基于PI3K/AKT信號通路探討琥珀散對子宮內膜異位癥小鼠的影響及作用機制研究

孫新慧 郭亞楠 霍超越 林陶秀 ROBERTS SONG ZE 張文娟 何甜甜 張晨 賽佳洋 馬小娜

子宮內膜異位癥(endometriosis,EMs),簡稱內異癥,是指具有活性的子宮內膜組織(間質和腺體)出現在子宮腔被覆內膜及宮體肌層以外的部位[1]。是臨床中引起女性痛經、盆腔痛及不孕的主要原因之一。EMs的發病率為15%～20%,并且呈逐漸升高的趨勢[2]。其歸屬于中醫“痛經”“癥瘕”“月經過多”“不孕”等范疇[3]。

琥珀散出自《普濟本事方》,又稱“本事琥珀散”,原方由三棱、莪術、當歸、赤芍、熟地黃、劉寄奴、丹皮、肉桂、菊花、蒲黃組成,另有去菊花、蒲黃,而用烏藥、延胡索者,全方具有行氣活血、溫經止痛之功效,臨床可作為治療寒凝血瘀型EMs的有效方[4]。課題組前期的臨床研究表明,琥珀散治療子宮內膜異位癥療效確切[5]。前期實驗研究表明琥珀散可降低內膜組織中的免疫因子(T helper cells,Th)1/Th2,降低基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和組織基質金屬蛋白酶抑制劑-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2,TIMP-2)的含量、改善局部微環境,抑制內膜細胞的粘附、侵襲、血管生成,以起到干預內異癥的作用[6-9]。此外,有研究顯示,在EMs模型中,異位的內膜磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)信號通路被激活,從而使得血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達得以增強,并且促進異位內膜的浸潤及種植,推進EMs的發生和發展[10]。并且,我們通過網絡藥理學發現琥珀散治療子宮內膜異位癥與PI3K/AKT信號通路密切相關[11]。因此,本實驗主要研究琥珀散是否通過影響該信號通路而發揮對EMs的多靶點調控作用,為中醫藥防治EMs提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗環境

選擇無特定病原體(specificpathogenfree,SPF)級,6～8周齡的雌性BALB/c小鼠60只,體質量18～22 g,性周期4～5天。購于京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證編號:SCXK(京)2016-0006。飼養于北京中醫藥大學動物實驗室。條件:室內溫度設定在20℃,濕度設定為60%,清潔度Ⅱ級,常規適應性飼養1周。方案經北京中醫藥大學動物倫理委員會批準,倫理審批號:BUCM-4-2021021501-1098。

1.2 實驗藥物

中藥琥珀散配方顆粒(三棱10 g、莪術10 g、赤芍15 g、劉寄奴10 g、牡丹皮10 g、肉桂6 g、當歸10 g、熟地黃15 g、延胡索12 g、烏藥15 g)購自北京中醫藥大學第三附屬醫院顆粒藥房,由北京康仁堂藥業有限公司提供,配成溶液(1 mL藥液中約含1.6 g生藥),4℃冰箱存用;西藥將PI3K激酶抑制劑(LY294002,商品編號:A8250-50 mg),溶于二甲基亞砜(DMSO,商品編號:D2650-100 mL)中備用。

1.3 主要實驗試劑與儀器

0.9%氯化鈉溶液,碘伏,蘇木素染液,伊紅染液,4%多聚甲醛,二甲基亞砜(DMSO,商品編號:D2650-100 mL)、PI3K激酶抑制劑(LY294002,商品編號:A8250-50 mg),ELISA試劑盒:小鼠絲裂原激活蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)ELISA試劑盒(商品編號:MB-6481A)、小鼠血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)ELISA試劑盒(商品編號:MB-6044A)、小鼠腫瘤蛋白p53(TP53)ELISA試劑盒(商品編號:MB-6476A)、小鼠RACa絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶B1(serine/threonine protein kinase 1,AKT1)ELISA試劑盒(商品編號:MB-6473A),由北京百諾威生物科技有限公司提供。免疫組化抗體:Anti-pan-AKT抗體(貨號:60203-2-Ig),Anti-PI3Kinase p85 beta抗體(貨號:67644-1-Ig),由北京百諾威生物科技有限公司提供。

病理切片機(德國徠卡公司,型號RM2235),組織攤片機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司,型號KD-P),凍臺(武漢俊杰電子有限公司,型號JB-L7),烤片機(常州國華電器有限公司,型號DB-B2),烤箱[邦西儀器科技(上海)有限公司,型號101-1BS],倒置顯微鏡(日本尼康,型號Nikon Ci-S)。

1.4 建立小鼠模型

脫頸椎法處死捐贈BALB/c小鼠,將小鼠仰臥位固定于手術臺,用酒精將腹部消毒后,沿小鼠腹部正中線剖開腹腔,完整將其子宮取出,將子宮的漿肌層及其周圍的脂肪組織剔除,放入裝有10 mL的37℃生理鹽水的培養皿中,漂洗表面的血跡、漿肌層和脂肪碎屑后,將子宮一分為二,將兩個子宮角分別放入培養皿中,將其直接剪碎成約1 mm3大小的小碎片,并將此小碎片溶于1 mL的37℃生理鹽水中。酒精消毒接受鼠腹部后,于臍下0.5 cm偏正中線0.5 cm處的左下腹為進針點,將溶有子宮內膜碎片的1 mL生理鹽水注入接受鼠的腹腔。手術全程在無菌條件下進行,全程操作在5分鐘內完成[12]。造模后3周后將40只小鼠隨機分成4組,在各組中隨機挑選3只開腹觀察異位病灶的位置、形態等情況。

1.5 動物分組及給藥

將60只BALB/c小鼠隨機分為捐贈鼠20只,實驗鼠40只,再將40只實驗鼠隨機分為正常組、疾病模型組、琥珀散組、西藥組,每組10只。琥珀散組按成人臨床用藥量等效量的2倍給予14.3 g/kg灌胃,連續給藥4周;西藥組將LY294002溶于DMSO后腹腔注射,以0.04 g/kg進行計算,每周腹腔注射一次,給藥4周[13];正常組、模型組給予相同體積的生理鹽水灌胃,連續給藥4周。待灌胃結束后,由于小鼠存在個體差異、耐受性差等原因,取材時正常組小鼠余7只,疾病模型組小鼠余7只,琥珀散組小鼠余7只,西藥組小鼠余6只。

1.6 取材及實驗檢測

在給藥結束后的第2天進行實驗取材。各組小鼠眼球后取血,3 000 r/min離心15分鐘,取上層血清裝入PE管,-80℃冰箱凍存。各組小鼠采用脊椎脫臼法處死后,開腹探查異位病灶生長情況,正常組取子宮,其余各小鼠取在位子宮內膜和異位病灶,各組組織標本分割后置入4%多聚甲醛中保存。

1.6.1 各組小鼠異位病灶觀察 (1)異位病灶大體形態學比較:觀察異位病灶形態并用游標卡尺測量異位病灶體積(長×寬×高,單位:mm3)并進行稱重比較。(2)蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色觀察在位及異位內膜組織病理學變化:取多聚甲醛固定的在位或異位內膜組織常規包埋,切片,HE染色后使用中性樹膠封片,置于光學顯微鏡下觀察、記錄并拍照。

1.6.2 ELISA法檢測各組小鼠血清TP53、AKT1、VEGF-A和MAPK3水平變化 參考ELISA試劑盒操作流程:以標準物的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,計算出標準曲線的直線回歸方程式,計算樣品濃度,乘以稀釋倍數后即可得實際樣品濃度。

1.6.3 免疫組化法檢測各組小鼠內膜組織中PI3K、AKT的表達 待實驗結束后,每組隨機選取5只小鼠進行免疫組化檢測,經固定、脫水、透明、石蠟包埋后,做5 μm連續切片,操作及染色步驟均嚴格按照免疫組化檢測試劑盒說明書進行。采用病理圖像分析儀對切片進行拍照,在相同視野下對每張切片隨機選取5個高倍鏡視野,然后利用IPP軟件進行免疫組化吸光度表達分析,測定內膜組織中PI3K、AKT的表達。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 各組異位EMs小鼠異位病灶觀察

EMs主要病理性增殖的外在表現為異位病灶的生長及體積的變化。造模后的第21天,于各組中隨機挑選 3 只子宮內膜異位癥模型小鼠開腹觀察,除正常組以外,其余各組均見移植物生長,造模成功率為100%。大體觀察可見模型組的異位病灶體積明顯增大,重量增加,異位病灶呈單個或多房樣葡萄,大多數為透明樣,內含大量透明或淡黃色清亮液體,質地柔軟,囊泡表面覆蓋著豐富的血管網,與周圍組織粘連明顯。與模型組相比,各治療組異位病灶的體積減小、重量減少、內含液體減少、血管形成不明顯、粘連情況也較少。見圖1。

注:A為疾病模型組,B為西藥組,C為琥珀散組。

2.2 各組小鼠內膜組織病理形態學變化

正常組小鼠子宮內膜結構完整、上皮細胞呈長柱狀排列、整齊連續,多數為間質細胞,含有豐富的腺體和血管;疾病模型組小鼠可見異位內膜上皮細胞以低柱狀細胞或立方狀細胞為主,呈環形或鋸齒狀生長,部分區域內膜也可呈乳頭狀生長,且有炎性細胞的浸潤,其間質層可見血管豐富,腺體數量減少,甚至消失,肌層結構不清晰。西藥組和琥珀散組的異位內膜均可見不同程度的上皮細胞變薄,多為扁平狀或低立方狀,呈現出萎縮性改變,部分異位內膜腺上皮明顯被破壞甚至消失。見圖2。

注:A為正常組子宮內膜,B為疾病模型組異位灶,C為西藥組異位灶,D為琥珀散組異位灶。

2.3 各組小鼠血清TP53、AKT1、VEGF-A和MAPK3的含量

與正常組相比,疾病模型組小鼠血清TP53、AKT1、VEGF-A和MAPK3的含量均顯著升高(P<0.01),琥珀散組、西藥組血清TP53、AKT1、VEGF-A和MAPK3的含量無明顯差異(P>0.05);與疾病模型組相比,琥珀散組、西藥組小鼠血清TP53、AKT1、VEGF-A和MAPK3的含量顯著降低(P<0.01);與琥珀散組相比,西藥組小鼠血清TP53、AKT1、VEGF-A和MAPK3的含量無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血清TP53、AKT1、VEGF-A和MAPK3的含量

2.4 各組小鼠在位內膜組織PI3K、AKT免疫組織化學染色結果

2.4.1 各組小鼠在位內膜組織PI3K表達比較 PI3K陽性顆粒呈棕黃色,主要表達在子宮內膜、腺腔細胞核及胞漿中,少量表達在周圍間質細胞中。與正常組相比,疾病模型組在位子宮內膜組織PI3K的蛋白含量表達無明顯差異(P>0.05);琥珀散組、西藥組小鼠在位子宮內膜組織PI3K、的蛋白含量表達無明顯差異(P>0.05);與疾病模型組相比,琥珀散組、西藥組小鼠在位子宮內膜組織PI3K的蛋白含量表達無明顯差異(P>0.05)。結果見表2、圖3。

表2 各組小鼠在位內膜組織PI3K、AKT的表達

注:A為正常組;B為疾病模型組;C為西藥組;D為琥珀散組。

2.4.2 各組小鼠在位內膜組織AKT表達比較 AKT陽性顆粒呈棕黃色,主要表達在子宮內膜、腺腔細胞核及胞漿中,少量表達在周圍間質細胞中。與正常組相比,疾病模型組在位子宮內膜組織AKT的蛋白含量表達無明顯差異(P>0.05);琥珀散組、西藥組在位子宮內膜組織AKT的蛋白含量表達無明顯差異(P>0.05);與疾病模型組相比,琥珀散組、西藥組在位子宮內膜組織AKT的蛋白含量表達無明顯差異(P>0.05)。結果見表2、圖4。

注:A為正常組,B為疾病模型組,C為西藥組,D為琥珀散組。

2.5 琥珀散對EMs小鼠在位、異位子宮內膜組織PI3K、AKT表達的影響

2.5.1 各組小鼠在位、異位內膜組織PI3K表達比較 PI3K陽性顆粒呈棕黃色,主要表達在子宮內膜、腺腔細胞核及胞漿中,少量表達在周圍間質細胞中。與正常組相比,疾病模型組異位子宮內膜組織PI3K的蛋白含量表達顯著升高(P<0.01);西藥組異位子宮內膜組織PI3K的蛋白含量表達無明顯差異(P>0.05);琥珀散組異位子宮內膜組織PI3K的蛋白含量表達顯著降低(P<0.01)。與疾病模型組相比,琥珀散組、西藥組異位子宮內膜組織PI3K的蛋白含量表達顯著降低(P<0.01);琥珀散組較西藥組異位內膜PI3K表達顯著降低(P<0.05)。結果見表3、圖5。

表3 各組小鼠在位、異位內膜組織PI3K、AKT的表達

注:A為正常組,B為疾病模型組,C為西藥組,D為琥珀散組。

2.5.2 各組小鼠在位、異位內膜組織AKT表達比較 AKT陽性顆粒呈棕黃色,主要表達在子宮內膜、腺腔細胞核及胞漿中,少量表達在周圍間質細胞中。與正常組相比,疾病模型組異位子宮內膜組織AKT的蛋白含量表達顯著升高(P<0.05);西藥組、琥珀散組異位子宮內膜組織AKT的蛋白含量表達無明顯差異(P>0.05)。與疾病模型組相比,琥珀散組、西藥組異位子宮內膜組織AKT的蛋白含量表達顯著降低(P<0.01)。結果見表3、圖6。

注: A為正常組,B為疾病模型組,C為西藥組,D為琥珀散組。

3 討論

中醫學認為,EMs是以“正氣不足”為內因,“血瘀”為外在表現的一種疾病,“瘀血”貫穿發病的始終,是其主要病理實質[14]。瘀阻胞宮,不通則痛,發為痛經;瘀阻胞絡,兩精不能相合,遂成不孕;瘀血日久不去,積聚腹中,固定成型,則為癥瘕[15]?；贓Ms“寒凝血瘀成癥”的中醫病機,課題組認為對本病的治療應消癥散結的同時應注意調補正氣,以活血化瘀、消癥散結為主,輔以疏肝解郁、溫經散寒、養血益氣等,如此才能使血瘀得化,寒熱平調,邪去正復。

琥珀散是本課題組臨床治療EMs的常用方劑,方中三棱、莪術破血散結;官桂、烏藥溫里散寒,行氣止痛;赤芍、當歸、熟地、丹皮、延胡索養血活血,通經止痛;劉寄奴味苦性溫,可破瘀除癥、活血通經、消癰散結。諸藥相和,共奏溫里散寒、破瘀消癥之效[11]?，F代藥理研究表明,EMs的病理過程與免疫炎癥、氧化應激、自噬、凋亡和血管生成密切相關[16]。有研究表明,三棱具有造血功能,抗炎活性和免疫學特性[17];作為赤芍的主要藥理學成分的黃芩苷可通過核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)途徑抑制人子宮內膜基質細胞的活力治療EMs,還可顯著增加G0/G1期的細胞數量,顯著減少S和G2/M期的細胞數量[18-19]。本實驗基于課題組的前期研究基礎,主要研究琥珀散是否通過影響AKT1、TP53、VEGF-A、MAPK3細胞因子、PI3K/AKT信號通路而發揮對EMs的多靶點調控作用。

近年來有研究發現,AKT為PI3K下游的主要信號分子,亦是PI3K/AKT通路下游的重要的靶激酶,能夠被PI3K誘導磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylated-AKT,P-AKT)而被激活,P-AKT誘導核因子E2相關因子2(nuclear factory erythroid-2 related,Nrf2)與Kelch樣ECH關聯蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein,Keap1)解離并促進Nrf2核轉位,然后與抗氧化響應元件(Antioxidant response element,ARE)結合而誘導抗氧化酶(SOD、CAT等)和血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)轉錄表達,進而抑制氧化應激反應和線粒體損傷[20],在調節細胞生長,增殖,抗凋亡,細胞侵襲和轉移方面起重要作用[21]。TP53可明顯調控細胞周期,與EMs有密切的相關性[22-23]。MAPK家族和其下游信號通路在調控細胞有絲分裂、遷移、代謝、粘附、侵襲、雌激素表達、細胞凋亡抑制、炎癥和血管生成中具有重要地位,尤其在EMs的侵襲和轉移中發揮中介和信號放大的作用,因此MAPK1和MAPK3亦是本事琥珀散的重要的干預靶點[24-25]。此外,有研究表明,PI3K/AKT途徑是一種密切參與到細胞增殖、運動、凋亡、代謝和免疫應答調節的信號通路[26-27],與腫瘤的發生發展密切相關[28]。同時,亦有研究表明,EMs雖是良性婦科疾病,但其特點與惡性腫瘤的轉移侵襲能力相似,子宮內膜間質細胞的活性隨著AKT的活化而增強,隨著AKT的抑制而減弱[29],而PI3K途徑的激活可誘導血管內皮細胞生長,加速EMs的發展進程[30]。

本實驗采用同種異體移植中腹腔注射法造模,操作簡單,少有出血、感染死亡,有利于維持病灶組織形態和各類生化指標,使實驗結果更有臨床意義[31]。實驗研究發現:疾病模型組血清TP53、AKT1、VEGF-A和MAPK3的含量的表達較正常組相比,均顯著升高,可能與細胞周期的調控有關[22-23],琥珀散組、西藥組血清TP53、AKT1、VEGF-A和MAPK3的含量表達與正常組相比無明顯差異;琥珀散組、西藥組血清TP53,AKT1,VEGF-A和MAPK3的含量與疾病模型組相比顯著降低,這可能與誘導血管內皮細胞增長[32]、激活細胞外信號調節激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)1和ERK2,調節TSC2磷酸化[33],進而調控細胞的粘附、侵襲、轉移相關[24]。此外,疾病模型組異位內膜組織PI3K、AKT的蛋白含量表達較正常組相比均顯著升高,琥珀散組、西藥組異位內膜組織PI3K、AKT的蛋白含量與疾病模型組相比,表達顯著降低。亦有研究表明,抑制PI3K/AKT信號通路活性可能對EMs有抑制作用[34],這與本實驗的研究結果相一致。

綜上所述,琥珀散可下調TP53、AKT1、VEGF-A和MAPK3的表達,抑制PI3K/AKT信號通路,作用于細胞增殖、凋亡等過程,而發揮對EMs的多靶點調控作用。