CD36對肥厚型心肌病小鼠內皮細胞增殖的影響及其機制探討

田宏偉 馬麗娜 王曉紅 謝洋 楊茜 吳燕 馬小虎 魏述軍 席少靜 喬樹賓 葛利軍

目的：探討CD36對肥厚型心肌?。℉CM） 小鼠內皮細胞增殖的影響及其機制。

方法：采用3只心肌肌鈣蛋白T（cTNT）R92Q轉基因小鼠作為實驗對象（cTNTR92Q組）。3只野生型C57BL/6小鼠作為對照組。檢測cTNTR92Q組小鼠心肌組織CD36表達，并以cTNTR92Q轉基因小鼠主動脈內皮細胞和人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）為載體調控CD36表達，探討CD36對HCM小鼠內皮細胞增殖的影響及其機制。

結果：cTNTR92Q組小鼠心肌組織中CD36 mRNA和蛋白表達水平均高于對照組，微血管密度低于對照組（P均<0.05）。cTNTR92Q組小鼠主動脈內皮細胞CD36 和p21蛋白表達水平均高于對照組（P均<0.05）；增殖細胞核抗原（PCNA）、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）蛋白表達水平均低于對照組，主動脈內皮細胞增殖低于對照組（P均<0.05）。SiRNA-CD36抑制CD36后，PCNA、cyclin D1蛋白表達水平均升高，HUVEC增殖顯著增加（P均<0.05）。進一步研究發現，CD36 增加p38Thr180/Tyr182 和c-Jun氨基末端激酶（JNK）Thr183/Tyr185 磷酸化水平，激活p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/JNK信號通路并抑制HUVEC增殖，p38 MAPK特異性抑制劑SB239063和JNK特異性抑制劑SP600125能夠逆轉上述作用（P均<0.05）。

結論：CD36通過激活p38 MAPK/JNK信號通路抑制HUVEC增殖，下調CD36表達能夠促進內皮細胞增殖。

肥厚型心肌病（HCM）是最常見的遺傳性心肌病之一，成人患病率約為0.2%，主要表現為非對稱性室壁肥厚和流出道梗阻，是年輕患者心原性猝死的常見原因[1-2]。冠狀動脈正常的HCM患者也會出現胸痛、呼吸困難和心律失常等可能與心肌缺血相關的癥狀[3]。通過正電子發射斷層掃描（PET）發現，HCM心內膜灌注下降、冠狀動脈血流儲備減少[4-5]；病理檢測發現，HCM的心肌微小動脈平滑肌細胞增生，管腔顯著狹窄[6]；另有研究發現，HCM心肌微血管密度顯著下降，心肌纖維化顯著增加，并且微血管密度與心肌纖維化程度呈負相關[7-8]。以上研究均提示，HCM心肌處于低灌注缺血狀態，而心肌缺血是HCM發展為心力衰竭的危險因素，也是惡性心律失常和死亡風險增加的重要原因[9-10]。CD36是一種跨膜蛋白，屬于B類清道夫受體，可與膜表面的其他跨膜蛋白結合共同介導配體結合和信號轉導[11]，CD36廣泛表達于心肌微血管內皮細胞表面，對調節內皮細胞功能起關鍵作用[12]。 腫瘤微血管內皮中CD36與血小板反應蛋白-1（TSP-1）結合，介導腫瘤血管內皮細胞凋亡[13]。目前尚不清楚CD36是否影響內皮細胞增殖。在HCM中，調控CD36表達水平能否影響心肌微血管增生、改善心肌缺血也鮮有研究。本研究以心肌肌鈣蛋白T（cTNT）R92Q轉基因小鼠為研究對象，該轉基因小鼠具有室壁肥厚、心腔縮小、心肌細胞肥厚、排列紊亂、心肌纖維化、心肌舒張功能減退等特點，是研究HCM的理想動物模型[14]。本研究擬在動物組織、細胞及分子學層面探討CD36對HCM內皮細胞增殖的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物與分組：2021年10月至2022年10月，本研究采用3只cTNTR92Q轉基因小鼠作為實驗對象，為cTNTR92Q組。該小鼠由中國科學院實驗動物研究所衛生健康委員會人類疾病醫學重點實驗室研究培育（已有商品出售），該轉基因小鼠是研究HCM的理想動物模型。3只野生型C57BL/6小鼠購買于上海維通利華實驗動物有限公司，作為對照組。調控人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）CD36基因表達時，將HUVEC分為CD36過表達組、過表達陰性對照組、小干擾RNA（siRNA）陰性對照組（si-NC組）、siRNA靶向沉默CD36基因組（si-CD36組）和未轉染組；在研究CD36抑制HUVEC增殖的信號通路時，將HUVEC分為CD36過表達組、CD36過表達+ p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）特異性抑制劑（SB239063）組、CD36過表達 + c-Jun氨基末端激酶（JNK）特異性抑制劑（SP600125）組和未轉染組。本研究通過寧夏回族自治區人民醫院倫理委員會審批（批號：2020-KY-104）。

試劑和抗體：CD105（貨號：DF7431，Affinity公司，美國）；辣根過氧化酶（HRP）標記山羊抗兔IgG（貨號：#31460，ThermoFisher公司，美國）；CD36抗體，（貨號：sc-7309，Santa cruz公司，美國）；細胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗體（貨號：WL01435a，萬類生物公司，沈陽）；增殖細胞核抗原（PCNA）抗體，（貨號：WL03213，萬類生物公司，沈陽）；P21抗體（貨號：AF6290，Affinity公司，美國）；磷酸化-p38（p-p38）抗體（貨號：WLP1576，萬類生物公司，沈陽）；p38抗體（貨號：WL00764，萬類生物公司，沈陽）；磷酸化-JNK（p-JNK）抗體（貨號：WL01813，萬類生物公司，沈陽）；JNK抗體（貨號：WL01295，萬類生物公司，沈陽）。

儀器：電泳儀（型號：DYY-7C，北京六一公司，中國）；熒光定量PCR儀（型號：Exicycler 96，BIONEER公司，韓國）；流式細胞儀（型號：NovoCyte，Aceabio公司，美國）；酶標儀（型號：ELX-800，BIOTEK公司，美國）；顯微鏡（型號：BX53，OLYMPUS公司，日本）；顯微鏡拍照系統（型號：DP73，OLYMPUS公司，日本）。

1.2 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

收集各組心肌組織及內皮細胞（實驗用HUVEC）來源于寧夏回族自治區人民醫院中心實驗室液氮罐凍存），使用TRIzol試劑從細胞和組織中提取總RNA，使用反轉錄試劑盒對RNA進行反轉錄，合成cDNA。以β-肌動蛋白（β-actin）為內參，并以cDNA為模板，qRT-PCR檢測，反應條件設為：95℃ 3 min，隨后 95℃ 30 s、退火 58℃ 30 s、延伸 72℃ 20 s，循環 40 次。獲取 Ct 值，采用 2-ΔΔCt法計算各組細胞中mRNA 的相對表達量[15]。用于qRT-PCR的引物序列見表1。

1.3 蛋白免疫印跡（Western Blot）法分析

每孔加入500 μl含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的細胞裂解液。用BCA蛋白試劑盒定量總蛋白濃度后，加入相同濃度的二硫蘇糖醇緩沖液，煮沸5 min。十二烷基硫酸鈉（SDS） -聚丙烯酰胺凝膠電泳測定相同蛋白濃度的樣品。然后將完整的凝膠電印跡到Immobilon-P膜上。膜在含5%牛血清白蛋白（BSA）的含吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液（PBST）中孵育2 h，然后在含1% BSA的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中與一抗孵育過夜。最后，用二抗（1:3000）在含1% BSA的PBS中孵育30 min后，用化學發光法檢測增強的綠色熒光蛋白條帶。用Western Blot法對處理后的細胞進行相似的評價。

1.4 基因沉默

將復蘇后的HUVEC置于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基中，培養于37℃、5%二氧化碳（CO2）恒溫培養箱。待細胞生長至對數期時，用胰酶消化并制成單細胞懸液，接種于96孔細胞培養板，均設置3個副孔。第3～6代細胞用于正式實驗，將5 μl Lipofectamine RNAiMAX試劑 （賽默飛世爾公司，美國）與500 μl Opti-MEM減血清培養基 （賽默飛世爾公司, 美國）混合，并與25 pmol siRNA （吉瑪基因公司, 中國）結合轉染至細胞中，轉染后6 h更換為完全培養基繼續培養48 h，收集細胞用于Western Blot法分析。

1.5 免疫組織化學（IHC）染色

心肌組織切片在PBS中清洗，在預冷的丙酮中固定15 min，清洗3次。然后將組織在0.5%Tritonx-100中滲透10 min并清洗。用3% H2O2滅活內源性過氧化物酶，然后用山羊血清阻斷。細胞在4℃下與一抗孵育過夜，PBS清洗后用二抗孵育45 min，使用二氨基聯苯胺試劑盒進行細胞化學反應，用蘇木素反染色。

1.6 溴脫氧尿苷（BrdU）染色

在無菌條件下，向每個樣本中加入10 μmol/L BrdU，經過培養后收集細胞懸浮，加入2 ml染色緩沖液，室溫300～400 ×g離心5 min，棄上清；向每1 ml的細胞中加入1 μl 可固定的死活細胞鑒定染料，在4℃下避光孵育30 min，用染色緩沖液清洗細胞2次，將細胞重懸后加入熒光一抗，在4℃下避光孵育30 min，染色緩沖液洗滌細胞后加入1 ml新鮮BrdU 染色緩沖液，在室溫下避光孵育15 min，用染色緩沖液清洗細胞后向每個樣本中加入 100 μl 脫氧核糖核酸酶 I（DNase I）工作溶液，在37℃下避光孵育1 h，染色緩沖液清洗細胞后，加入 5 μl抗BrdU熒光抗體，混勻，在室溫下避光孵育30 min后進行流式細胞儀檢測。

1.7 統計學方法

采用SPSS 21.0統計軟件分析數據。計量資料以均數 ±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，并采用LSD-t方法進行多組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠心肌組織微血管密度比較（圖1）

用CD105標記微血管采用IHC染色結果顯示，cTNTR92Q組小鼠心肌組織中微血管密度較對照組小鼠明顯下降；馬松染色（Masson染色）顯示，cTNTR92Q組小鼠心肌組織纖維化程度明顯高于對照組小鼠。

2.2 兩組小鼠心肌組織CD36 mRNA和CD36蛋白表達水平比較（圖2）

圖2 兩組小鼠心肌組織CD36 mRNA和CD36蛋白表達水平比較（x±s, n=3）

qRT-PCR和Western Blot法檢測發現，cTNTR92Q組小鼠心肌組織CD36 mRNA和CD36蛋白表達水平均明顯高于對照組（P均<0.05）。

2.3 兩組小鼠主動脈內皮細胞CD36、PCNA、cyclin D1、p21表達水平和主動脈內皮細胞增殖情況比較（圖3）

圖3 兩組小鼠主動脈內皮細胞CD36、PCNA、cyclin D1、p21表達水平和主動脈內皮細胞增殖情況的比較（x±s, n=3）

BrdU染色和Western Blot法分析表明，cTNTR92Q組小鼠內皮細胞增殖減少，cTNTR92Q組小鼠內皮細胞CD36 mRNA和CD36蛋白表達水平均高于對照組（P均<0.05），PCNA、cyclin D1蛋白表達水平均低于對照組（P均<0.05），p21蛋白表達水平高于對照組（P<0.05）。

2.4 調控HUVEC CD36基因后，CD36、PCNA、cyclin D1和p21表達水平和HUVEC增殖情況（圖4）

圖4 調控HUVEC CD36基因后，CD36、PCNA、cyclin D1和p21表達水平和HUVEC增殖情況比較（x±s, n=3）

HUVEC增殖增加。將CD36靶向siRNA（siRNA-CD36）轉染至HUVEC降低CD36 mRNA和CD36蛋白表達水平，Western Blot法分析發現，下調CD36表達后，cyclin D1和PCNA蛋白表達水平升高，p21蛋白表達水平降低。

2.5 HUVEC過表達CD36后，p-p38Thr180/Tyr182、p-JNKThr183/Tyr185、p38、JNK表達水平和HUVEC增殖情況的比較（圖5）

圖5 HUVEC過表達CD36后，p-p38Thr180/Tyr182、p38、p-JNKThr183/Tyr185、JNK表達水平和HUVEC增殖情況的比較（x±s, n=3）

HUVEC轉染CD36基因上調CD36表達后結果發現，與未轉染組比較，CD 36過表達組的p-p38Thr180/Tyr182、p-JNKThr183/Tyr185蛋白表達水平增加，HUVEC增殖降低（P均<0.05），而p38與JNK蛋白表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。與CD36過表達組比較，CD36過表達組+ SB239063組、CD36過表達組 + SP600125組的p-p38Thr180/Tyr182、p-JNKThr183/Tyr185蛋白表達水平均降低，HUVEC增殖升高（P均<0.05）。

3 討論

有研究表明，即使冠狀動脈正常的HCM也會出現心肌灌注下降、冠狀動脈血流儲備減少等心肌缺血現象[4-5]，而心肌缺血是HCM進展為心力衰竭、發生惡性心律失常和心原性猝死的危險因素[9-10]。CD36廣泛表達于心肌微血管內皮細胞表面，在調節內皮細胞功能和增殖方面起關鍵作用。本研究發現，CD36 增加p38Thr180/Tyr182和JNKThr183/Tyr185磷酸化水平，激活p38 MAPK/JNK信號通路并抑制HUVEC增殖，下調CD36表達促進內皮細胞增殖可能是治療HCM心肌缺血的潛在靶點。

本研究發現，cTNTR92Q轉基因小鼠心肌微血管密度顯著降低，心肌纖維化程度加重，這一結果與人HCM關于心肌微血管密度和心肌纖維化的研究結論一致[7]。研究還發現，cTNTR92Q轉基因小鼠心肌中CD36 mRNA和CD36蛋白的表達水平均明顯高于對照組，提示CD36表達水平可能與HCM血管生成有關。p21蛋白是一種細胞周期蛋白（cyclin）依賴性激酶抑制蛋白（CDKI），具有多種生物學功能。p21可降解cyclin、抑制細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）活性，與PCNA結合抑制細胞復制[16]。PCNA存在于細胞核中，是DNA聚合酶δ的輔助蛋白，其濃度在細胞復制周期中發生周期性變化，可作為細胞增殖狀態的指標[17]。Cyclin D1通過結合并激活CDK4促進細胞增殖[18]。本研究發現，cTNTR92Q轉基因小鼠主動脈內皮細胞p21蛋白表達水平高于對照組，PCNA和cyclin D1蛋白表達水平低于對照組，BrdU染色和流式細胞術顯示，cTNTR92Q轉基因小鼠內皮細胞增殖較對照組降低。上述結果表明，cTNTR92Q轉基因小鼠心肌和主動脈血管內皮細胞中高表達的CD36可能影響HCM血管生成。為了研究CD36對內皮細胞增殖的影響，我們對HUVEC轉染siRNA-CD36或CD36基因調節CD36的表達。研究發現，siRNA-CD36下調CD36表達后HUVEC p21蛋白水平降低，cyclin D1和PCNA蛋白水平升高，HUVEC增殖增加，對HUVEC轉染CD36過表達CD36后得到相反的結果。這些研究表明，CD36能夠抑制內皮細胞增殖。用siRNA-CD36下調CD36后，內皮細胞增殖顯著增加。Osz等[19]研究發現，CD36基因敲除小鼠血管生成增加；Ramakrishnan等[20]研究發現，細胞外囊泡激活CD36能夠抑制內皮細胞的遷移和血管管腔的形成，以上研究均與本研究結果類似。過表達CD36 抑制 HUVEC增殖的機制可能是多因素的，本研究結果發現，增加HUVEC CD36表達后，p-p38Thr180/Tyr182和p-JNKThr183/Tyr185蛋白表達增加，HUVEC增殖降低，p38 MAPK特異性抑制劑SB239063和JNK特異性抑制劑SP600125能夠逆轉上述作用，說明CD36通過增加p38Thr180/Tyr182和JNKThr183/Tyr185磷酸化水平激活p38MAPK/JNK信號通路抑制HUVEC增殖，這一結論與CD36介導MAPK信號通路抑制腫瘤血管增生機制類似[21]。

本研究的局限性在于以HUVEC作為載體調控CD36基因表達對內皮細胞增殖的影響，未使用HCM血管內皮細胞作為載體，可能會影響實驗結果。本研究發現，過表達CD36可以顯著抑制內皮細胞的增殖，不能排除肥厚心肌細胞擠壓機械力對內皮細胞增殖的影響。此外，本研究并未進一步探討CD36是否對心肌細胞肥大有影響，后期研究可對此深入研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突