直接靶向下調人軟骨細胞中的GLI家族鋅指蛋白3(GLI-similar 3,GLIS3)的過表達,配對盒基因5(paired box gene 5,PAX5)可能是隱丹參酮調節miR-106a-5p啟動子活性的轉錄因子,miR-106a-5p與 PAX5 表達呈正相關,與 GLIS3 表達呈負相關,結果證實隱丹參酮可能通過調節AX5/miR-106a-5p/GLIS3軸的活性,發揮防治骨性關節炎的作用。

Yue ST等[25]基于微陣列數據集GSE93008篩選顯示,miR-574-5p在骨關節炎的變化最為顯著,給予IL-1β刺激后能促使miR-574-5p的表達明顯升高,YAF2受到抑制,miR-574-5p能調節YAF2的分泌,經10 mg/kg的隱丹參酮處理后,miR-574-5p的表達受到明顯抑制,進一步促進YAF2的表達,進而抑制骨關節炎的軟骨細胞凋亡。

5 結語

骨關節炎的病理機制復雜,多種病理學改變相互影響,中藥在骨關節炎防治中的多靶點、價廉效優、安全性高等特點越來越受到廣大學者的關注[26]。本研究綜述了近7年的相關研究報道,從炎癥反應、軟骨降解、細胞凋亡、非編碼RNA四個方面探討丹參活性成分防治骨關節炎的作用機制。目前丹參用于骨關節炎的研究大部分停留于基礎實驗,在人體的療效及作用機制尚不明確。丹參的活性成分復雜用于骨關節炎的作用存在不同作用機制,各成分間的相互作用尚未可知。丹參在人體的使用可造成不同程度的不良反應,在防治骨關節炎的最低有效濃度及毒效關系仍需進一步研究確認。望后續的研究者開展丹參治療骨關節炎的多中心、多樣本的臨床研究,為明確丹參在臨床的作用機制及安全性提供可靠數據。