貓皰疹病毒I型核酸快速檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

段雪昆

（廈門寶太生物科技股份有限公司，福建 廈門 361000）

FHV-1有多種診斷方法。病毒分離培養(yǎng)可以應(yīng)用于診斷急性FHV-1感染。然而，對(duì)于潛伏期FHV-1，它經(jīng)常產(chǎn)生假陰性結(jié)果。由于90%以上的貓血清FHV-1抗體呈陽性，在臨床上難以區(qū)分正常貓和患病的貓，故抗體檢測(cè)很難用于FHV-1感染的輔助診斷。免疫層析法是目前唯一一種可快速檢測(cè)FHV-1的方法，但由于其靈敏度受限，該法只能用于貓發(fā)病后機(jī)體排毒期間。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)仍然是判斷FHV-1感染的金標(biāo)準(zhǔn)，其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR比傳統(tǒng)PCR靈敏度更高。但該方法檢測(cè)流程復(fù)雜，耗時(shí)較長，且需要大型設(shè)備及相對(duì)專業(yè)的檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，對(duì)檢測(cè)人員也有一定要求，不適用于伴隨診斷。因此，從應(yīng)用場(chǎng)景著手，需要開發(fā)一種靈敏度高，操作簡(jiǎn)單且能夠迅速得到檢測(cè)結(jié)果的FHV-1檢測(cè)方法。

eRDA（enhanced Recombinase Dependent Amplification，增強(qiáng)型重組酶依賴擴(kuò)增）是一種恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。該方法只需要一個(gè)簡(jiǎn)單的加熱器甚至在體溫下（37 ℃）即可發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。eRDA過程依賴于三個(gè)關(guān)鍵蛋白：重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）和鏈置換聚合酶。與PCR一樣，eRDA擴(kuò)增的靈敏度和特異性較高。因此，eRDA方法已經(jīng)具有檢測(cè)各種病原體的潛力，特別適用于設(shè)備不足的實(shí)驗(yàn)室或快速現(xiàn)場(chǎng)診斷等場(chǎng)景。基于eRDA原理，文章建立了一種FHV-1核酸快速檢測(cè)方法，該法靈敏度高、特異性好，臨床實(shí)用性強(qiáng)，搭配小型恒溫?cái)U(kuò)增儀，可在20 min內(nèi)完成檢測(cè)并出具檢測(cè)報(bào)告。該方法可用于寵物醫(yī)院FHV-1的快速診斷，為有效預(yù)防和控制貓皰疹病毒感染提供了新的方向。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑及設(shè)備

文章中使用的含貓皰疹病毒靶基因的重組質(zhì)粒由通用生物(安徽)股份有限公司合成。

貓皰疹病毒、貓杯狀病毒、貓細(xì)小病毒及貓傳染性腹膜炎（貓冠狀病毒）樣本核酸來源于廈門市2家寵物醫(yī)院。

eRDA基礎(chǔ)體系和熒光定量PCR反應(yīng)體系為本實(shí)驗(yàn)室前期研究確定。

熒光定量PCR儀 (ABI QuantStudio3)

微量分光光度計(jì) (Thermo Scientific， NanoDrop One)

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成

下載GenBank中的FHV-1 TK基因片段進(jìn)行多序列比對(duì)，利用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)FHV-1 qPCR引物探針。根據(jù)eRDA引物設(shè)計(jì)規(guī)則，在同樣靶基因上設(shè)計(jì)了兩組FHV-1 eRDA引物探針進(jìn)行篩選優(yōu)化。

要準(zhǔn)確把握容錯(cuò)的限度，不能跨過容忍的必要界限，過度地容錯(cuò)就會(huì)變成縱錯(cuò)。如果容錯(cuò)免責(zé)的門檻設(shè)定太過抽象和寬松，容錯(cuò)機(jī)制很可能變成一個(gè)盾牌，成為某些有過錯(cuò)官員為自己工作過錯(cuò)提供免責(zé)的“擋箭牌”。我們認(rèn)為重點(diǎn)從以下幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行細(xì)化：

文章所用的引物序列如表1所示。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 文章所用引物

1.3 引物篩選

根據(jù)引物位置和擴(kuò)增產(chǎn)物大小，按照下表組合分別測(cè)試不同引物對(duì)的反應(yīng)情況，使用熒光定量PCR儀 (ABI QuantStudio3)進(jìn)行測(cè)試，反應(yīng)條件為40 ℃，30 min，以篩選出最優(yōu)組合，詳見表2。

表2 引物探針篩選組合

1.4 靈敏度及重復(fù)性測(cè)試

以上述優(yōu)化后的反應(yīng)條件測(cè)試不同濃度（106～100copies/μL）重組質(zhì)粒的擴(kuò)增情況，計(jì)算不同濃度各重復(fù)間的變異系數(shù)（cv%）。同時(shí)比較熒光定量PCR法的檢測(cè)靈敏度和重復(fù)性。熒光定量PCR反應(yīng)為25μL體系，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；（95 ℃ 15 sec，60 ℃ 30 sec）40 cycle。

1.5 特異性測(cè)試

將貓皰疹病毒、貓杯狀病毒、貓細(xì)小病毒及貓傳染性腹膜炎（貓冠狀病毒）臨床樣本核酸作為模板加入FHV1 eRDA反應(yīng)體系，以相同反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 臨床樣本測(cè)試

對(duì)采集到的20份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，并和qPCR法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算得到陰陽性符合率和總符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

在反應(yīng)條件為40℃，30 min下，依據(jù)表2組合篩選，最終篩出最優(yōu)的引物探針組合（圖1），F(xiàn)HV-eRDAF1、 FHV-eRDAR2、FHV-eRDAP1熒光強(qiáng)度及熒光曲線線型優(yōu)于其他組合，且重復(fù)性較佳，反應(yīng)5 min，可檢測(cè)到起峰。

圖1 eRDA-FHV1反應(yīng)體系引物篩選結(jié)果

2.2 靈敏度及重復(fù)性測(cè)試

2.2.1 靈敏度

以優(yōu)化后的反應(yīng)條件測(cè)試不同濃度（106～100 copies/μL）重組質(zhì)粒的擴(kuò)增情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2a所示，文章建立的eRDA反應(yīng)體系最低檢測(cè)限為10copies/反應(yīng)。相對(duì)比熒光定量PCR來說(圖2b），eRDA檢測(cè)法具有同等的檢測(cè)水平，但時(shí)間較PCR大大縮短。配合恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀使用，還可大大降低大型qPCR設(shè)備的成本。

圖2 eRDA-FHV1反應(yīng)體系靈敏度測(cè)試結(jié)果

2.2.2 重復(fù)性測(cè)試

以建立的eRDA反應(yīng)體系測(cè)試不同濃度各重復(fù)間的效能情況，計(jì)算不同濃度各重復(fù)間的變異系數(shù)。表3結(jié)果表明，eRDA反應(yīng)體系在相同濃度的重組質(zhì)粒模板測(cè)試結(jié)果（n=10），cv值均小于5%，重復(fù)性良好。熒光定量熒光定量PCR法重復(fù)性cv值也均小于5%，且重復(fù)性良好。

表3 eRDA-FHV1反應(yīng)體系重復(fù)性測(cè)試結(jié)果

2.3 特異性測(cè)試

將貓皰疹病毒、貓杯狀病毒、貓細(xì)小病毒及貓傳染性腹膜炎（貓冠狀病毒）臨床樣本核酸作為模板加入FHV eRDA反應(yīng)體系，以相同反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明（圖3），只有FHV模板有熒光擴(kuò)增曲線，其他病原體核酸及空白水對(duì)照均未無熒光擴(kuò)增曲線。表明文章建立的eRDA檢測(cè)方法可對(duì)FHV進(jìn)行特異性檢測(cè)，而對(duì)貓杯狀病毒、貓細(xì)小病毒及貓傳染性腹膜炎（貓冠狀病毒）均無交叉反應(yīng)，特異性較佳。

圖3 eRDA-FHV1反應(yīng)體系特異性測(cè)試結(jié)果

2.4 臨床樣本測(cè)試

對(duì)采集到的20份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，并和qPCR法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。表4結(jié)果顯示，熒光定量PCR方法可檢驗(yàn)出8份陽性樣本，12份陰性樣本。而文章建立的方法也檢測(cè)出8份陽性樣本，12份陰性樣本。陽性符合率、陰性符合率及總體符合率均為100%，效能較佳。

表4 臨床樣本測(cè)試結(jié)果

3 結(jié)語

貓皰疹病毒在結(jié)構(gòu)和致病性上與人類單純皰疹病毒相似，都屬于皰疹病毒科和α皰疹病毒亞科，其特征是在初次感染后出現(xiàn)潛伏期。這一因素在臨床上很重要，因?yàn)榧词箾]有重復(fù)接觸病毒，疾病可能會(huì)在以后的生活中復(fù)發(fā)。貓皰疹病毒感染又稱貓病毒性鼻氣管炎(FVR)，是一種由貓皰疹病毒1型(FHV-1)引起的傳染病，結(jié)膜炎和角膜潰瘍是貓皰疹病毒1型復(fù)發(fā)及其常見的形式。

Exo熒光探針通常由一個(gè)寡核苷酸主鏈組成，其中包含一個(gè)堿性核苷酸類似物（THF，四氫呋喃殘基），兩側(cè)分別有一個(gè)FAM基團(tuán)和BHQ1猝滅基團(tuán)。此外，探針3’修飾一個(gè)Block可阻止聚合酶的延伸。初始狀態(tài)下熒光基團(tuán)產(chǎn)生的熒光信號(hào)會(huì)被猝滅基團(tuán)猝滅。當(dāng)探針結(jié)合到相應(yīng)模板上時(shí)，核酸外切酶III（exo酶）將切割探針THF位置，分離熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。因此，檢測(cè)Exo熒光探針信號(hào)可用于判斷核酸擴(kuò)增情況。

文章建立了貓皰疹病毒I型(FHV-1)核酸快速恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)法。結(jié)果顯示，該方法特異性強(qiáng)，能準(zhǔn)確檢測(cè) FHV-1核酸，與貓杯狀病毒、貓細(xì)小病毒及貓傳染性腹膜炎（貓冠狀病毒）病毒核酸無交叉反應(yīng)；靈敏度高，最低可檢測(cè)10 copies/反應(yīng)；檢測(cè)速度快，可在30 min內(nèi)完成反應(yīng)，對(duì)于病毒載量較高的樣本，2～5 min即可得出結(jié)果；重復(fù)性好，各重復(fù)間cv%小于5%。后期可在文章基礎(chǔ)上開發(fā)凍干型eRDAFHV1反應(yīng)試劑，簡(jiǎn)化操作步驟且延長試劑保存期限，尤其適合寵物醫(yī)院的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。