白術對復發性流產小鼠母胎界面輔助性T細胞及調節性T細胞的影響

余甜 楊小頎 馬曉軍 胥冰

復發性流產(recurrent spontaneous abortion,RSA)在我國是指與同一性伴侶連續發生3次及以上的自然流產(流產發生于產婦孕28周前,且胎兒體重小于1 000 g)[1]。RSA病因復雜,且有半數以上的患者病因不明[2]。輔助性T細胞17(T helper cell 17,Th17)所分泌的白細胞介素17A(interleukin-17A,IL-17A)和調節性T細胞(regulatorycells,Treg)分泌的轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)共同參與調節母胎界面免疫耐受狀態的形成和維護[3],是RAS免疫致病因素中的重要影響因果。中藥白術可影響體內免疫調節[4-6],中醫學認為血氣足以養胎,而脾為氣血生化之源,中藥白術為健脾良藥[7]。故筆者從中醫學角度推測白術可能通過健脾固攝、療養氣血安胎,并通過免疫學方法觀察RSA模型小鼠母胎界面的免疫狀態,深入研究白術對異常妊娠免疫的恢復和維持作用,從而佐證中藥白術“健脾安胎”的理論。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取40只處于8周齡的清潔級CBA/J雌性小鼠、16只DBA/2雄性小鼠和4只BALB/C雄性小鼠作為實驗模型動物,三種小鼠均購于南京卡文斯生物技術有限公司(由上海市計劃生育科學研究所實驗動物經營部培育出售)。許可證號碼:SCXK(滬)2018-0006。

1.2 主要藥品及試劑

中藥白術提取物購自西安德生元,7∶1水提;IL-17A及TGF-β1 ELISA試劑盒(上海艾萊薩,批號:EIA-2223;EIA-2747);兔抗小鼠CD4及大鼠抗小鼠FOXP3(Servicebio,批號:GB13064-2;GB13445);兔抗小鼠RORγt(Bioss,批號:BS-23110R)。

1.3 動物建模及分組給藥

雌性CBA/J與雄性DBA/2小鼠按照2∶1比例合籠為復發性流產模型;雌性CBA/J與雄性BALB/C小鼠按照2∶1比例合籠為正常妊娠模型。10～12小時后檢查,見陰道栓的CBA/J則直接判定為成功懷孕,未見陰道栓者取陰道分泌物進行染色鏡檢,見精子者與前者同判定為孕0天。后將受孕小鼠分為正常妊娠組、流產模型組及白術低劑量組、白術中劑量組、白術高劑量組,每組8只。白術灌胃量根據公式計算如下。見表1。

1.4 取材及指標檢測

1.4.1 小鼠大體組織的觀察及計算 各組雌鼠于孕14天行最后一次灌胃后處死小鼠(頸椎脫臼),觀察陰道口是否出血。解剖暴露子宮后按照公式計算各組流產情況及胚胎吸收比例。右側子宮組織加入對應量的苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)(0.75 μg/mg,6倍于組織重量)后冷凍勻漿(4℃、2 000 rpm、20分鐘),用于ELISA法因子含量測定;左側子宮置入4%組織固定液中固定10小時,然后轉入70%酒精中保存,用于石蠟包埋及切片染色。

1.4.2 HE染色對組織切片進行病理觀察 將組織放入自動脫水機中梯度脫水,后放于2組二甲苯中各30分鐘,再轉入65°石蠟2小時,冷卻后設定4 μm為厚度進行切片。染色:經二甲苯20分鐘浸泡兩組后,轉入無水乙醇中浸泡5分鐘,重復2組,再轉入95%乙醇、90%乙醇和85%乙醇中各1分鐘;蘇木素3分鐘,自來水沖洗1分鐘,經分化液處理20秒后再次用自來水沖洗1分鐘,再經返藍30秒后自來水沖洗。85%乙醇和95%乙醇各5分鐘浸泡,再用伊紅染液染色5分鐘,自來水沖洗雜余染料后無水乙醇浸泡5分鐘,重復3組,二甲苯浸泡5分鐘,重復2組,最終使用中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。

1.4.3 ELISA法測定 按照試劑套盒說明書,檢測小鼠子宮組織中IL-17A和TGF-β1細胞因子表達,操作完成后用酶標儀于450 nm波長處讀取吸光度(optical density,OD)值,計算標準曲線公式,以獲得對應細胞因子的含量。

1.4.4 免疫熒光雙染法檢測子宮組織內Th17和Treg細胞 取石蠟切片脫蠟后送入微波爐行抗原修復,后畫圈封閉,孵育30分鐘。兩種細胞均先進行CD4染色,經一抗、二抗、FITC后,加熱封閉。Th17細胞進行FOXP3核抗體染色,Treg細胞進行RORγt染色。后將自發熒光淬滅5分鐘,沖洗,行DAPI染色。最后用PBS脫色,封片,使用熒光顯微鏡觀察并采集圖像,借助于圖像處理軟件Image J軟件將原圖片轉為灰度圖片,定量分析各圖像中熒光信號強度,計算平均熒光強度。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 各組孕鼠大體組織觀察與流產情況計算結果

各組孕鼠解剖后正常妊娠組的子宮胚胎完整連續,大小一致,排列緊密,串如橢圓珍珠,整體色澤紅潤,透過子宮壁可見深色胎盤緊貼子宮內壁。復發性流產組流產征象明顯,子宮體積減小,見部分胚胎明顯小于正常妊娠組,呈黑色或深血色,子宮整體顏色偏深呈淤血色,陰道口有不同程度出血。白術低、中、高劑量治療組中被吸收的胚胎情況較復發性流產組有所緩解,胚胎流失較少,胚胎大小及發育情況較為正常。

經公式計算后得出復發性流產組流產率顯著高于其他各組,白術給藥各組流產率較復發性流產組有所降低。復發性流產組胚胎吸收率明顯高于正常組(P<0.05);白術低、中劑量組胚胎吸收率均低于復發性流產組(P<0.05),而白術高劑量組與復發性流產組相比較差異不具統計學意義(P>0.05),卻較正常妊娠組顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各處理組流產及胚胎吸收結果(鼠只=8)

2.2 各組孕鼠子宮組織HE染色光鏡觀察結果

下圖中1A為正常妊娠組子宮,見內膜增厚且連續,形態結構完整正常,蛻膜細胞增多、排列規則正常,妊娠蛻膜化明顯,子宮腺體及血管清晰可見,未見異常炎性細胞。圖1B為復發性流產組子宮,見變薄斷裂脫落的子宮內膜,蛻膜化程度低,蛻膜細胞數量少,排列雜亂模糊,有明顯的壞死,可見血管異常出血。圖1C1、C2、C3分別為白術低、中、高劑量治療組子宮圖片,與正常妊娠蛻膜化表現相似,圖1C1可見排列整齊的蛻膜細胞,圖1C2見蛻膜化和腺體增生同時存在、子宮內膜呈給藥后的分泌反應,圖1C3可見蛻膜與炎性細胞浸潤,表明白術治療組小鼠較正常小鼠仍存在一定程度的流產征象。

注:A為正常妊娠模型組,B為復發性流產模型組,C1為白術低劑量組,C2為白術中劑量組,C3為白術高劑量組。

2.3 各組孕鼠子宮組織中IL-17A、TGF-β1含量的比較

發性流產組子宮組織中的IL-17A含量明顯高于正常妊娠組,差異有統計學意義(P<0.01)。白術給藥各劑量組與復發性流產組的IL-17A含量相比,前者均顯著低于后者(P<0.01);其中白術低劑量組與白術高劑量組組間無差異(P>0.05),但均顯著高于白術中劑量組(P<0.05)。復發性流產組中TGF-β1的含量與正常妊娠組相比較低(P<0.01)。白術低、中劑量組子宮組織中的TGF-β1含量高于復發性流產組,差異極明顯(P<0.01),白術中劑量組的TGF-β1含量雖高于白術低劑量組與白術高劑量組,但各劑量組組間差異較小,不具有統計學意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠子宮組織中IL-17A及TGF-β1的含量鼠只=8)

2.4 各組孕鼠子宮組織中Th17、Treg細胞熒光定量比較分析

熒光強度定量平均值比較中復發性流產組RORγt的熒光強度高于正常妊娠組(P<0.05)及白術各給藥組(P<0.05),白術低劑量組和高劑量組顯著高于中劑量組(P<0.05),但兩組間無統計學差異(P>0.05);復發性流產組FOXP3熒光強度顯著低于正常妊娠組(P<0.05),白術各給藥組中高劑量組熒光強度雖高于復發性流產組,但無統計學意義(P>0.05);三種治療劑量組相比較,白術中劑量組的免疫熒光強度為其中最高,且高劑量組與中劑量組間差異明顯(P<0.05。詳見表4。

表4 各組中子宮組織中RORγt和FOXP3免疫熒光平均光密度值鼠只=8)

3 討論

復發性流產的患者通常在孕早、中期即會發生胚胎丟失的現象[8],其中包括早期因種植失敗發生的生化妊娠。盡管現調查顯示在妊娠婦女已至少有1%～5%會診斷為該疾病,但由于生化妊娠及人文等因素的存在,患病率可能遠不止如此。本實驗采用國際公認的自然流產小鼠模型CBA/J雌鼠×DBA/2雄鼠,胚胎吸收率可達36.49%[9-10]。本實驗中RSA流產模型組流產小鼠所占百分比達62.5%(5/8),胚胎吸收率為34.6%(18/52),均顯著高于正常妊娠組,且符合當前文獻調查結果范圍。本實驗中白術中等劑量灌胃液根據人的臨床常用白術劑量經公式轉化而來,在三組中胚胎吸收率最低(10.5%,6/57),且相對流產模型組具有顯著改善。說明中等劑量白術對復發性流產的治療具有積極的改善作用,可能于胚胎種植開始抵抗小鼠先天流產傾向。

中藥白術具有健脾功效,自古被稱為“安胎妙藥”,可從“健脾固攝,補氣安胎”的角度治療“滑胎”“數墮胎”[11]。《中華人民共和國藥典》(2020版)指明白術具有胎兒保護作用,尤其在調節平滑肌收縮方面已然得到了實驗數據證明[12]。中醫治療RSA依照“預培其損,辨證論治”原則進行。多項基于中醫傳承平臺的數據挖掘中顯示[13-14],無論在中醫藥古籍記載明方或是現代醫者用方中,白術均排在“RSA用藥頻次表”前列,可見白術在中醫藥治療RSA中的重要性和實用性。經過本次實驗證明,白術單藥給藥后各組與流產模型相比均降低了胚胎吸收率,進一步證明白術可能在復方中起到重要作用,也為白術用于配伍提供了充足的理論依據。

Th17/Treg細胞之間的平衡對機體維持自身穩態是至關重要的。Th17細胞分泌促炎性因子IL-17A,與多種自身免疫性疾病的發生相關[15];而Treg細胞分泌TGF-β1、IL-10等細胞因子,有抗炎和維持免疫穩態的作用,在妊娠過程中增強母體免疫耐受并防止妊娠母體對胎兒的免疫排斥[16]。有研究表明Th17細胞可以介導炎癥反應,并在功能上對抗Treg細胞[17];以IL-17抗體對自然流產小鼠進行治療,胚胎流失率得到顯著改善[18]。本實驗通過ELISA方法檢測子宮局部IL-17A和TGF-β1的表達可間接反應機體Th17和Treg細胞的水平。其中復發性流產組子宮局部IL-17A含量較高,其余各組相比都表現為顯著增多的現象。白術給藥后,IL-17A含量有所降低,說明白術可能通過影響Th17細胞分泌IL-17A功能或直接影響Th17分化,從而起到對抗流產發生的作用。白術中劑量組降低IL-17A的效果優于其他兩組,表現為更好地促進妊娠效果。

近年來有研究發現,Treg與其他T細胞亞群相比分化更為復雜,在特定環境下可重新分化回Th細胞,并留有Treg細胞的免疫抑制功能特征。所以在FOXP3+Treg細胞中除起到本身控制免疫排斥的作用外,還可能存在Th1樣、Th2樣,甚至是與之功能相反的Th17樣的調節性T細胞[19],提示我們應從更廣更深的角度研究不同種Treg對于母胎免疫的影響。Treg細胞群對于成功懷孕的重要性已經在人類和動物模型中得到證實[20-21],且在RSA患者體內較Th17細胞變化更為顯著,提示其對妊娠結局的影響更為重大。Treg細胞除了可以抑制炎癥,防止母體對胎兒過度免疫外,還被證明在妊娠期間有助于調節母體血管功能,支持正常胎兒和胎盤發育[22]。本實驗中,正常妊娠組TGF-β1表達含量遠高于復發性流產組小鼠,白術給藥后均比模型組有所上升,趨于正常妊娠組正常含量。三組劑量雖有不同,所得TGF-β1含量差異卻無統計學意義。由此說明,白術可調控TGF-β1值由流產象趨于正常妊娠狀態進行變化,在局部發揮促進免疫的作用。但由于TGF-β1來源及功能復雜,應進一步結合更特異性的檢測方法來判定妊娠免疫時Treg的情況。

除此之外,本實驗結合免疫熒光雙染法,通過各細胞特征性表達的核轉錄因子RORγt、FOXP3來確定Th17和Treg細胞在母胎界面局部具體的分布情況。其中以RORγt平均光密度代表CD4+RORγt+Th17細胞的相對含量,FOXP3平均光密度代表CD4+FOXP3+Treg細胞的相對含量[23]。復發性流產組內RORγt熒光強度顯著高于其他各組,FOXP3的熒光強度低于其他各組,尤其與正常妊娠組形成鮮明對比。白術各給藥組RORγt熒光強度的情況與ELISA法分析IL-17A含量的情況一致,且兩種方法對Th17的相對檢測具有一致性,提示可用兩種檢測方法同時對RSA患者Th17水平進行檢測,從而對疾病起到一定診斷作用;而對Treg而言建議進一步做詳盡的分型檢查,以確定Treg的分化與分泌情況。

綜上所述,根據本研究的統計結果可知:對復發性流產小鼠模型進行不同濃度的白術干預后,其流產率和胚胎吸收率顯著降低,這充分說明白術能夠有效改善和預防復發性流產行為發生。白術在抑制Th17的同時,又能夠刺激Treg的表達水平,使得耐受型免疫反應在母胎界面中占據優勢,起到良好的固胎效果。